喻歡歡 張晨爽 林丹櫻 于斌 屈軍樂

(深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院, 光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點實驗室, 深圳 518060)

多焦點結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(multifocal structured illumination microscopy, MSIM)能在50 μm 的成像深度內(nèi)實現(xiàn)2 倍于衍射極限分辨率的提升, 但在對厚樣品成像時, 散射光和離焦光限制了其層析能力和圖像襯度.雙光子多焦點結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(two-photon MSIM, 2P-MSIM)克服了樣品組織散射的影響, 進一步提高了MSIM 的成像深度和成像特性.然而, 現(xiàn)有的2P-MSIM 通常采用振鏡掃描成像, 系統(tǒng)復(fù)雜, 靈活性差.為了解決上述問題, 本文提出了一種基于高速相位型空間光調(diào)制器(spatial light modulator, SLM)的雙光子多焦點結(jié)構(gòu)光照明超分辨顯微成像系統(tǒng), 通過在SLM 上同時加載生成多焦點陣列的相位圖和線性相位光柵的相位圖,實現(xiàn)了多焦點陣列的產(chǎn)生和在樣品面上的高精度的并行數(shù)字隨機尋址掃描和激發(fā)成像, 結(jié)合像素重定位和反卷積技術(shù)實現(xiàn)了三維雙光子多焦點結(jié)構(gòu)光超分辨成像, 解決了掃描振鏡在2P-MSIM 成像中的機械慣性問題,同時降低了系統(tǒng)的復(fù)雜性, 提升了靈活性.在此基礎(chǔ)上, 利用搭建的2P-MSIM 開展了小鼠腎組織切片和鈴蘭根莖雙光子超分辨成像實驗, 驗證了該方法的三維超分辨成像能力, 對于2P-MSIM 的發(fā)展具有重要的意義.

1 引 言

近年來, 多種突破光學(xué)衍射極限限制的超分辨顯微技術(shù)蓬勃發(fā)展, 如: 受激發(fā)射損耗(stimulated emission depletion, STED)顯微技術(shù)[1]、光激活定位顯微技術(shù)[2]、隨機光學(xué)重構(gòu)顯微成像技術(shù)(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)[3]及結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)(structured illumination microscopy, SIM)[4]等, 已達到了納米量級的空間分辨率, 實現(xiàn)了對細胞內(nèi)精細結(jié)構(gòu)的觀察, 極大地推動了生命科學(xué)等諸多領(lǐng)域的發(fā)展.盡管STED 顯微技術(shù)能對較厚的生物組織進行高分辨率成像, 但需要特定熒光標記的樣品及高能量的損耗光, 后者一定程度地造成了光漂白和光損傷, 限制了該技術(shù)的進一步應(yīng)用.STORM 雖能提供更高分辨率成像, 但其不僅僅受到熒光染料種類的限制, 寬場的激發(fā)方式和稀疏化的發(fā)光模式進一步限制了其成像深度和成像速度.與此同時, SIM 雖然僅僅能提供2 倍的分辨率提升, 但由于其具有成像時不受熒光染料的限制, 不需要高的激發(fā)光功率, 以及快的成像速度等優(yōu)勢, 在活細胞成像方面獲得廣泛的應(yīng)用.令人遺憾的是, 傳統(tǒng)的寬場結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)僅僅能實現(xiàn)對比較薄的樣品(< 10 μm)超分辨成像, 限制了其發(fā)展.圖像掃描顯微鏡(image scanning microscopy, ISM)[5]被認為是一種點掃描照明顯微成像技術(shù), 這種超分辨技術(shù)的出現(xiàn)大大提高了結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)的成像深度.然而, 單個聚焦點的掃描方式限制了ISM 的成像速度, 于是多焦點結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(multifocal structured illumination microscopy,MSIM)[6]被提出, 采用多點并行掃描的方式, 大大提高了單點掃描結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡的成像速度.

MSIM 不僅能夠?qū)崿F(xiàn)2 倍于寬場顯微鏡的成像分辨率, 還具有傳統(tǒng)共聚焦顯微技術(shù)的層析能力, 成像深度可以達到50 μm.但是, 在對厚樣品成像時, 樣品中的散射和離焦背景光降低了MSIM的成像特性.雙光子顯微鏡由于成像深度大并具有較好的層析能力在生物成像領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用.發(fā)展基于雙光子技術(shù)的MSIM, 即雙光子多焦點結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(two-photon MSIM, 2P-MSIM),進一步提升MSIM 的成像性能, 將進一步推進其在活體厚樣品超分辨成像中廣泛應(yīng)用.MSIM 采用數(shù)字微鏡器件(digtital micromirror device, DMD)實現(xiàn)點陣的產(chǎn)生和掃描, 但是DMD 因其較低的能量利用率而難以實現(xiàn)2P-MSIM.為了能夠獲得高效的多焦點雙光子激發(fā), 各種不同類型的光學(xué)器件被應(yīng)用在多光子多焦點顯微成像技術(shù)中, 包括光分束器[7]、微透鏡陣列[8?10]、衍射光學(xué)元件[11,12]及空間光調(diào)制器(spatial light modulator, SLM)[13?15]等.目前, 在2P-MSIM[10]中, 主要采用微透鏡陣列與掃描振鏡相結(jié)合的方式實現(xiàn)雙光子點陣的激發(fā)和掃描, 但其雙光子激發(fā)點陣是固定的, 靈活性差.而基于SLM 的多焦點產(chǎn)生技術(shù)在點陣的均勻性、效率及隨機性方面都具有較大的優(yōu)勢.利用SLM生成點陣的算法主要有基于相位恢復(fù)(Gerchberg-Saxton, GS)算法[16]、廣義自適應(yīng)加法算法[17]、直接搜尋算法[18]、以及加權(quán)相位恢復(fù)(weighted GS,WGS)算法[19,20]等.在這些算法中, WGS 算法生成的點陣具有更好的均勻性和效率.直到目前, 幾乎所有的多焦點多光子結(jié)構(gòu)光照明顯微成像系統(tǒng)都需要振鏡來實現(xiàn)掃描成像, 系統(tǒng)具有較大的復(fù)雜性且受機械慣性的影響, 靈活性差.為了解決上述問題, 本文提出并搭建了一種基于高速相位型SLM 的2P-MSIM, 僅通過在SLM 上加載生成點陣和線性相位光柵的合成相位圖, 就同時實現(xiàn)了點陣產(chǎn)生和在樣品面上高精度并行數(shù)字隨機尋址掃描激發(fā), 結(jié)合像素重定位和反卷積技術(shù)實現(xiàn)了三維雙光子多焦點結(jié)構(gòu)光超分辨成像.利用搭建的系統(tǒng)完成了對小鼠腎切片、鈴蘭根莖及熒光珠的雙光子超分辨成像, 具有較好的成像效果, 驗證了該方法的三維超分辨成像能力.

2 2P-MSIM 原理與方法

2.1 2P-MSIM 成像理論

2P-MSIM 被認為是一種并行的2P-ISM, 其實現(xiàn)超分辨的原理與2P-ISM 一致.在ISM[5]中,一個面陣探測器替換了激光共聚焦掃描顯微鏡中的點探測器.探測器探測到的圖像不僅僅與激發(fā)點的位置有關(guān), 同時也與探測器上的像素點的位置有關(guān), 因此, 在不考慮系統(tǒng)放大倍率的情況下, 在樣品面掃描位置r處, 探測器s位置處的雙光子熒光光強分布可以表示為[5,21]

其中,c(r′) 表示熒光分子分布,E(r′) 表示在掃描位置為r的系統(tǒng)激發(fā)點擴散函數(shù),U(r+s) 表示探測位置為r+s的系統(tǒng)探測點擴散函數(shù).那么, 在雙光子激發(fā)下, 系統(tǒng)有效的點擴散函數(shù)可表示為E0(r)U(r+s) , 其中E0(r)=E2(r) , 表示在掃描位置為r的雙光子激發(fā)點擴散函數(shù).假設(shè)雙光子激發(fā)點擴散函數(shù)和系統(tǒng)探測點擴散函數(shù)采用高斯分布模型, 且標準差分別為σin和σdet, 那么雙光子激發(fā)下, 系統(tǒng)有效的點擴散函數(shù)可重新表示為[22]

其中,G表示高斯函數(shù),Ueff表示有效的點擴散函數(shù).

在2P-ISM 中, 雙光子激發(fā)點擴散函數(shù)為系統(tǒng)激發(fā)點擴散函數(shù)的平方, 則雙光子激發(fā)點擴散函數(shù)的標準差為其中σex為單光子激發(fā)下, 系統(tǒng)激發(fā)點擴散函數(shù)的標準差.在雙光子激發(fā)過程中, 分子吸收兩個光子經(jīng)過斯托克斯位移后自發(fā)輻射出單個光子, 則雙光子激發(fā)波長λex與探測波長λdet的比值 1

假設(shè)不考慮雙光子激發(fā)時熒光染料的吸收截面, 再結(jié)合(2)式, 則2P-ISM 的有效點擴散函數(shù)U2P-eff可以描述為

再結(jié)合(1)式, 2P-MSIM 有效圖像可重新表示為

如果從頻率域來考慮, 那么兩邊同時進行傅里葉變換將得到:

從(6)式可以看出, 有效圖像包含的頻譜范圍是寬場照明得到 (k2+2)/k2, 所以, 通過像素重定位(pixel reassignment)和反卷積(deconvolution)處理, 理論上2P-MSIM 相比于寬場顯微鏡能實現(xiàn)(k2+2)/k2倍分辨率的提升.

2.2 系統(tǒng)光路設(shè)計

2P-MSIM 是基于尼康顯微鏡實現(xiàn)的(Nikon ECLIPSE Ti-U).一臺波長為1036 nm、功率為1 W、脈寬為145 fs 的激光從光纖激光器發(fā)出(安揚, FemotoYL-6), 首先通過一個可用來調(diào)節(jié)激光出射功率的半波片(Thorlabs, AHWP05M-980)和偏振分光棱鏡對; 從偏振分光棱鏡出射的P 偏振光再次經(jīng)過半波片(Thorlabs, AQWP10M-980),用來調(diào)整飛秒光在通過SLM 之前的偏振方向.然后, 光束被一對包含焦距為25 mm (Thorlabs,AC127-025-B-ML)以及焦距為80 mm (Thorlabs,AC254-080-B-ML)的透鏡對擴束; 經(jīng)擴束后的光束通過一個可調(diào)光闌照射在一個高速相位型SLM(Meadowlark Optics, 像元數(shù)為1920 × 1152, 像素尺寸為9.2 μm × 9.2 μm)上; 通過在SLM 上加載生成點陣和線性相位光柵的合成相位圖, 能夠?qū)崿F(xiàn)多個聚焦點陣列在其傅里葉面上的掃描移動;經(jīng)SLM 調(diào)制的激發(fā)光經(jīng)過一個焦距為300 mm 的透鏡(Thorlabs, AC508-300-B)后照射在顯微鏡的管鏡上; 為了滿足SLM 采光面大小與物鏡后孔徑面大小盡可能匹配, 將原來的管鏡替換成焦距為300 mm, 尺寸為2 英寸的透鏡(Thorlabs, A508-300-AB-ML), 與前一個透鏡構(gòu)成一個無擴束的4f系統(tǒng); 為了只讓SLM 的一級光通過系統(tǒng), 在4f系統(tǒng)兩個透鏡間放置一個可調(diào)光闌用來濾除SLM 的其他衍射級的光; 光束經(jīng)過管鏡后又經(jīng)過水浸物鏡(Nikon, 60 ×,NA為1.27)在樣品面上形成多個聚焦點; 樣品被激發(fā)后產(chǎn)生的熒光信號經(jīng)二向色鏡與發(fā)射片后由sCMOS 相機(濱松,ORCA-Flash4.0 v3)接收.整個光路的示意圖如圖1 所示.

圖1 2P-MSIM 系統(tǒng)光路示意圖Fig.1.Schematic diagram of 2P-MSIM system.

2.3 點陣產(chǎn)生和掃描相位圖設(shè)計

2.3.1 點陣相位圖設(shè)計原理

整個相位圖的設(shè)計分成3 步: 1)點陣相位圖的設(shè)計; 2)用于點陣掃描的線性相位光柵的設(shè)計;3)將兩個相位圖進行疊加生成最終的復(fù)合相位圖.

點陣相位圖的生成方法采用的是一種改進的WGS 算法[20], 即當(dāng)WGS 算法迭代幾次后, 一直保持頻譜面的相位不變, 用作下一次的迭代, 直至算法收斂.利用這種方式大大減少了迭代次數(shù), 加快了收斂速度.在傳統(tǒng)的WGS 算法中, 初值相位可以設(shè)置成分布范圍為–π—π 的隨機矩陣, 當(dāng)算法執(zhí)行第i次迭代時,傅里葉平面的振幅和相位可以根據(jù)輸入平面的振幅和相位Φi(x)經(jīng)過二維傅里葉變換得到.保持傅里葉面的相位Ψi(u) 不變,振幅Bi(u) 用目標振幅Γ(u) 乘以一個不均勻性矯正的加權(quán)系數(shù)gi(u) 來替換.gi(u) 可以表達為

其中,〈Bi(u)〉M表示計算得到的M個點的振幅平均值,δ(u) 表 示的是狄拉克函數(shù),g0(u) 設(shè)置為1.

然后, 用替換后的振幅和計算得到的相位進行二維逆傅里葉變換就得到輸入平面的振幅Ai+1(x)和相位Φi+1(x) , 通過這種方式不斷迭代下去, 最后就能得到均勻性好的點陣的輸入相位.但是當(dāng)用傳統(tǒng)的WGS 算法生成點陣時,我們發(fā)現(xiàn)在迭代過程中用替換Ai+1(x) 使gi(u)在矯正均勻性時很難有較大的改善, 往往需要較長的時間才能實現(xiàn)較好的矯正效果.主要原因是對于輸入平面的傅里葉變換, 振幅的替換引入了一個相位改變量δΨi(u) , 這個改變量要比加權(quán)系數(shù)改變量 δgi(u) 大得多, 所以導(dǎo)致了gi(u) 在矯正不均勻性方面很難有比較好的效果.值得注意的是, 通過對后續(xù)的i+1 次迭代的相位改變施加影響, 能有效地移除相位改變量 δΨi(u).具體做法是在WGS 算法執(zhí)行N次迭代達到目標調(diào)制效率后, 保持后續(xù)迭代中傅里葉平面的相位不變, 即Ψi(u)=ΨN(u).利用這種方法, 算法可以在很少的迭代次數(shù)就完成了收斂, 且最終生成了一個均勻性好、效率高的多焦點陣列.算法的執(zhí)行過程可以通過圖2(a)來表示,圖2(b)和圖2(c)分別表示利用該算法得到的相位圖和點陣圖.

2.3.2 線性相位光柵的設(shè)計

線性相位光柵的相位表達式可以表示為

其中,k表示光柵的頻率,r表示SLM 面的坐標.

相應(yīng)地, 復(fù)振幅表達式可以寫成 e xp(i2πkr) ,從頻率空間來考慮, 其傅里葉變換為δ(u ?k).考慮到光學(xué)的傅里葉變換和數(shù)學(xué)上傅里葉變換的坐標變換關(guān)系, 相位光柵對應(yīng)的傅里葉面的復(fù)振幅分布為其中f表示透鏡的焦距,λ表示激光器的波長.再令則該復(fù)振幅表達式變?yōu)榧僭O(shè)生成的點陣對應(yīng)的復(fù)振幅為Bi(u)Ψi(u)且激光器的波長帶寬很窄, 考慮到空域內(nèi)的復(fù)振幅的乘積對應(yīng)頻域內(nèi)的復(fù)振幅的卷積, 則相應(yīng)的疊加相位圖對應(yīng)傅里葉面的復(fù)振幅分布為從這個表達式上看, 點陣的位置被移動了ρ.

由于SLM 本身是由一個個的像素單元構(gòu)成的, 在SLM 面上的相位光柵的相位值被離散化,所以實際的線性相位光柵不可能實現(xiàn)點陣的連續(xù)移動.根據(jù)文獻[23], 相位光柵能實現(xiàn)的掃描精度為δf/kmax, 這里δf=fλ/D,D表示物鏡的通光孔徑;kmax表示相位光柵產(chǎn)生位移在jδf—δf的最大可實現(xiàn)個數(shù),kmax可以表示為

其中,N為產(chǎn)生的相位光柵在SLM 上所占的像素個數(shù),g為是SLM 的灰度級.綜合以上的分析, 利用線性相位光柵可實現(xiàn)亞納米級的掃描步長.

根據(jù)以上的相位圖的設(shè)計理論, 利用MATLAB軟件分別生成點陣的相位圖和線性相位光柵的相位圖, 最后通過相位疊加的方式生成最后的相位圖.

圖2 (a) WGS 算法流程圖; (b)得到的相位圖; (c)生成的點陣圖Fig.2.(a) Flow chart of WGS algorithm; (b) generated phase map; (c) generated multi-focus array.

2.4 2 P-MSIM 數(shù)據(jù)獲取與分析

為了實現(xiàn)同步掃描同步記錄的目的, 用LABVIEW 軟件分別控制納米位移臺(Pi, E-709)、相機和空間光調(diào)制器.實驗中, 納米位移臺每上升一步,就用SLM 和相機完成一層的成像.SLM 每加載一張圖片, 相機同時曝光記錄一次, 直至成像完成整個二維平面.根據(jù)每一層的圖像信息能夠完成對熒光樣品的三維重構(gòu).

與單光子的MSIM 的數(shù)據(jù)處理方法[6]相類似,2P-MSIM 超分辨圖像也可以通過像素重定位技術(shù), 即: 多焦激發(fā)(multifocal-exciting)、數(shù)字高斯針孔(pinholing)濾波、圖像縮放(scaling)、求和(summing) 4 個圖像處理步驟來重建超分辨圖像(multifocal-exciting pinholing scaling summing,MPSS), 再經(jīng)過Richardson-Lucy (RL)反卷積來進一步提升圖像的分辨率, 獲得2 倍分辨率提升的2P-MSIM 圖像.考慮到激發(fā)點大小的改變和波長的差異, 實際的處理過程需要對實驗室已有程序[24]略微加以改進, 即可獲得近似2 倍分辨率提升的雙光子超分辨圖像.

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光珠成像

為了測試系統(tǒng)的空間分辨率, 首先對尺寸100 nm, 中心發(fā)射波長為580 nm 的熒光珠進行成像, 由于所選熒光珠尺寸小于該成像系統(tǒng)的理論分辨率, 所以實驗分析時未考慮熒光珠直徑對測量的半高全寬的影響.對得到的2P-MSIM 原始數(shù)據(jù)進行了重構(gòu), 分別獲得了點陣激發(fā)圖通過添加高斯數(shù)字針孔再疊加(pinholed+summed)的初步降噪的寬場圖像(pinholed widefield, Pinholed WF)、像素重定位的MPSS 圖像及MSIM 圖像, 結(jié)果如圖3 所示.圖3(a)—(c)分別表示熒光珠在經(jīng)過這3 個過程后得到的圖像, 大的虛線框內(nèi)的熒光珠為小的虛線框內(nèi)的熒光珠的放大, 可以明顯觀察到在PinholedWF 圖像中原本分不開的熒光珠圖像在MPSS 和MSIM 圖像中能明顯地分開.圖3(d)為圖3(a)—(c)中黃色實線所在像素的值的大小與對應(yīng)的像素所占的寬度作的曲線擬合, 每條曲線都經(jīng)過了歸一化處理.為了能標定系統(tǒng)的分辨率,也對視場范圍內(nèi)10 顆熒光珠的圖像進行高斯曲線擬合, 并進行統(tǒng)計平均, 得到了系統(tǒng)的平均分辨率,如圖3(e)所示.經(jīng)過對單個熒光珠的Pinholed-WF, MPSS 和MSIM 圖像擬合, 得到熒光珠的半高全寬值分別是(360 ± 15) nm, (207 ± 15) nm和(148 ± 13) nm, 與系統(tǒng)的寬場分辨率相比基本實現(xiàn)了近似2 倍的分辨率提升.

圖3 100 nm 熒光珠成像 (a) PinholedWF 圖像; (b) MPSS 圖像; (c) MSIM 圖像; (d)圖(a)—(c)中黃色實線所在像素值的大小與對應(yīng)像素所占寬度的擬合曲線; (e)單個熒光珠的高斯擬合曲線Fig.3.100 nm fluorescent bead imaging: (a) PinholedWF image; (b) MPSS image; (c) MSIM image; (d) fitting curves of the size of the pixel value of the yellow solid lines in panel (a)-(c) vs.the width of corresponding pixel; (e) Gaussian fitting curves of a single fluorescent bead.

3.2 小鼠腎切片三維成像

2P-MSIM 相比于1P-MSIM 在成像深度方面有明顯的提升, 具有良好的三維層析成像能力.為了測試2P-MSIM 的三維成像能力, 對商用的小鼠腎切片進行成像.為了盡可能提高成像速度, 同時保證超分辨成像質(zhì)量, 避免圖像出現(xiàn)偽影及點陣信號之間的串?dāng)_.設(shè)置點陣間隔為3250 nm, 點陣數(shù)量為8 × 8, 橫向的掃描步長為130 nm, 整幅圖像的成像時間是6.25 s, 成像區(qū)域大小為26.1 μm ×26.1 μm.通過控制納米位移臺, 實現(xiàn)了同一個小鼠腎切片的不同厚度的成像, 分別是0, 5, 10 μm,如圖4 所示.可以明顯地觀察到小鼠腎切片在不同深度結(jié)構(gòu)的改變, 同時MSIM 處理后的圖像的分辨率具有顯著的提高.

為了能更直觀地觀察生物樣品的三維結(jié)構(gòu), 進一步掃描了小鼠腎切片的一個三維成像區(qū)域, 橫向的掃描參數(shù)設(shè)置保持不變, 軸向的掃描步長設(shè)置為200 nm, 掃描層數(shù)為30 層, 這樣總的成像深度為6 μm.對每層進行超分辨處理后的數(shù)據(jù)通過Imaris 軟件進行三維堆棧.如圖5 所示, 重構(gòu)出的三維超分辨小鼠腎切片圖像實現(xiàn)了近似2 倍的分辨率提升.

圖4 小鼠腎切片的不同厚度層成像圖Fig.4.Images of different thickness layers of mouse kidney section.

圖5 小鼠腎切片三維成像圖 (a) PinholedWF 圖像; (b) MSIM 圖像Fig.5.Three-dimensional image of mouse kidney section: (a) PinholedWF image; (b) MSIM image.

圖6 鈴蘭根莖不同厚度層成像圖Fig.6.Images of different thickness layers of lily of the valley rhizome.

3.3 鈴蘭根莖成像

為了進一步測試2P-MISM 的成像能力和分辨率, 對鈴蘭根莖進行了成像.和前文描述的方法一樣, 對鈴蘭根莖的不同深度的區(qū)域完成了成像,成像深度分別是0, 12, 24 μm, 如圖6 所示.可以看出原本無法觀測到的鈴蘭根莖內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化在超分辨處理后能較清晰地觀測到, 進一步驗證了所搭建2P-MSIM 的成像能力.

4 結(jié) 論

本文提出和搭建了一套新的雙光子多焦點結(jié)構(gòu)光超分辨顯微成像系統(tǒng).利用了一個高速相位型空間光調(diào)制器同時完成了多焦點陣列的生成及點陣在樣品面上的高精度掃描移動, 實現(xiàn)了雙光子多焦點成像的目的, 解決了掃描振鏡在多焦點成像中的機械慣性問題, 同時降低了系統(tǒng)的復(fù)雜性, 提高了靈活性.另外, 為了進一步提高雙光子多焦點成像的分辨率, 把點掃描結(jié)構(gòu)光成像和雙光子成像結(jié)合在一起, 實現(xiàn)了雙光子多焦點結(jié)構(gòu)光照明的超分辨成像, 將雙光子多焦點的成像分辨率提高了近2 倍.最后, 利用該系統(tǒng)完成了小鼠腎切片和鈴蘭根莖的三維超分辨成像, 證實了該系統(tǒng)具有優(yōu)異的成像特性, 為進一步開展活體細胞及組織的超分辨成像打下了基礎(chǔ).