王申儀 陽軍

(湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 長沙 410005)

盡管在過去幾十年中，動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)的死亡率和發(fā)病率已顯著降低，但ASCVD仍是全球范圍內(nèi)主要的死亡原因[1]。中國ASCVD患病率現(xiàn)處于持續(xù)上升階段[2]，而低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)升高是動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展最重要的危險因素[3]，他汀類藥物作為降低LDL-C的國際一線治療藥物，具有充分的證據(jù)證明其療效和安全性[4]。然而，反調(diào)節(jié)效應(yīng)限制了他汀類藥物降低低密度脂蛋白(LDL)的能力，他汀類藥物在降低LDL-C的同時也刺激前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)的產(chǎn)生，后者限制了LDL-C的降低效果，即他汀類藥物劑量加倍療效并不成倍增加，僅獲得6%的增加。不僅如此，部分患者即使接受最大可耐受劑量的他汀類藥物治療仍存在相當(dāng)大的血脂殘余風(fēng)險。孟德爾隨機(jī)化研究證實，血脂殘余風(fēng)險的主要原因在于脂蛋白代謝異常和脂蛋白a [Lp(a)]水平升高[5]。新型降脂藥物PCSK9單克隆抗體降低51%的LDL-C水平，同時殘余風(fēng)險降低15%[6-7]，然而這種方法需使用大量的抗體才能實現(xiàn)藥效學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生了安全問題，限制其廣泛應(yīng)用[8]。mRNA的藥理靶向是一種新興的降脂療法。目前已發(fā)展出兩大類——反義寡核苷酸(ASO)和小干擾RNA(siRNA)，在RNA產(chǎn)物(ASO或siRNA)中加入N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，促進(jìn)了高效的肝臟特異性藥物攝取，使用劑量明顯降低，從而減少全身暴露和注射部位的局部反應(yīng)。因此，全身、肝臟和局部副作用的發(fā)生率大大降低，極大地增加了藥效和安全性[9]。如今，以RNA為基礎(chǔ)的治療方法正在大規(guī)模開發(fā)。

1 RNA靶向治療

1.1 去唾液酸糖蛋白受體與GalNAc

Ashwell等[10]于1965年在研究銅藍(lán)蛋白代謝的過程中，偶然發(fā)現(xiàn)去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的存在。ASGPR在肝細(xì)胞上大量表達(dá)，每個細(xì)胞上的受體超過500 000個[11]，GalNAc是半乳糖聚糖的氨基糖衍生物，ASGPR通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用攝取和清除循環(huán)中一類特殊的糖蛋白，這類糖蛋白的末端糖殘基為非還原性的半乳糖和GalNAc。研究表明，在與ASGPR的結(jié)合中，其親和力大小取決于半乳糖殘基數(shù)量、糖之間的幾何間距和糖的類型(GalNAc>Gal)[12-13]。其中分子間距為20 ?的三觸角GalNAc與ASGPR具有最高的親和力。

1.2 RNA靶向治療技術(shù)

從癌癥到流行性病毒大暴發(fā)再到ASCVD，雙鏈siRNA誘導(dǎo)的RNA干擾反應(yīng)在治療各種人類疾病中具有巨大的潛力。與大多數(shù)小分子藥物相比，單鏈ASO和siRNA的體積要大得多，幾十年來，細(xì)胞攝取和釋放藥物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)一直是RNA靶向藥物臨床應(yīng)用的瓶頸。目前的給藥途徑通常是基于納米顆粒的包封或配體的偶聯(lián)，以促進(jìn)特定細(xì)胞的攝取。但由于脂質(zhì)納米顆粒的促炎作用，臨床使用這些藥物時，通常需使用高劑量的皮質(zhì)類固醇、組胺受體拮抗藥和非甾體抗炎藥進(jìn)行預(yù)處理，以避免輸液反應(yīng)[14]。到目前為止，在所有的配體研究中，GalNAc成為在心血管醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最有希望的靶點。

1.3 GalNAc特異性結(jié)合ASO和siRNA

在內(nèi)吞作用下，三觸角GalNAc與ASGPR結(jié)合后進(jìn)入肝細(xì)胞中。核內(nèi)體成熟過程中的酸化階段，GalNAc-siRNA偶聯(lián)物從ASGPR上解離，ASGPR再循環(huán)到細(xì)胞表面。GalNAc在1 h內(nèi)被核內(nèi)體糖苷酶從siRNA上切割下來，4 h內(nèi)連接臂降解[15]。絕大多數(shù)游離siRNA在核內(nèi)體中被捕獲，但仍有極少量(<1%)siRNA能通過未知機(jī)制穿過核內(nèi)體脂質(zhì)雙層膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。siRNA的引導(dǎo)鏈在細(xì)胞質(zhì)中與客鏈分離，隨后組裝RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)。RISC中的引導(dǎo)鏈與互補的靶mRNA結(jié)合，降解靶mRNA[14]，RISC再次循環(huán)，進(jìn)一步降解被同一引導(dǎo)鏈識別的目標(biāo)mRNA。與siRNA相比，ASO通常通過多種機(jī)制以1∶1的比例降解mRNA，其中之一是通過核糖核酸酶(RNase)H1降解互補mRNA(見圖1)。兩種藥物作用途徑都是阻止mRNA被翻譯，同時肝細(xì)胞中siRNA和20-甲氧基硫代磷酸取代的ASO的作用強烈而持久，其消除半衰期為數(shù)周之久。

圖1 GalNAc促進(jìn)ASO和siRNA跨膜運輸注：GalNAc結(jié)合的siRNA和ASO通過ASGPR被肝細(xì)胞特異性攝取。內(nèi)吞攝取后，核內(nèi)體的pH值下降，少量RNA靶向藥物通過未知的機(jī)制被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，藥物與互補的mRNA相互作用。

2 針對ASCVD的RNA治療靶點

ASO和siRNA通過與GalNAc結(jié)合，增強跨膜滲透，將藥物靶向運送至特定組織，從而促進(jìn)藥物的傳遞。ASO通過GalNAc連接可將在肝細(xì)胞的效應(yīng)提高至游離ASO的10倍[15]。不同于ASO，siRNA在細(xì)胞內(nèi)處于失活狀態(tài)。直到反式激活反應(yīng)性RNA結(jié)合蛋白，隨后RNA結(jié)合蛋白將siRNA裝載至Argonaute蛋白2(Ago2)，在Ago2上，引導(dǎo)反義鏈與催化性Ago2特異性結(jié)合。Ago2提供與靶mRNA結(jié)合的初始引導(dǎo)鏈種子區(qū)域[16]，相比于自由ASO，反應(yīng)需要的活化能大大降低[17]。

2.1 降低LDL-C的靶點：PCSK9

PCSK9是LDL-C代謝最重要的調(diào)節(jié)因子之一。它在肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成和修飾，并促進(jìn)細(xì)胞膜低密度脂蛋白受體(LDLR)在溶酶體中降解。此外，PCSK9也抑制細(xì)胞內(nèi)載脂蛋白(Apo)B的降解，ApoB是LDL和極低密度脂蛋白顆粒的組成部分[18]，在致動脈粥樣硬化進(jìn)程中有著重要作用。PCSK9功能缺失性突變可顯著降低LDL-C濃度，有研究顯示攜帶功能缺失性突變的個體LDL-C水平較基線降低28%，冠心病終生風(fēng)險降低88%[19]。針對PCSK9，基于抗體的方法可將LDL-C水平降低45%～60%[20]，近來一種抑制PCSK9合成的RNA靶向治療方法也被開發(fā)出來。

Inclisiran(ALN-PCSSC;ALN-60212)是一種GalNAc修飾的siRNA，不同于抗體的作用機(jī)制，Inclisiran靶向進(jìn)入肝細(xì)胞，與PCSK9的mRNA前體特異性結(jié)合后對其進(jìn)行降解，抑制PCSK9基因的表達(dá)[21]，同時降低細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外PCSK9蛋白水平。在兩項Ⅲ期試驗(ORION-10、ORION-11)中，針對雜合子型家族性高膽固醇血癥及ASCVD患者，在第1天、第90天、第270天和第450天分別注射300 mg Inclisiran。在第510天時，Inclisiran治療組較基線LDL-C水平分別降低52.3%(ORION-10)和49.9%(ORION-11)[22]，同時整體血脂水平也顯著降低。如今心血管結(jié)果試驗(ORION-4)正在進(jìn)行中(NCT03705234)，中國也將參與[23]，預(yù)計于2024年完成。

2.2 降低ApoA的靶點：Lp(a)

Lp(a)是一種由肝臟合成的類似LDL的顆粒，由ApoB100分子與ApoA共價連接組成，具有促動脈粥樣硬化，促血栓形成和促炎作用[24]。Lp(a)的血漿濃度在很大程度上是由遺傳決定的[25]，既無法用生活方式干預(yù)，目前也少有降脂藥物能有效降低Lp(a)水平。降脂治療的基石在于他汀類藥物，而他汀類藥物上調(diào)LDLR降低LDL-C的同時可引起ApoA表達(dá)增加，使Lp(a)水平提高約20%[26]。孟德爾隨機(jī)研究證實ApoA同工型大小和Lp(a)濃度是ASCVD的獨立危險因素[27]，因此采用ASO抑制ApoA mRNA翻譯，從而降低血漿Lp(a)水平，不失為一種可行的方法。第一代ASO是ISIS-APO(a)Rx，在TQJ230的Ⅰ期試驗中顯示，多次給藥后，Lp(a)濃度呈劑量依賴性降低：39.6%(600 mg組)、59%(1 200 mg組)和77.8%(1 800 mg組)。AKCEA-APO(a)-LRx(也稱為TQJ230)是ISIS-APO(a)Rx的修改版本，是一個通過GalNAc共價連接的ASO變體，其效力是ISIS-APO(a)Rx的30倍[28]。在Ⅱ期臨床試驗[29]中再次顯示，AKCEA-APO(a)-LRx呈劑量及頻率依賴性降低Lp(a)，在每周20 mg劑量下，血脂水平明顯改善，Lp(a)降低80%，LDL-C降低20.5%，ApoB降低14.5%。目前，HORIZON Ⅲ期臨床試驗(NCT04023552)納入7 680例ASCVD患者，計劃周期4年，進(jìn)一步明確降低Lp(a)對終點事件的影響。此外，siRNA分子AMG890也進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(NCT04270760)，將共同探討特異性降低Lp(a)是否能對ASCVD患者提供顯著的臨床獲益。

2.3 降低甘油三酯的靶點：ApoCⅢ

ApoCⅢ主要由肝臟分泌，腸道分泌較少，由于其對ApoB脂蛋白分解代謝的抑制作用，被認(rèn)為是甘油三酯(TG)分解代謝的重要負(fù)調(diào)控因子[30]。血清TG低水平為特征的ApoCⅢ功能缺失突變攜帶者的ASCVD風(fēng)險降低40%[31]，在針對年齡和性別調(diào)整后的模型中，血漿中ApoCⅢ每降低1 mg/dL，心血管疾病風(fēng)險降低4%[32]。

第一種專門針對ApoCⅢ mRNA的藥物是Volanesorsen，被批準(zhǔn)用于家族性乳糜微粒血癥綜合征。Volanesorsen是一種20-甲氧基修飾的硫代磷酸ASO，而三觸角GalNAc復(fù)合物結(jié)合的AKCEA-APOCⅢ-LRx(ISIS678354)與Volanesorsen具有相同的核苷酸序列。在健康人志愿者試驗中，AKCEA-APOCⅢ-LRx組患者ApoCⅢ水平降幅為92%，TG水平降幅為77%。Ⅱ期臨床試驗中，TG升高的心血管疾病患者同樣顯示出廣泛的血脂改善，包括顯著降低TG、總膽固醇、非高密度脂蛋白膽固醇和極低密度脂蛋白膽固醇，增加高密度脂蛋白膽固醇，且安全性和安慰劑無明顯差異[9]。目前Ⅲ期心血管試驗還處于進(jìn)一步籌備中。

2.4 降低TG的靶點：血管生成素樣蛋白3

血管生成素樣蛋白(ANGPTL)為脂蛋白代謝的重要調(diào)節(jié)因子，因此已成為調(diào)節(jié)脂質(zhì)水平和心血管疾病風(fēng)險的新靶點。ANGPTL3屬于angptl蛋白家族，由n端盤繞卷曲結(jié)構(gòu)域和纖維蛋白原樣c端結(jié)構(gòu)域組成[33]。ANGPTL3在肝臟合成，通過抑制脂蛋白脂酶從而介導(dǎo)處于脂肪組織和肌肉的毛細(xì)血管中TG的水解。除抑制脂蛋白酶，ANGPTL3還可抑制內(nèi)皮脂肪酶，從而影響血清高密度脂蛋白膽固醇水平[34]。DiscovEHR研究顯示，ANGPTL3功能缺失變異的雜合子患者血漿ANGPTL3水平比非攜帶者低約50%，其冠狀動脈疾病的風(fēng)險降低34%～39%[35]。19項研究(共計21 980例心血管疾病患者和158 200例對照者)的薈萃分析[36]顯示，攜帶ANGPTL3功能缺失性突變的人群比對照組的心血管疾病風(fēng)險低34%。最低濃度ANGPTL3組比最高濃度組心肌梗死風(fēng)險降低29%。目前研發(fā)中的藥物包括ASO(IONIS-ANGPTL3-LRx)及針對ANGPTL3的人單克隆抗體(Evinacumab)，ASO和Evinacumab均可顯著降低血清ANGPTL3和所有主要脂蛋白的血漿濃度。目前抑制ANGPTL3的Ⅱ期臨床試驗正在進(jìn)行中，其中Evinacumab降低TG幅度為76%，降低LDL-C為23%[35]。而接受IONIS-ANGPTL3-LRx治療的受試者表現(xiàn)為主要脂質(zhì)成分水平的降低，其中TG(33.2%～63.1%)、LDL-C(1.3%～32.9%)、極低密度脂蛋白膽固醇(27.9%～60%)、非高密度脂蛋白膽固醇(10%～36.6%)、ApoB(3.4%～25.7%)和ApoCⅢ(18.9%～58.8%)[37]。Ⅱ期臨床研究目前正在進(jìn)行中(NCT03371355)，同時針對ANGPTL3 mRNA的siRNA目前正在健康志愿者和血脂異?；颊咧羞M(jìn)行Ⅰ期試驗(NCT03747224)。未來的Ⅱ和Ⅲ期臨床試驗將獲得更多數(shù)據(jù)，以確定它們的長期療效、安全性和耐受性。

3 未來展望

LDL-C管理仍是ASCVD降脂治療的基礎(chǔ)，血脂管理指南更新，顯示LDL-C靶目標(biāo)值不斷降低，聯(lián)合非他汀類藥物的降脂療法已成為ASCVD的治療趨勢。相對于抗體類藥物而言，RNA靶向藥物的主要優(yōu)勢在于精準(zhǔn)靶向編碼區(qū)域的蛋白質(zhì)，這為降脂治療提供了新的解決思路。目前，GalNAc聯(lián)合RNA靶向治療[如Apo(a)-ASO和PCSK9-siRNA]的心血管預(yù)后試驗正在進(jìn)行中。毫無疑問，由于RNA療法的高度靶向特異性，這些試驗的結(jié)果將極大地促進(jìn)對脂蛋白顆粒在ASCVD中病理生理作用的理解，最大程度降低ASCVD的殘余風(fēng)險。在不久的將來RNA療法極有可能成為一種新的、安全、有效的ASCVD治療選擇。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。