范 惠 玲 白 生 文 侯 麗 娟

（1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生態(tài)工程學(xué)院；2.河西學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 張掖 734000）

高豐度、高純度DNA 分離提取往往是對農(nóng)業(yè)上許多重要性狀進(jìn)行遺傳分析的限制因素.干燥種子由于DNA 與組蛋白等緊密結(jié)合，導(dǎo)致提取高質(zhì)量、高豐度DNA 具有一定的難度.從含有大量蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)的干種子中，分離出高質(zhì)量DNA 的難度則更大［1］.DNA樣中混雜的酚類、色素、多糖和蛋白質(zhì)等還會(huì)干擾一些生物酶的活性，如DNA 聚合酶、連接酶和限制性核酸內(nèi)切酶等，進(jìn)而干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行［2］.解決這類問題的關(guān)鍵則是在DNA提取過程中有效去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等雜質(zhì).基于這一問題的出現(xiàn)，目前關(guān)于從種子中提取DNA的大量實(shí)驗(yàn)方法見諸報(bào)端，如Chunwongse等［3］發(fā)明了從水稻和小麥中用半粒種子提取DNA的方法；Mcdonald 等［4］和Kang等［5］發(fā)明了從棉花、花生、大豆等作物種子中提取DNA的方法；國內(nèi)也有很多學(xué)者相繼發(fā)明了一些從種子中提取DNA的方法［6-13］.盡管這些方法在不同的植物種子上都取得了較好的提取效果，但對于油菜及其近緣植物干種子DNA的提取存在或多或少的不足.至今，關(guān)于油菜及其近緣植物干種子DNA提取的文獻(xiàn)報(bào)道較少.謝景梅等［14］以黑籽和黃籽甘藍(lán)型油菜為材料，用改良的CTAB 法提取了基因組DNA，DNA 樣品液A260/A280的值介于1.47～1.66 之間，低于1.8，表明DNA樣品的純度并不理想.丹巴等［15］用SDS法和CTAB法提取了西藏黃籽油菜干種子的DNA，所提DNA樣品液適用于SSR分析，但只用了甘藍(lán)型油菜，未涉及其它兩種類型油菜乃至油菜近緣植物.沙愛華等［16］分別以油菜、水稻、玉米和棉花的干種子為試材，建立了一種DNA提取的簡便方法，結(jié)果分離到了一定量的DNA且可用于RAPD和SSR分析，但DNA樣品的純度較低.

鑒于此，針對油菜、蕓芥和白芥籽粒中貯藏較多的脂肪、蛋白質(zhì)、糖類和次生代謝物等的特點(diǎn)，我們結(jié)合已報(bào)道的從植物干燥材料中分離基因組DNA的不同方法，試圖探索一種從干種子中分離DNA的有效方法，同時(shí)用油菜總DNA的純化提取法作為對照［17］，以期建立一種能夠適用于油菜及其近緣植物干種子的高質(zhì)量DNA提取方法，為快速高效地對科研和商場上雜交種純度的鑒定、種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析等工作奠定分子基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

油菜的三大栽培類型：隴油2 號(hào)系甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）、天油5 號(hào)系白菜型油菜（Brassica campestris L.）、靖油1號(hào)系芥菜型油菜（Brassica juncea L.），油菜的兩種近緣植物：武威毛角系白芥（Sina?pis alba L.）、和田蕓芥系蕓芥（Eruca sativa M.），均由甘肅省張掖市河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)教研室提供.

1.2 主要試劑與儀器

50mmol/LEDTA、氯仿-異戊醇、3mol/LNaCl 溶液、TE 緩沖液（pH=8）、3%CTAB、1%Gold View Ⅰ型核酸染色劑、ddH2O、10×buffer（含20mmol/L Mg2+）、Taq DNA聚合酶、1×TAE電泳緩沖液以及隨機(jī)引物.其中隨機(jī)引物由上海生物工程有限公司合成，其名稱和序列詳見表1.PCR擴(kuò)增所用試劑由北京鼎國生物技術(shù)有限公司提供，其它試劑均為分析純.

表1 PCR擴(kuò)增所用的引物名稱和序列Table 1 Name and sequence of primers used for amplification

My cyclerTM 熱循環(huán)儀、Nanaphotometer 微量核酸蛋白分析儀、離心機(jī)、電泳儀.

1.3 干種子基因組DNA提取

將干種子0.5g 置于研缽中，用研棒壓破，加幾顆石英砂后研磨成顆粒，加入700μL 提取液（3%CTAB，1%二硫蘇糖醇，2%PEG，50mmol/L EDTA），再次研磨成勻漿；勻漿轉(zhuǎn)入離心管中，并置于65℃水浴中保溫15分鐘，其間每間隔5分鐘輕輕搖動(dòng)離心管1次，以充分裂解；離心管置冰浴冷卻后，加入500μL氯仿-異戊醇，混勻后，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，得到上清液（A）；在300μL上清液A中加入100μL 3mol/L的NaCl溶液，搖勻后加入600μL預(yù)冷無水乙醇，冰浴靜置10分鐘；低溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，得到沉淀物（A）；在沉淀物A中加入300μL 1mol/L 的NaCl 溶液，待沉淀物溶解后再加入300μL氯仿-異戊醇，輕輕混勻，低溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，得到上清液（B）；在300μL上清液B 中依次加入30μL 1 mol/L 的NaCl 溶液和600μL 預(yù)冷無水乙醇，冰浴靜置10 分鐘，在4℃的條件下12000 轉(zhuǎn)/分鐘的離心10 分鐘，得到沉淀物（B）；向沉淀物B 中加入75%的乙醇300μL，洗滌沉淀2 次，自然風(fēng)干該沉淀物；加入100μL pH=8的TE緩沖液，充分溶解后得基因組DNA樣品液，-20℃保存?zhèn)溆?

對照：參照周延清（2005）的方法提取油菜及其近緣植物干種子基因組DNA.

1.4 PCR擴(kuò)增體系及程序

針對前面本研究中的DNA提取方法獲得的甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、白芥和蕓芥五份DNA，利用10條隨機(jī)引物分別對他們進(jìn)行擴(kuò)增.反應(yīng)總體積為25μL：18.5μL ddH2O、2.5μL 10×buffer（含20mmol/L Mg2+）、1 U Taq DNA聚合酶、1μL引物、1μL模板DNA.PCR擴(kuò)增反應(yīng)在My cyclerTM 熱循環(huán)儀上進(jìn)行.擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4分鐘，94℃變性45秒，37℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘.

1.5 基因組DNA純度和濃度檢測

采用Nanaphotometer 核酸蛋白分析儀測定上述五份基因組DNA 樣品的OD260/OD280、OD260/OD230、OD320值和濃度.

1.6 電泳

用本試驗(yàn)中的提取方法獲得的基因組DNA，每份樣品液吸取1μL，分別加入6μL Loading buffer，在1.5%的瓊脂糖凝膠（含1%Gold View Ⅰ型核酸染色劑）中電泳分離.基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中分離.1×TAE為電泳緩沖液，按5V/cm電泳40分鐘.在凝膠成像系統(tǒng)上觀察DNA的完整性、擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性、照像并保存.

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜及其近緣植物干種子基因組DNA樣完整性檢測結(jié)果

從圖1可以看出，第1、2、3、7、9各泳道中的DNA帶型清晰，無拖尾現(xiàn)象，表明DNA未發(fā)生降解；第4、5、6各泳道中，DNA主帶模糊不清，出現(xiàn)明顯的地毯帶，表明DNA樣已嚴(yán)重降解且內(nèi)含雜質(zhì).第8和第10條泳道中，DNA主帶雖較清楚，但帶型成鋸齒狀，且泳道中出現(xiàn)一定的拖尾現(xiàn)象，表明DNA有輕微的降解現(xiàn)象，并含有一定量的雜質(zhì).

圖1 三種類型油菜及其近緣植物干種子基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Detection of DNA integrity by electrophoresis on agrose gel

2.2 油菜及其近緣植物干種子基因組DNA純度和濃度檢測結(jié)果

OD320為檢測DNA樣品溶液的濁度和其他干擾因子，該值應(yīng)該接近0［17］.由表2可知，當(dāng)采用本試驗(yàn)的方法提取時(shí)，OD320的測定值介于0.000～0.002 之間，其平均值為0.0008，接近于0，表明所抽提DNA樣品中懸浮物的量較少；當(dāng)采用對照方法提取時(shí)，OD320的值介于0.008～0.01之間，均值為0.0262，明顯大于0.000，表明所抽提DNA樣中含有一定量的懸浮物.

若所測DNA樣的OD260/OD280≈1.8，說明所提取的DNA樣純度較高，無蛋白質(zhì)污染［17］.當(dāng)用對照方法提取時(shí)，OD260/OD280的值為1.250～1.677，均值為1.4238，明顯小于1.8，表明所提取DNA 樣的純度較低，有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染；而當(dāng)用本試驗(yàn)的方法提取時(shí)，三大類型油菜及其近緣植物的OD260/OD280的值在1.792～1.905之間，均值為1.861，表明所提取DNA樣的純度較高.

較純凈的核酸其OD260/OD230的比值大于2.0.若比值小于2.0，表明樣品被糖類等污染［17］.當(dāng)用對照方法提取時(shí)，五種材料DNA 樣品液的OD260/OD230的值介于0.934～1.721 之間，均值為1.375，明顯小于2.0，表明所提DNA樣已被碳水化合物、鹽類或有機(jī)溶劑污染；當(dāng)用本試驗(yàn)的方法提取時(shí)，所有材料的DNA樣品液其OD260/OD230的值均大于2.0，均值為2.176，表明所提取DNA樣液沒有被碳水化合物、鹽類所污染.

就基因組DNA樣的濃度而言，當(dāng)用本試驗(yàn)的方法提取時(shí)，從甘藍(lán)型油菜和芥菜型油菜干種子中所得的DNA樣的濃度較高，分別為1130μg/mL和975μg/mL，而白菜型油菜的較低.五種材料的DNA樣的平均濃度為814μg/mL；當(dāng)用文獻(xiàn)法提取時(shí)，所有材料DNA 樣的平均濃度為767μg/mL，DNA 樣的濃度在523～1046μg/mL 之間變化.表2 結(jié)果還表明，從蕓芥和白芥這兩種油菜近緣植物干種子中分離出的DNA樣的濃度明顯低于三大類型油菜的.綜上可見，采用本試驗(yàn)方法，可以從三大類型油菜及其近緣植物干種子中分離提取出一定濃度且純度較高的基因組DNA樣.

表2 不同提取方法所得油菜及其近緣植物干種子基因組DNA純度和濃度檢測結(jié)果Table 2 Concentration and OD value of genomic DNA from rapeseed and its closely related plant seeds

2.3 油菜及其近緣植物干種子基因組DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

DNA質(zhì)量的好壞決定著下游實(shí)驗(yàn)的順利與否.用本試驗(yàn)的提取方法獲得的基因組DNA作模板，通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳能夠順利完成（圖2、圖3），擴(kuò)增產(chǎn)物亦清晰可辨，通過多條引物的擴(kuò)增，能夠?qū)崿F(xiàn)多態(tài)性片段的分離.本研究的10條隨機(jī)引物中，有6條在5份基因組DNA樣品中均能擴(kuò)增出譜帶，圖2和圖3只是部分?jǐn)U增結(jié)果.這些結(jié)果表明，使用該方法提取的DNA能夠勝任RAPD擴(kuò)增實(shí)驗(yàn).

圖2 三大類型油菜干種子基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜左：甘藍(lán)型油菜、引物S121；中：白菜型油菜、引物66；右：芥菜型油菜、引物170Fig.2 PCR amplification profiles of genomic DNA from dry oilseed seedsLeft：B.napus，S121；Medium：B.campestris，S66；Right：B.juncea，S170

圖3 油菜近緣植物干種子基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜左：白芥；右：蕓芥 引物：S345Fig.3 PCR amplification profiles of genomic DNA from dry S.alba and E.sativa seedsLeft：S.alba，S152；Right：E.sativa，Primer：S345

3 討論

3.1 確定了一種從三大類型油菜及其兩種近緣植物干種子中分離提取高純度DNA的方法

以種子為材料進(jìn)行DNA提取在小麥［10，18］、玉米［9，19］、棉花［7，8］、水稻［6］、大豆［11，20］和菜心［21］等作物上均有報(bào)道.而油菜、蕓芥和白芥的種皮和籽粒中因貯藏較多的脂肪、蛋白質(zhì)、糖類等大分子干擾物質(zhì)［14］，同時(shí)油菜籽中還含有黃酮、花色素苷、香豆素、鞣質(zhì)等小分子次生物質(zhì)，其中含有酚羥基的化合物，氧化后要與DNA結(jié)合，引起DNA降解.通過采用本試驗(yàn)方法，從三大類型油菜及其兩種近緣植物的干種子中分離提取到了一定量的基因組DNA，且純度較高.

3.2 本研究方法的優(yōu)點(diǎn)

與其他從種子中提取DNA的方法相比，本試驗(yàn)方法主要有以下幾點(diǎn)不同：（1）提取液中EDTA的濃度提高到50mmol/L，能保護(hù)種子內(nèi)DNA 不被內(nèi)源核酸酶降解，保證得到完整性較好的DNA；（2）種子和CTAB 提取液之間的質(zhì)量體積比為0.5～700，不僅降低了多糖對提取DNA 的干擾作用，而且CTAB 與核酸復(fù)合物沉淀容易產(chǎn)生，得到的DNA不宜降解；（3）提取液中CTAB濃度提高到3×CTAB提取液，且在用乙醇沉淀DNA 時(shí)采用高鹽法，使多糖保留在溶液中，有效除去種子中的多糖，使2.0＜OD260/OD230＜2.5，從而獲得無多糖污染的DNA 樣品；（4）提取液中加入1%的二硫蘇糖醇和2%的PEG，不但起到防止酚類氧化的作用，還可防止酚類與DNA 的結(jié)合，完全保護(hù)DNA 的完整性；（5）本試驗(yàn)通過氯仿-異戊醇混合液對先后得到的上清液進(jìn)行兩次抽提，然后用預(yù)冷乙醇對上清液中的DNA 進(jìn)行兩次沉淀，能有效除去種子中貯藏的蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)污染降到最低；（6）直接以油菜及其近緣植物干種子為材料進(jìn)行DNA 提取，相比現(xiàn)有常用方法中以葉片為材料的提取方法，不僅簡單快速，省去了育苗過程，在降低實(shí)驗(yàn)成本的同時(shí)大大降低了工作效率；（7）在適量提取液中研樣，不需液氮中冷凍研樣，也能防止DNA 的降解，避免了被液氮凍傷的危害.總之，采用本研究方法來提取DNA，可避免商業(yè)試劑盒在提取高質(zhì)量DNA中所付出的昂貴代價(jià)，并且該方法不需要液氮和幼苗培養(yǎng)過程.

3.3 后續(xù)研究工作

本研究結(jié)果表明，當(dāng)以油菜近緣植物白芥和蕓芥為試材時(shí)，所得DNA樣品液的濃度低于三大類型油菜的，其原因主要是材料本身的問題，蕓芥和白芥的含油量低于油菜，但二者的種子中蛋白質(zhì)、糖類的含量相對高于油菜的，導(dǎo)致DNA提取難度更大.另外，基因組靶向定位誘導(dǎo)損傷技術(shù)（Targeting In?duced Local Lesions In Genomes，TILLING）已經(jīng)成為一種越來越受歡迎的可在已知基因序列的基礎(chǔ)上鑒別突變系列的反向遺傳學(xué)研究工具［22，23］，利用本研究方法提取的基因組DNA 能否勝任該技術(shù)對高豐度、高純度DNA的嚴(yán)格要求還需作者進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

上述結(jié)果說明，本試驗(yàn)方法的材料易得，操作簡便、實(shí)用，易于實(shí)施，在保證DNA提取量的前提下能夠快速提取純度較高、完整性較好的基因組DNA，在油菜種質(zhì)資源分析、種子純度鑒定乃至種子分子機(jī)理探索等方面具有重要意義.