王東博，張蕾蕾，翟晶煥，張麗娟，劉錫建，朱雪焱，陸杰

（1 上海工程技術(shù)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海201620； 2 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院化學(xué)制藥部，上海201203）

引 言

目前，超過(guò)50%的藥物活性成分具有手性[1]，由于生物體內(nèi)的受體或酶是手性的，往往只有一種對(duì)映體藥物能夠與其選擇性地作用，進(jìn)而提供所需的生理效應(yīng)[2]，而另一種對(duì)映體則沒有這種相互作用，甚至是有害的[3]。例如，20 世紀(jì)60 年代的“反應(yīng)?！笔录忱劝返谋瘎?，其沙利度胺R 構(gòu)型對(duì)孕婦具有鎮(zhèn)靜作用，而S 構(gòu)型具有強(qiáng)烈的胎兒致畸作用，但市面上銷售的是沙利度胺的外消旋體，導(dǎo)致全世界數(shù)萬(wàn)畸形兒的誕生，這起事件引起了科學(xué)家對(duì)藥物手性純度的重視[4]。本實(shí)驗(yàn)研究的青霉胺（penicillamine，Pen）雖然構(gòu)型相似，但藥理作用完全相反。其中，D-青霉胺是一種重要的硫醇類化合物，臨床上可用于治療Wilson 氏病，亦可用作銅、汞等重金屬解毒藥[5]。近年來(lái)，研究還發(fā)現(xiàn)它能夠用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和肝炎，以及預(yù)防嬰幼兒視網(wǎng)膜等疾病[6]。然而，L-青霉胺卻有相當(dāng)大的毒性，對(duì)人體有毒害作用[7]。

結(jié)晶拆分法即通過(guò)結(jié)晶的方式，使得外消旋溶液中某一種對(duì)映異構(gòu)體結(jié)晶析出，而另一種對(duì)映異構(gòu)體仍留在溶液中，從而達(dá)到手性拆分的目的，一般包括非對(duì)映體成鹽拆分[8-9]、優(yōu)先結(jié)晶[10-12]、優(yōu)先富集[13-14]、Viedma 熟化[15-17]等。其中，優(yōu)先結(jié)晶法又稱直接結(jié)晶法，具有簡(jiǎn)單、高效及便捷等特點(diǎn)，是一種重要的拆分手性異構(gòu)體的方法，即向外消旋體的過(guò)飽和溶液中加入某一純的對(duì)映體作為晶種，僅使該對(duì)映體的晶體從溶液中析出的方法[18-20]。

近年來(lái)，一些學(xué)者對(duì)青霉胺的手性分離進(jìn)行了研究。Nakashima 等[21]、He 等[5]分別采用高效液相色譜和毛細(xì)管電泳法拆分其外消旋體。雖然其拆分方法能夠獲得較高純度的單一對(duì)映體，但方法煩瑣不能用于實(shí)際的工業(yè)生產(chǎn)。另外，國(guó)家對(duì)工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的環(huán)境保護(hù)工作高度重視[22-23]，因此開發(fā)環(huán)保、高效、便捷及能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的結(jié)晶拆分技術(shù)，對(duì)D-青霉胺的實(shí)際生產(chǎn)與臨床應(yīng)用具有重要意義。

本項(xiàng)研究首先測(cè)定了DL-及D-青霉胺在273.15～333.15 K、不同質(zhì)量比的乙醇-水混合溶劑中的溶解度，以此選定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為34.47%乙醇-水作為降溫結(jié)晶溶劑，并繪制不同溫度下青霉胺溶解度曲線。結(jié)果表明其二元共飽和點(diǎn)的對(duì)映體過(guò)量值（ee值）為85%。隨后，以313.15 K下、ee值為87%的飽和溶液為模型體系，研究了其在0.3 K/min、不同晶種量下的介穩(wěn)區(qū)寬度（metastable zone width,MSZW），以及不同初始過(guò)冷度下的等溫結(jié)晶過(guò)程和不同降溫速率、不同晶種量的降溫結(jié)晶過(guò)程，為青霉胺結(jié)晶拆分過(guò)程的理解、優(yōu)化、工藝設(shè)計(jì)提供基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

D-青霉胺、L-青霉胺與DL-青霉胺（純度＞98%），北京百靈威科技有限公司；乙醇（純度＞99.7%），麥克林試劑；超純水，上海樂楓生物科技有限公司Direct-Pure系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

低溫恒溫槽，F(xiàn)12-ME 型，德國(guó)優(yōu)萊博公司；高效液相色譜儀（配有四元泵及自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD 檢測(cè)器），1260 型，美國(guó)安捷倫公司；電子天平，XP 205型，梅特勒托利多集團(tuán)；真空干燥箱，DZF-6050 型，上?；厶﹥x器制造有限公司；熱重分析儀，TGA PT-1000型，林賽斯（上海）科學(xué)儀器有限公司；X射線衍射儀，D2 PHASER 型，德國(guó)布魯克公司；激光發(fā)射器、接收器等相關(guān)組件由西安賽普林激光技術(shù)研究所制造。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 固液平衡 室溫下準(zhǔn)確稱量一定量的乙醇和超純水置于某恒定溫度的結(jié)晶器中，加入過(guò)量DL-青霉胺、D-青霉胺或不同初始ee 值青霉胺，恒溫?cái)嚢?2 h，并靜置6 h（在此項(xiàng)工作中利用激光檢測(cè)系統(tǒng)在線監(jiān)測(cè)溶液濁度變化情況。當(dāng)攪拌6 h 后激光強(qiáng)度變化緩慢，當(dāng)靜置3 h 時(shí)后激光強(qiáng)度達(dá)到極大值并趨于穩(wěn)定），注射器抽取上清液，用0.22 μm 的膜過(guò)濾器過(guò)濾后注入小瓶中，烘干，稱重，用式（1）計(jì)算摩爾分?jǐn)?shù)溶解度x[24-27]。殘留固體分析其ee值、溶劑化以及晶型改變與否。

式中，m1、m2、m3分別表示青霉胺、去離子水、乙醇在飽和溶液中的質(zhì)量，M1、M2、M3分別表示各自的摩爾質(zhì)量。

1.3.2 介穩(wěn)區(qū)寬度 D-青霉胺、DL-青霉胺以及ee值為87%溶液的介穩(wěn)區(qū)寬度用激光檢測(cè)法測(cè)定：根據(jù)溶解度曲線準(zhǔn)確稱取溶質(zhì)與溶劑，放入結(jié)晶器后，將恒溫水浴溫度設(shè)置比飽和溫度高5 K，攪拌2 h，待溶液穩(wěn)定后，以0.3 K/min 恒定降溫速率降溫，待激光強(qiáng)度開始變?nèi)?，溶液變渾濁時(shí)記錄溶液溫度，此溫度與飽和溫度之差就是所測(cè)的介穩(wěn)區(qū)寬度。

1.3.3 成核實(shí)驗(yàn) 配制ee 值為80%、87%、90%和95%在313.15 K 下的飽和溶液，分別快速移入溫度已恒定在303.15、298.15、293.15、288.15 和283.15 K的結(jié)晶器中，當(dāng)激光強(qiáng)度開始變?nèi)?，溶液渾濁時(shí)分析固體ee值。

1.3.4 恒溫結(jié)晶 配制ee 值為87%在313.15 K 下的飽和溶液，移入溫度已恒定在307.15、303.15、298.15 或293.15 K 的結(jié)晶器中，晶種量為無(wú)、1%、2%、4%或8%（相對(duì)于起始飽和溶液中D-青霉胺的量），以結(jié)晶時(shí)間間隔30 min 分析產(chǎn)品ee 值，并確定產(chǎn)品ee 值始低于99%的時(shí)間點(diǎn)及在該時(shí)間點(diǎn)下結(jié)晶收率（產(chǎn)品質(zhì)量減去晶種加入量后與原料液中D-對(duì)映體的質(zhì)量之比）。

1.3.5 降溫結(jié)晶 配制ee 值為87%在313.15 K 下的飽和溶液，降溫速率分別為0.05、0.1、0.2 和0.4 K/min，晶種量為1%、2%、4%或8%，以結(jié)晶時(shí)間間隔20 min 分析產(chǎn)品ee 值，并確定產(chǎn)品ee 值始低于99%的時(shí)間點(diǎn)及在該時(shí)間點(diǎn)下結(jié)晶收率。

1.3.6 高效液相色譜分析 采用高效液相色譜（HPLC）測(cè)量ee 值。色譜條件：大賽璐CR(+)手性色譜柱（4.0 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為pH=1 的高氯酸-水溶液，流速為0.1 ml/min，柱溫15℃，檢測(cè)波長(zhǎng)λ=202 nm，進(jìn)樣量5 μl。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 DL-和D-青霉胺在不同質(zhì)量比乙醇-水混合溶劑中的溶解度

乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、16.21%、34.47% 和52.09%的乙醇-水混合溶劑中DL-及D-青霉胺在273.15～333.15 K 溫度范圍內(nèi)的溶解度如圖1所示。

圖1 DL-和D-青霉胺在不同質(zhì)量比乙醇-水混合溶劑中的溶解度Fig.1 Solubility of DL-and D-penicillamine in ethanol-water mixed solvents with different mass ratios

圖2 D-和DL-青霉胺殘余固體的熱分析譜圖Fig.2 DSC and TGA thermograms of the residual solids of D-and DL-penicillamine

圖3 D-和DL-青霉胺原料與固液平衡后殘余固體的X射線衍射譜圖Fig.3 XRD patterns of the raw materials and the residual solids after solid-liquid equilibrium of D-and DL-penicillamine

研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)的溫度范圍下，D-及DL-青霉胺殘余固體的熱分析譜圖如圖2 所示，其原料與殘余固體的X 射線衍射光譜如圖3 所示，從圖中可發(fā)現(xiàn)殘余的固體無(wú)溶劑化及晶型改變現(xiàn)象。溶解度單調(diào)地隨溫度的升高而增大，且DL-青霉胺溶解度小于D-青霉胺溶解度，說(shuō)明青霉胺外消旋體類型可能是外消旋化合物。此外，在純水中，DL-及D-青霉胺溶解度非常大（293.15 K時(shí)，DL-和D-青霉胺摩爾溶解度分別為6.863×10-3和15.589×10-3），且隨著混合溶劑中乙醇含量的增加，溶解度降低。

2.2 不同ee值青霉胺的溶解度

在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為34.47%的乙醇-水混合溶劑中，273.15、283.15、293.15、303.15、313.15 和323.15 K六個(gè)固液平衡溫度下不同ee值青霉胺的溶解度如圖4所示。結(jié)果顯示，在六個(gè)溫度下，二元共飽和點(diǎn)ee 值不發(fā)生變化，始終為85%。六個(gè)溫度下的溶解度曲線形狀類似，可進(jìn)一步證明青霉胺外消旋體為外消旋化合物[28]。

圖4 不同ee值青霉胺的溶解度Fig.4 The solubility of penicillamine with various ee values

2.3 D-青霉胺、DL-青霉胺以及ee 值為87%溶液的介穩(wěn)區(qū)寬度

在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為34.47%的乙醇-水混合溶劑中不同溫度下的D-青霉胺、DL-青霉胺及ee 值為87%飽和溶液的介穩(wěn)區(qū)寬度如圖5 所示。介穩(wěn)區(qū)寬度隨溫度升高而減小，主要是因?yàn)樵诟邷叵氯芤吼ざ冉档?，溶質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)增大，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，成核較低溫時(shí)更容易，在實(shí)驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，相同飽和溫度下的D-青霉胺溶液的介穩(wěn)區(qū)寬度比外消旋體溶液的介穩(wěn)區(qū)寬度寬[29]。ee 值為87%、溫度為313.15 K 的飽和溶液在不加晶種時(shí)，其介穩(wěn)區(qū)寬度為17.6 K；加入1%、2%、4%和8%晶種時(shí)，其介穩(wěn)區(qū)寬度分別為16.4、15.3、13.0 和8.3 K。介穩(wěn)區(qū)寬度隨晶種加入量的增加而減小，這可能是由于加入的晶種降低了初級(jí)成核勢(shì)壘，成核更容易，介穩(wěn)區(qū)寬度減小。

2.4 成核實(shí)驗(yàn)

圖5 D-青霉胺、DL-青霉胺和ee=87%飽和溶液的介穩(wěn)區(qū)寬度Fig.5 The MSZW of D-penicillamine,DL-penicillamine and saturation solution with ee=87%

圖6 過(guò)冷度對(duì)初始成核的影響Fig.6 Effect of subcooling on initial nucleation

313.15 K下不同ee值的飽和溶液在不同成核溫度下的初始晶核的ee 值如圖6 所示。成核溫度越低、初始過(guò)冷度越大，晶核量越多，ee 值越小。反之，成核溫度越高，初始過(guò)冷度越小，晶核量越少，ee值越大。如ee 值為87%、飽和溫度為313.15 K 的飽和溶液[圖6(b)]，在283.15 K 成核時(shí)，晶核的ee 值為86.84%；在303.15 K成核時(shí)，晶核的ee值為89.23%。也就是說(shuō)，對(duì)于青霉胺手性體系可通過(guò)優(yōu)先結(jié)晶法提高產(chǎn)品ee值。

2.5 恒溫結(jié)晶

2.5.1 不加晶種 ee 值為87%、313.15 K 下的飽和溶液在初始過(guò)冷度為6、10、15 和20 K 時(shí)固體ee 值隨結(jié)晶時(shí)間的變化情況如圖7所示。在四個(gè)恒定溫度下，初始晶核的ee 值均大于87%，產(chǎn)品ee 值隨時(shí)間先增大后減小，但增大過(guò)程的時(shí)間隨結(jié)晶溫度變化較大，例如ee 值增加趨勢(shì)在293.15 K 下僅維持約2 min，而在307.15 K 下能維持約40 min。也就是說(shuō)，初始晶核中D-對(duì)映體晶核比外消旋體晶核多，在其生長(zhǎng)過(guò)程中，隨著過(guò)飽和度的消耗，外消旋體晶體逐漸增多。

圖7 固體ee值隨結(jié)晶時(shí)間的變化Fig.7 Change of the ee value of solids with crystallization time

2.5.2 加晶種 ee 值為87%、313.15 K 下的飽和溶液在初始過(guò)冷度為6、10、15 和20 K 以及晶種量為1%、2%、4%和8%時(shí)固體ee值隨結(jié)晶時(shí)間變化情況如圖8 所示。與2.5.1 節(jié)不加晶種實(shí)驗(yàn)相比，加入晶種后，固體產(chǎn)品的ee 值隨結(jié)晶時(shí)間單調(diào)地降低。在同樣晶種加入量下，固體ee 值下降速度隨初始過(guò)冷度的增加而增大。正如前文所述，晶種為1%、2%、4%和8%時(shí)，該飽和溶液介穩(wěn)區(qū)寬度分別為16.4、15.3、13.0 和8.3 K。當(dāng)采用過(guò)大的初始過(guò)冷度（如10、15 和20 K），加入的晶種量越多，誘導(dǎo)成核的速率和晶核量越高，產(chǎn)品ee 值越小且快速下降。當(dāng)初始過(guò)冷度為6 K時(shí)，晶種量為2%的結(jié)晶產(chǎn)品ee值隨時(shí)間變化最為緩慢。這是因?yàn)樵谠摮跏歼^(guò)冷度下，晶種量較大時(shí)，成核發(fā)生加快，晶核量增多，產(chǎn)品ee值較快下降；而晶種量較小如1%時(shí)，不足以誘導(dǎo)二次成核，且晶種提供的生長(zhǎng)面較少，誘導(dǎo)期后的初級(jí)成核速率較大，產(chǎn)品ee 值相應(yīng)下降較快。因此，結(jié)晶拆分應(yīng)選擇適宜的過(guò)飽和度及與其相應(yīng)的晶種量。

2.5.3 結(jié)晶收率 按照2.5.2 節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)實(shí)驗(yàn)并分析固體ee值始低于99%時(shí)間點(diǎn)時(shí)產(chǎn)品收率，結(jié)果如表1所示。產(chǎn)品收率隨晶種加入量和初始過(guò)冷度的增大而增大。在實(shí)驗(yàn)采用的初始過(guò)冷度中，隨初始過(guò)冷度的增加，收率增加逐漸變緩，這主要是因?yàn)槌跏歼^(guò)冷度較大時(shí)，產(chǎn)生的晶核較多，產(chǎn)品粒度較小。

2.5.4 過(guò)程分析 以初始過(guò)冷度為10 K、晶種量為2%為例，固體和母液ee值隨時(shí)間變化情況如圖9所示。固體ee 值在前300 min 緩慢減小，超過(guò)300 min后迅速下降。母液ee 值在前300 min 一直減小，說(shuō)明D-對(duì)映體晶體和外消旋體晶體從母液中以不同速率析出，并逐漸變緩，超過(guò)300 min 后外消旋體晶體大比例析出，產(chǎn)品ee 值快速下降，母液ee 值快速上升，最終趨向于二元共飽和點(diǎn)ee 值。根據(jù)母液ee值變化繪制的結(jié)晶過(guò)程路線“trajectory”如圖10 所示[30]，溶液ee值先快后慢減小，到達(dá)拐點(diǎn)后逐漸增大至二元共飽和點(diǎn)ee值。

表1 青霉胺恒溫結(jié)晶收率Table 1 Yield of penicillamine of thermostatic crystallization

圖8 固體ee值隨時(shí)間變化曲線Fig.8 Curve of solid ee values over time

圖9 結(jié)晶過(guò)程中固體和母液ee值變化Fig.9 Change in ee value of the solid and mother liquor during crystallization process

2.6 降溫結(jié)晶

圖10 青霉胺恒溫結(jié)晶過(guò)程Fig.10 The thermostatic crystallization process of penicillamine

2.6.1 過(guò)程分析 ee 值為87%、313.15 K 下的飽和溶液在晶種量為1%、2%、4%和8%以及降溫速率為0.05、0.1、0.2 和0.4 K/min 時(shí)固體ee 值隨結(jié)晶時(shí)間變化情況如圖11所示。在同一晶種加入量下，固體ee值下降趨勢(shì)隨降溫速率的加快而增加，這是因?yàn)榻禍厮俾试娇欤珊送苿?dòng)力越大，成核速度快，產(chǎn)品光學(xué)純度降低越快；在同一降溫速率下，固體ee 值變化趨勢(shì)隨晶種加入量的增加而變緩，這是因?yàn)榧僁-對(duì)映體晶種加入量越多，越高比例的過(guò)飽和度消耗于生長(zhǎng)而不是成核，由于D-晶種具有一定的光學(xué)選擇性，晶種越多，ee值降低越慢。

2.6.2 結(jié)晶收率 按照2.6.1 節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)實(shí)驗(yàn)并分析固體ee值始低于99%時(shí)間點(diǎn)時(shí)產(chǎn)品收率，結(jié)果如表2 所示。在相同的起始料液和降溫速率下，晶種加入量增加，收率增加，這與2.6.1節(jié)中結(jié)晶產(chǎn)品始低于99%的時(shí)間點(diǎn)越長(zhǎng)是一致的。在相同的起始料液和晶種加入量下，降溫速率減小，收率增加，這是由于：一方面，雖然到達(dá)固體ee 值始低于99%的時(shí)間點(diǎn)較長(zhǎng)，但降低的溫度較小，這會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品收率下降；但另一方面，降溫速率的降低，產(chǎn)品粒度增大，過(guò)濾后產(chǎn)品也會(huì)增多。

3 結(jié) 論

（1）通過(guò)靜態(tài)法測(cè)量溶解度數(shù)據(jù)，繪制不同溫度下青霉胺溶解度曲線。同時(shí)測(cè)量了D-青霉胺、DL-青霉胺以及ee值為87%溶液的介穩(wěn)區(qū)寬度。

圖11 固體ee值在不同降溫速率中隨時(shí)間變化曲線Fig.11 Curve of solid ee values over time at different cooling rates

表2 青霉胺降溫結(jié)晶收率Table 2 Yield of penicillamine of cooling crystallization

（2）通過(guò)成核實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于ee 值大于二元共飽和點(diǎn)的起始溶液，其初始晶核的ee 值總是高于起始溶液的ee 值，但隨著成核溫度的降低，初始過(guò)冷度的增加，晶核量越多，ee值越小。

（3）考察了降溫速率、晶種量對(duì)降溫結(jié)晶過(guò)程中產(chǎn)品ee 值和收率隨時(shí)間的變化情況，對(duì)于相同的起始溶液，ee 值大于99%的產(chǎn)品收率隨著晶種的加入量和降溫速率的減小而增加。

（4）研究表明，對(duì)于青霉胺這一手性體系，優(yōu)先結(jié)晶法可在一定程度上提高固體的光學(xué)純度，但收率較低，需要開發(fā)更為高效的手性結(jié)晶拆分技術(shù)與工藝。

符 號(hào) 說(shuō) 明

M——摩爾質(zhì)量，g/mol

m——質(zhì)量，g

T——熱力學(xué)溫度，K

ΔT——過(guò)冷度，K

t——時(shí)間，min

x——摩爾分?jǐn)?shù)溶解度