錢(qián)虹萍 陳博 林金星 崔亞寧

（1. 北京林業(yè)大學(xué)林木分子設(shè)計(jì)育種高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；2. 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟，也是真核生物生長(zhǎng)發(fā)育和生命活動(dòng)中必不可少的過(guò)程。該過(guò)程是以雙鏈DNA中的一條鏈為模板，以A、U、C、G四種核糖核苷酸為原料，在RNA聚合酶的催化作用下轉(zhuǎn)錄形成mRNA。轉(zhuǎn)錄過(guò)程又可以被分為轉(zhuǎn)錄起始、延伸、終止3個(gè)階段，首先RNA聚合酶與基因上的啟動(dòng)子［1］結(jié)合誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始，在調(diào)控因子的協(xié)助下進(jìn)一步完成延伸，直至遇到終止信號(hào)完成特定基因的轉(zhuǎn)錄。所以，轉(zhuǎn)錄是將遺傳信息從DNA流向RNA的過(guò)程，這對(duì)生物的多樣性及生命的存在均有重要的意義。

前期的研究展示，真核生物的細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄主要由3種RNA聚合酶介導(dǎo)，分別是RNA聚合酶I，RNA聚合酶II，以及RNA聚合酶III。其中RNA聚合酶I主要定位在細(xì)胞核仁，負(fù)責(zé)催化合成核糖體RNA（rRNA）中的18S rRNA、28S rRNA和5.8S rRNA；RNA聚合酶III則主要定位于細(xì)胞核基質(zhì)，負(fù)責(zé)指導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）、5S rRNA以及一些非編碼RNA的合成；RNA聚合酶II也定位在細(xì)胞核基質(zhì)中，負(fù)責(zé)催化核糖核酸的轉(zhuǎn)錄，來(lái)合成信使RNA（mRNA）及大多數(shù)snRNA、hnRNA。近期對(duì)植物體的研究發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞核內(nèi)除了上述3種RNA聚合酶外，還包含兩種特異性的RNA聚合酶，即RNA聚合酶 IV和RNA聚合酶 V。RNA聚合酶IV和RNA聚合酶V能夠促進(jìn)非編碼RNA的產(chǎn)生，并且這些非編碼RNA通過(guò)DNA甲基化（RdDM）途徑［2］對(duì)基因沉默發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

RNAP II在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮的作用最大，所以關(guān)于RNAP II轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究較多，這對(duì)于揭示真核生物生命活動(dòng)的分子基礎(chǔ)具有重要的生物學(xué)意義［3］。RNAP II在進(jìn)行高水平的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程中，通常需要一組轉(zhuǎn)錄因子（general transcription factors，GTFs）， 包 括 TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF和TFIIH來(lái)協(xié)調(diào)進(jìn)行［4］。在過(guò)去的幾十年里，人們針對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子的主要功能做了大量的研究，發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)錄因子都是以一種動(dòng)態(tài)結(jié)合和解離的方式來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄的發(fā)生［5］。那么RNAP II在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化又是怎樣呢？隨著單分子成像和標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，活細(xì)胞內(nèi)單個(gè)RNAP II分子的動(dòng)態(tài)研究得以實(shí)現(xiàn)并不斷的推進(jìn)。在活體胚胎干細(xì)胞內(nèi)，Cho等［6］觀察到RNAP II可以形成穩(wěn)定存在的、或者短暫存在的clusters團(tuán)簇結(jié)構(gòu)。同時(shí)，孫育杰課題組［7］也在哺乳動(dòng)物的活細(xì)胞核內(nèi)，首次原位觀察到了RNAP II clusters的動(dòng)態(tài)組裝和解聚過(guò)程。然而植物中關(guān)于RNAP II的活體動(dòng)態(tài)研究比較少，因此本文主要對(duì)真核生物RNAP II結(jié)構(gòu)和功能的研究進(jìn)行綜述，并重點(diǎn)總結(jié)動(dòng)物活細(xì)胞內(nèi)RNAP II的動(dòng)態(tài)標(biāo)記和成像技術(shù)的研究進(jìn)展，以期為植物活細(xì)胞內(nèi)觀察RNAP II動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄研究提供參考。

1 RNA聚合酶II的結(jié)構(gòu)

RNAP II被認(rèn)為是真核細(xì)胞RNA聚合酶家族中最活躍、最復(fù)雜的成員，它存在于細(xì)胞核的核質(zhì)內(nèi)，分子質(zhì)量為550 kD，由12個(gè)亞單位組成，并分別由RPB1-RPB12基因編碼［8］。這12個(gè)亞基在真核細(xì)胞中高度保守，并能分解成一個(gè)由10個(gè)亞基組成的核心酶和一個(gè)由Rpb4和Rpb7組成的二聚體。其中按照進(jìn)化的保守性以及在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的作用，又可以分為3類(lèi)：一類(lèi)是3種RNA聚合酶共同含有的亞基Rpb5、6、8、10和12；第二類(lèi)是與細(xì)菌RNA聚合酶高度保守的核心亞基Rpb1、2、3；第三類(lèi)是Rpb11以及Pol II特有的并且是轉(zhuǎn)錄起始所必需的亞基 Rpb4、7 和 9［9］。

Rpb1是RNAP II 的最大亞基，由于其具有催化活性，因此成為RNAP II 發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能的主要執(zhí)行者，它的羧基末端有一段特殊的結(jié)構(gòu)域CTD（carboxyl-terminal domain），在執(zhí)行轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用［10］。CTD具有高度保守的一致序列（Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser），是一段基本上無(wú)結(jié)構(gòu)的多肽鏈，并且在不同物種中的重復(fù)次數(shù)各不相同，如酵母中為26個(gè)重復(fù)，動(dòng)物和人類(lèi)中為52個(gè)重復(fù)，而植物中則有39個(gè)重復(fù)［11］。CTD的這種重復(fù)特性，能夠增加與之結(jié)合的蛋白數(shù)目，這對(duì)其功能的發(fā)揮產(chǎn)生直接的影響［12］。例如，在mRNA加工修飾的過(guò)程中，CTD結(jié)構(gòu)通過(guò)與加帽酶、剪接因子以及諸多聚尾因子的結(jié)合，從而直接參與調(diào)控這些復(fù)雜的加工反應(yīng)［13］。另外，CTD也會(huì)發(fā)生一系列修飾作用，譬如當(dāng)外界病原菌入侵時(shí)，擬南芥RNAP II的CTD上3個(gè)氨基酸殘基發(fā)生快速而短暫的磷酸化，為植物激活初級(jí)免疫應(yīng)答提供了一種快速途徑［14］。

2 RNA聚合酶II的功能

在真核生物中，RNAP II主要負(fù)責(zé)合成mRNA及大多數(shù)非編碼RNA［15］。在轉(zhuǎn)錄開(kāi)始時(shí)，RNAP II通過(guò)識(shí)別DNA上的核心啟動(dòng)子來(lái)決定轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)，同時(shí)轉(zhuǎn)錄因子也通過(guò)結(jié)合啟動(dòng)子中的順式元件來(lái)協(xié)同激活轉(zhuǎn)錄的起始［16］。在轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中，每一步都有轉(zhuǎn)錄輔激活因子的調(diào)節(jié)，也受到一些共同激活或抑制因子的調(diào)節(jié)，共同保證轉(zhuǎn)錄的正確延伸直到轉(zhuǎn)錄的結(jié)束［17］。植物中的轉(zhuǎn)錄過(guò)程（圖1）主要包括3個(gè)階段：轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄延伸和轉(zhuǎn)錄終止，具體的過(guò)程及RNAP II 在其中的作用如下。

圖1 RNAP II介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄過(guò)程Fig. 1 RNAP II mediated transcription

2.1 RNA聚合酶II與轉(zhuǎn)錄調(diào)控起始

轉(zhuǎn)錄起始是一個(gè)動(dòng)態(tài)協(xié)調(diào)的過(guò)程，也是轉(zhuǎn)錄發(fā)生過(guò)程中最關(guān)鍵的一個(gè)步驟［18］。在轉(zhuǎn)錄因子和中介體復(fù)合物（mediator complex）［19］的協(xié)助下，未經(jīng)任何修飾的RNAP II 被招募到啟動(dòng)子附近，形成轉(zhuǎn)錄預(yù)起始復(fù)合物（pre-initiation-complex，PIC）［20］。在ATP的作用下，DNA雙鏈被打開(kāi)，其中一條DNA模板鏈進(jìn)入RNAP II的活性位點(diǎn)，形成開(kāi)放復(fù)合物來(lái)激活轉(zhuǎn)錄的起始。緊接著在RNAP II酶的催化作用下，核苷三磷酸（NTPs）作為底物開(kāi)始合成mRNA的前體，標(biāo)志著轉(zhuǎn)錄起始的正常進(jìn)行［21］。通過(guò)單分子熒光成像技術(shù)觀測(cè)RNAP II—PIC的組裝過(guò)程發(fā)現(xiàn)，參與組裝的轉(zhuǎn)錄因子是通過(guò)一種短暫的、動(dòng)態(tài)的方式來(lái)參與轉(zhuǎn)錄的起始［22］。因此，轉(zhuǎn)錄起始是由RNAP II和多種轉(zhuǎn)錄因子共同參與的動(dòng)態(tài)調(diào)控過(guò)程。

在轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中，RNAP II的CTD磷酸化修飾起到了“開(kāi)關(guān)”的作用。在轉(zhuǎn)錄初期，轉(zhuǎn)錄因子TFIIH使CTD的兩個(gè)氨基酸殘基（Ser5和Ser7）發(fā)生磷酸化修飾［23］。與動(dòng)物不同的是，CDKF；1（CYCLIN-DEPENDENT KINASE F；1）是植物中特有的激酶，它可以特異性地磷酸化氨基酸殘基（Ser7）［24］。其中Ser5的磷酸化狀態(tài)會(huì)解除RNAP II和轉(zhuǎn)錄因子之間的結(jié)合，使RNAP II成功離開(kāi)啟動(dòng)子區(qū)域，從而進(jìn)入轉(zhuǎn)錄延伸的階段［25］。因此，未經(jīng)修飾的RNAP II主要參與轉(zhuǎn)錄初始階段，而磷酸化的RNAP II主要在轉(zhuǎn)錄延伸階段發(fā)揮作用。

2.2 RNA聚合酶II與轉(zhuǎn)錄延伸

RNAP II離開(kāi)啟動(dòng)子并開(kāi)始合成RNA時(shí)，即進(jìn)入了轉(zhuǎn)錄延伸階段［26］。在早期延伸過(guò)程中，RNAP II在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（transcription start site，TSS）下游20-100 bp處會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)錄暫停。轉(zhuǎn)錄暫?，F(xiàn)象既是轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的限速步驟，也是發(fā)生在早期延伸和生產(chǎn)性延伸之間的過(guò)渡階段。當(dāng)負(fù)轉(zhuǎn)錄延伸因子（negative elongation factor，NELF）和DRB敏感誘導(dǎo)因子（DRB-sensitivity-inducing factor，DSIF）與RNAP II結(jié)合時(shí)，會(huì)引起RNAP II 的轉(zhuǎn)錄暫停；而當(dāng)正轉(zhuǎn)錄延伸因子B（positive transcription elongation factor b，P-TEFb）［27］磷 酸 化 NELF 和DSIF時(shí)，負(fù)轉(zhuǎn)錄延伸因子轉(zhuǎn)化為正轉(zhuǎn)錄延伸因子，就會(huì)觸發(fā)RNAP II 轉(zhuǎn)錄的再次啟動(dòng)［28］。

轉(zhuǎn)錄延伸過(guò)程中RNAP II的CTD氨基酸殘基Ser2可以被P-TEFb磷酸化，來(lái)招募其他轉(zhuǎn)錄延伸因子和染色質(zhì)修飾因子，并且CTD的另外兩個(gè)氨基酸殘基Ser5和Ser7在磷酸酶的作用下會(huì)逐漸脫磷酸化?？傊?，在RNAP II的CTD氨基酸殘基Ser2的磷酸化狀態(tài)和Ser5、Ser7的去磷酸化狀態(tài)的共同作用下，轉(zhuǎn)錄的延伸過(guò)程進(jìn)入生產(chǎn)性延伸階段［29］。因此，RNAP II的CTD磷酸化狀態(tài)明顯影響轉(zhuǎn)錄延伸的進(jìn)程，但反過(guò)來(lái)轉(zhuǎn)錄延伸的過(guò)程是否也會(huì)影響CTD的磷酸化修飾，以及CTD狀態(tài)的轉(zhuǎn)變?yōu)槭裁窗l(fā)生在轉(zhuǎn)錄的特定延伸階段，這些問(wèn)題仍需進(jìn)一步的研究來(lái)解釋。

2.3 RNA聚合酶II與轉(zhuǎn)錄終止

當(dāng)轉(zhuǎn)錄延伸遇到終止子時(shí)，RNAP II在解旋酶的作用下從DNA模板上解離，發(fā)生轉(zhuǎn)錄終止［30］。RNAP II介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄終止是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，大多數(shù)mRNA轉(zhuǎn)錄終止依賴(lài)于多聚腺苷酸（Poly A）位點(diǎn)，并且受到RNAP II的CTD磷酸化狀態(tài)的調(diào)控［31］。在轉(zhuǎn)錄終止時(shí)，RNAP II的CTD氨基酸殘基Ser2的磷酸化水平達(dá)到最高，而另一個(gè)氨基酸殘基Ser5的磷酸化水平逐漸降低。因此，RNAP II的CTD磷酸化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，會(huì)促使Poly A位點(diǎn)上招募到新的轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致RNAP II轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的構(gòu)象發(fā)生變化［32］，而從RNA-DNA雜合鏈上解離下來(lái)，至此一次完整的轉(zhuǎn)錄過(guò)程發(fā)生終止。另外在轉(zhuǎn)錄終止時(shí)，RNAP II在磷酸酶的作用下發(fā)生去磷酸化［33］，產(chǎn)生非磷酸化修飾的RNAP II，從而可以參與到下一輪的轉(zhuǎn)錄循環(huán)反應(yīng)中。

3 RNA聚合酶II標(biāo)記及成像技術(shù)

RNAP II的結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)被廣泛研究，然而關(guān)于活細(xì)胞內(nèi)是如何調(diào)控轉(zhuǎn)錄過(guò)程，以及它的動(dòng)態(tài)特征是怎樣的，這些問(wèn)題目前仍不清晰。近年來(lái)，隨著活體熒光標(biāo)記技術(shù)和超分辨率成像技術(shù)的發(fā)展，研究人員可以實(shí)時(shí)的追蹤RNAP II的動(dòng)態(tài)過(guò)程，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)RNAP II的高時(shí)空動(dòng)態(tài)成像與觀察［34］。下面對(duì)這些標(biāo)記和成像技術(shù)進(jìn)行介紹。

3.1 RNA聚合酶II標(biāo)記技術(shù)

熒光標(biāo)記技術(shù)是指將不同的熒光探針特異性地連接到目標(biāo)分子上的一種技術(shù)，常用的熒光探針包括：有機(jī)染料、熒光納米晶體和熒光蛋白等［35］。其中熒光蛋白指的是帶有熒光基團(tuán)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，它通過(guò)對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行特異性地標(biāo)記［36］，是目前熒光標(biāo)記中最常用的手段。綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）［37］及其他顏色的熒光蛋白［38］由于穩(wěn)定性強(qiáng)和亮度高的優(yōu)點(diǎn)，受到了研究人員的青睞并實(shí)現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用。但新型超高分辨率技術(shù)的發(fā)展，對(duì)熒光蛋白的選擇產(chǎn)生了更高的需求，亟需更亮、更穩(wěn)定的熒光蛋白作為標(biāo)簽。光激活（photoactivatable fluorescent proteins，PAFPs）、光轉(zhuǎn) 化（photoconvertible fluorescent proteins，PCFPs）、光開(kāi)關(guān)（photoswitchable fluorescent proteins，PSFPs）熒光蛋白等的出現(xiàn)，不僅提高了顯微觀察的精準(zhǔn)性，也極大地推動(dòng)了活細(xì)胞成像技術(shù)的發(fā)展［39］。

之前對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究中，研究者通常選擇熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）［40］來(lái)進(jìn)行，它能夠同時(shí)識(shí)別特定的基因和轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)并進(jìn)行標(biāo)記。但是這一技術(shù)需要將細(xì)胞固定，而固定后的“死細(xì)胞”獲得的結(jié)果與活細(xì)胞中的結(jié)果有很大的不同，固定后的“死細(xì)胞”不能反映植物細(xì)胞感受外界信號(hào)后的真實(shí)轉(zhuǎn)錄情況，因而無(wú)法獲取動(dòng)態(tài)變化的準(zhǔn)確信息。在這個(gè)過(guò)程中，基因編輯技術(shù)如CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated protein 9）和自我標(biāo)記蛋白（self-labeling proteins，SLPs）技術(shù)是目前非常有用的技術(shù)手段。

CRISPR/Cas9是一種基因靶向編輯技術(shù)，它可以將編碼熒光蛋白的基因序列插入到基因組的特定位置，來(lái)實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄的可視化［41］。CRISPR/Cas9技術(shù)由Cas9核酸酶和單鏈引導(dǎo)RNA（single guide RNA，sgRNA）兩部分組成，Cas9核酸酶在sgRNA的指導(dǎo)下，可以靶向切割目的基因，再利用同源DNA修復(fù)技術(shù)完成對(duì)該目的基因的編輯和重組。研究者通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)，利用光轉(zhuǎn)換熒光蛋白（Dendra2）對(duì)小鼠胚胎細(xì)胞的內(nèi)源性RNAP II進(jìn)行特異性標(biāo)記，觀察到活細(xì)胞核內(nèi)RNAP II團(tuán)簇的存在，并且其壽命非常的短暫（約為8 s）［42］，這一結(jié)果與之前標(biāo)記外源性RNAP II的觀察結(jié)果相一致。因此，CRISPR/Cas9是一種強(qiáng)大且精細(xì)的工具，通過(guò)基因工程技術(shù)將熒光蛋白敲進(jìn)內(nèi)源基因以使融合蛋白在生理相關(guān)水平上表達(dá)。同時(shí)由于該技術(shù)具有易于設(shè)計(jì)、載體構(gòu)建簡(jiǎn)單、實(shí)施快捷和成本低的優(yōu)點(diǎn)，在生物學(xué)領(lǐng)域里的多個(gè)物種中［43］都得到了廣泛的應(yīng)用，但CRISPR/Cas9方法在應(yīng)用的過(guò)程中仍然存在脫靶［44］的問(wèn)題，還需不斷改進(jìn)。

SLPs技 術(shù)（ 如 Halo-Tag和 SNAP-Tag）［45］通過(guò)一種共價(jià)結(jié)合的方式讓目標(biāo)蛋白攜帶上熒光標(biāo)簽，共價(jià)鍵具有不可逆、穩(wěn)定性強(qiáng)、特異性高等特點(diǎn)，是研究活細(xì)胞蛋白追蹤的首選技術(shù)。常用的一些標(biāo)簽包括 HaloTag、SnapTag、CLIPtag和TMPTag，都可以通過(guò)遺傳編碼的方法與目標(biāo)蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，并且這些標(biāo)簽可以催化有機(jī)染料標(biāo)記的小分子底物共價(jià)連接到目標(biāo)蛋白［46］。在小分子透膜染料中，janelia fluor（JF）系列的染料表現(xiàn)最佳［47］，如JF549、JF646、PA-JF549及PA-JF646等，在近期的單分子成像領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。例如在一項(xiàng)最近的研究中，Cho［6］等分別用 JF646-Halotag和Dendra2來(lái)標(biāo)記轉(zhuǎn)錄因子Mediator和RNAP II，雙色光片顯微成像顯示活體細(xì)胞核內(nèi)有大量聚集的雙色亮點(diǎn)，并且通過(guò)量化分析發(fā)現(xiàn)，Mediator和RNAP II團(tuán)簇共定位比例達(dá)到90%。另外，在植物研究應(yīng)用方面，利用一種新開(kāi)發(fā)的Halo-Tag可編輯技術(shù)［48］，來(lái)探索轉(zhuǎn)錄因子和蛋白之間的相互作用，這使得許多新的轉(zhuǎn)錄因子被識(shí)別和研究（圖2）。

圖2 CRISPR/Cas9和SLPs技術(shù)標(biāo)記目標(biāo)分子的示意圖Fig. 2 The schematic of CRISPR/Cas9 and SLPs

3.2 RNA聚合酶II成像技術(shù)

自20世紀(jì)以來(lái)，超高分辨顯微技術(shù)的快速發(fā)展使光學(xué)成像有了很大突破，能將衍射極限達(dá)到200 nm以下，并且實(shí)現(xiàn)了三維、高速的活體成像［49］，可以在單分子水平上直接觀察目標(biāo)蛋白的動(dòng)態(tài)特征。與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡相比，超高分辨率技術(shù)能夠?qū)⒎直媛侍岣呓?0倍，這就使亞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)得到前所未有的可視化［50］，但不同的研究問(wèn)題需要不同的成像技術(shù)作為最優(yōu)的解決方案。因此，為了方便研究者技術(shù)的選擇，我們概述了幾種目前可用于生命科學(xué)研究的顯微技術(shù)［51］，并總結(jié)了不同顯微技術(shù)的主要優(yōu)缺點(diǎn)，如表1所示。

下面對(duì)這幾種技術(shù)在RNAP II動(dòng)態(tài)研究中的應(yīng)用進(jìn)行介紹。

單分子定位的顯微技術(shù)，如光激活定位（photo activated localization microscopy，PALM）和隨機(jī)光學(xué) 重 構(gòu)（stochastic optical reconstruction microscopy，STORM）顯微技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)30 nm的空間分辨率和10 μm的成像深度，設(shè)備價(jià)格也中等，并且它們成像原理基本相同，都是利用熒光分子的特性和單分子定位的精準(zhǔn)度，通過(guò)獲取多張圖片進(jìn)而重構(gòu)出一幅超分辨圖像；區(qū)別在于STORM技術(shù)是利用熒光探針等技術(shù)來(lái)標(biāo)記目標(biāo)蛋白［52］，而PALM技術(shù)則是利用融合表達(dá)的熒光蛋白來(lái)進(jìn)行標(biāo)記的，因此PALM技術(shù)更適合于活細(xì)胞內(nèi)的蛋白成像。在活體胚胎細(xì)胞核內(nèi)，研究者就利用PALM超分辨成像技術(shù)揭示了RNAP II的動(dòng)態(tài)特征，表明內(nèi)源性的RNAP II是以瞬時(shí)的團(tuán)簇形式存在的［42］。同樣通過(guò)PALM技術(shù)，Cisse等［34］觀察到了RNAP II團(tuán)簇的組裝過(guò)程，但對(duì)于RNAP II團(tuán)簇是否發(fā)生解聚過(guò)程仍不清楚。但無(wú)論是STORM還是PALM技術(shù)，都是利用“時(shí)間換空間”的方法來(lái)提高成像分辨率，這也就限制了它們的時(shí)間分辨率，不適合應(yīng)用于分子的長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)觀察。

表1 不同顯微技術(shù)的主要優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 Major merits and demerits of different microscopic technique

受激發(fā)射損耗技術(shù)（stimulated emission depletion，STED）及其它衍生方法，它作為共聚焦顯微裝置的附加模式，通常是比較容易操作的一項(xiàng)技術(shù)。STED的原理是利用兩束光源，其中激發(fā)光照射目標(biāo)區(qū)域發(fā)出熒光，而損耗光則會(huì)將目標(biāo)樣品以外的熒光淬滅，從而達(dá)到有效熒光發(fā)光面積的最小化［53］，所以STED技術(shù)將光學(xué)顯微鏡的分辨率提高了近10倍。另外，Wildanger等［54］通過(guò)引入3D STED，又實(shí)現(xiàn)了3個(gè)方向上超分辨率的提升。在最近的一項(xiàng)研究中，Li等［55］利用3D STED技術(shù)來(lái)實(shí)時(shí)成像、追蹤和定量分析活細(xì)胞內(nèi)的RNAP II分子，觀察其在轉(zhuǎn)錄周期中的動(dòng)態(tài)變化，從而為揭示RNAP II的動(dòng)力學(xué)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控之間的聯(lián)系奠定基礎(chǔ)。但是，STED技術(shù)也有很多缺陷，如STED技術(shù)不適用于大的樣品，并且會(huì)對(duì)樣品產(chǎn)生光毒害等，最重要的是設(shè)備的價(jià)格非常昂貴等。

光片熒光顯微鏡（light sheet fluorescence microscopy，LSFM）是一種適用于大型樣品成像的新型顯微系統(tǒng)［56］。LSFM雖然局限于傳統(tǒng)的分辨率，但通過(guò)與其他超高分辨率技術(shù)的結(jié)合，如LSFM與結(jié)構(gòu)光照明（structured illumination microscopy，SIM）顯微技術(shù)結(jié)合而發(fā)展出的貝塞爾光束照明技術(shù)（bessel beam illumination microscopy）和晶格光片顯微術(shù)（lattice Light-Sheet Microscopy，LLS），成為一種廣受歡迎的成像顯微技術(shù)。該顯微技術(shù)采用薄片光進(jìn)行側(cè)向照明，并在垂直方向上探測(cè)成像，不僅成像速度非?？?、光毒性低、信噪比高，而且可以對(duì)活體樣本進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的三維成像［57］。Zhao等［58］利用LSFM技術(shù)觀測(cè)了哺乳動(dòng)物活細(xì)胞核中RNAP II分子的動(dòng)態(tài)，結(jié)果顯示大多數(shù)（＞70%）的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)來(lái)源于單個(gè)RNAP II分子，并且未檢測(cè)到RNAP II分子之間發(fā)生顯著的聚類(lèi)反應(yīng)。而在Cho等［36］研究中，通過(guò)LSFM成像顯示小鼠胚胎干細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)大量RNAP II聚集的現(xiàn)象，進(jìn)一步分析顯示這些RNAP II分子有兩種存在形式，分別可以形成小的、瞬時(shí)的團(tuán)簇和較大的、穩(wěn)定的團(tuán)簇。當(dāng)然，LSM也有其自身的局限性，如設(shè)備價(jià)格非常昂貴、橫向分辨率較低，后期的大數(shù)據(jù)處理也比較困難等［59］。如何與其它超高分辨率顯微技術(shù)更好的融合，將是LSFM未來(lái)研究的主要方向。

貝葉斯納米顯微技術(shù)（bayesian nanoscopy）就是一個(gè)將LSFM與超分辨顯微技術(shù)結(jié)合的典型例子，已經(jīng)發(fā)展成為一種新型快速成像方法［60］。貝葉斯算法是利用大量熒光分子的閃爍和漂白信息來(lái)還原樣品的結(jié)構(gòu)，通過(guò)將高斯光片照明引入到貝葉斯算法中［61］，發(fā)展出一種新型的貝葉斯納米顯微技術(shù)。該技術(shù)有效地提高了顯微成像的時(shí)空分辨率（50 nm的空間分辨率和4 s的時(shí)間分辨率），并大大減少了對(duì)樣品的光毒性。Chen等［7］利用貝葉斯納米顯微技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，觀察到活細(xì)胞核中RNAP II分子的空間結(jié)構(gòu)為不規(guī)則的球狀幾何形式，并揭示了RNAP II分子的動(dòng)態(tài)組裝和解聚過(guò)程。雖然貝葉斯納米顯微技術(shù)也存在局限性，比如不適合長(zhǎng)期觀察活細(xì)胞內(nèi)的分子動(dòng)態(tài)［57］，但此方法是目前為止研究活體細(xì)胞內(nèi)RNAP II分子動(dòng)力學(xué)的最佳選擇。

4 展望

綜上所述，RNAP II的動(dòng)力學(xué)、聚類(lèi)反應(yīng)及與轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，對(duì)于揭示真核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有重要的意義。近年來(lái)，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室在活細(xì)胞熒光成像和分子標(biāo)記技術(shù)的研究中取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，為實(shí)現(xiàn)在單分子水平上直接觀察RNAP II的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄奠定了基礎(chǔ)。例如，研究者可以選擇CRISPR/Cas9或SLPs標(biāo)記技術(shù)使目標(biāo)分子攜帶熒光標(biāo)簽，再通過(guò)LSFM與超分辨顯微技術(shù)結(jié)合的方法來(lái)實(shí)時(shí)成像和追蹤目標(biāo)分子，這樣就使得活體細(xì)胞內(nèi)的分子動(dòng)態(tài)行為變得可視化。與動(dòng)物細(xì)胞相比，植物的細(xì)胞存在細(xì)胞壁、葉綠體等物質(zhì)極大的限制了植物細(xì)胞的活體成像，并且植物細(xì)胞也無(wú)法像動(dòng)物細(xì)胞一樣進(jìn)行貼壁生長(zhǎng)，這無(wú)疑對(duì)植物細(xì)胞的活體成像觀察提出了更大的挑戰(zhàn)，所以目前關(guān)于植物RNAP II的活體動(dòng)態(tài)研究甚少，其響應(yīng)不同生理?xiàng)l件下的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制也尚不清晰。因此，植物活體細(xì)胞內(nèi)RNAP II動(dòng)態(tài)調(diào)控轉(zhuǎn)錄是今后重點(diǎn)關(guān)注的方向，這也將會(huì)為揭示真核生物的轉(zhuǎn)錄機(jī)制帶來(lái)更多的啟示。