李家俊 鄭瀟 盛杰 徐瑤

（武漢科技大學生命科學與健康學院 生物醫(yī)學研究院，武漢 430081）

2019年12月，一種新型冠狀病毒引起的肺炎在武漢爆發(fā)、流行，研究顯示新冠病毒具有人傳人的能力［1］，且傳播能力強，R0約為 2.2［2］。2020 年1月12日，世界衛(wèi)生組織將2019新型冠狀病毒命名為2019-nCoV（后更名為COVID-19），2月11日，國際病毒分類委員會將新冠病毒命名為SARS-CoV-2（severe acute respiratory syndrome coronavirus2）。該病作為急性呼吸道傳染病已納入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病，并采取甲類傳染病的預防、控制措施。據新華網報道，截至7月24日，中國本土累計確診病例86 500例，治愈80 738例，死亡4 656例，世界范圍更是確診超過1 500萬例，新冠病毒對全球公共衛(wèi)生安全構成了巨大威脅。準確快速確診新冠肺炎對于防控疫情，病患的及時合理治療非常關鍵。本文綜述了新型冠狀病毒的病原學特點與檢測方法的研究進展，簡要介紹了檢測技術的原理和應用現狀，旨在為新冠肺炎的臨床準確診斷及疫情防控提供一些幫助。

1 病原學特點

SARS-CoV-2是發(fā)現的第7種β屬冠狀病毒［3］，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60-140 nm（圖1）。SARS-CoV-2遺傳物質為單股正鏈RNA，基因組大小約為30 kb，為已知基因組最大的RNA病毒，具有5′帽結構和3′PolyA尾巴結構，轉錄模式同2012年的SARS-CoV相似。SARS-CoV-2含有14個ORF共編碼27種蛋白質，5′端為一個約占基因組2/3的開放閱讀框架ORF1ab，編碼一個多肽蛋白，在一些病毒自身編碼的蛋白酶作用下加工裂解成15種非結構蛋白，如RdRP和解旋酶?？拷?′端約占基因組1/3的ORF編碼至少4種結構蛋白，特異性結合宿主細胞受體的棘突蛋白（S），包膜形成相關的膜蛋白（M）、包膜蛋白（E），病毒組裝相關的核衣殼蛋白（N），輔助類蛋白基因分布在結構蛋白基因之間［3-5］。

圖1 新冠病毒結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of the novel coronavirus structure

目前研究顯示與蝙蝠SARS樣冠狀病毒（bat-SLCoVZC45）同源性達85%以上。體外分離培養(yǎng)時，2019-nCoV 96 h左右即可在人呼吸道上皮細胞內發(fā)現，而在Vero E6和Huh 7細胞系中分離培養(yǎng)需約6 d。新型冠狀病毒對紫外線和熱敏感，56℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，氯己定不能有效滅活病毒［6］。

Hoffman和Zhou等［7-8］分別通過病侵染細胞試驗，證實了SARS-CoV-2使用血管緊張素轉換酶ACE2作為S蛋白受體進入細胞，Xu［9］利用模型模擬結合計算發(fā)現S蛋白與ACE2有很強的結合能-50.6 kcal/mol。ACE2蛋白在多種組織都存在低表達［10］，但主要分布在肺泡上皮細胞和小腸上皮細胞等上皮細胞腔面。ACE2作為受體蛋白與病毒一起被內吞進入細胞，導致細胞表面ACE2蛋白酶的減少，破壞了患者腎素-血管緊張素系統(tǒng)失衡，使得本身有基礎疾病如糖尿病、高血壓和心血管等患者感染后病情較重［11-13］。下呼吸道的病毒含量高于上呼吸道，呼吸道檢出率又高于血液。臨床上取樣優(yōu)先度，首先是下呼吸道樣本肺泡灌洗液、支氣管灌洗液，其次是深咳痰，接著是鼻咽部，最后是口咽部［14］。依據臨床取樣難度和患者接受程度，目前臨床最常用的標本是口咽拭子，其次是鼻咽拭子。重癥病例優(yōu)先采集下呼吸道標本（如支氣管或肺泡灌洗液、肺組織活檢標本等）。部分患者的檢測結果顯示糞便樣本與常用的咽拭子樣本具有同樣甚至更高的準確性［15］，同時檢測兩份以上不同部位的樣本可以增加核酸檢出率。

2 檢測方法

病毒感染的實驗室檢查包括病毒分離與鑒定、病毒核酸檢測以及特異性抗體的檢測。

2.1 病毒實驗室分離與鑒定

病毒培養(yǎng)、分離與鑒定是實驗室鑒定病原體的金標準。Zhu等［16］將從3例患者的支氣管肺泡灌洗液分離到的病毒接種至人上皮細胞、Vero E6和Huh-7細胞株，96 h后在人氣道上皮細胞表層觀察到細胞病變，6 d后可以在Vero E6和Huh-7細胞株中觀察到病變。分離的病毒顆粒在透射電鏡下可以觀察到冠狀病毒日冕等獨特結構。分離純化病毒為今后病毒生物學特征、致病機理研究、疫苗研發(fā)、抗病毒特效藥的研究奠定了基礎。但由于病毒的培養(yǎng)時間較長，技術要求較高，且必須在三級安全的生物實驗室內進行，所以在疫情期間并不適合用于SARS-CoV-2的快速診斷。

2.2 核酸檢測

2.2.1 高通量測序 《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第七版）》中確診依據之一就是“病毒基因測序，與已知的新型冠狀病毒高度同源”。面對新型冠狀病毒引起的疫情，對病毒全基因組測序可以幫助人們了解病毒的遺傳信息，研究病毒進化與變異［17］，解釋病毒毒力來源，病毒追蹤和溯源分析，為特異性的檢測試劑盒、疫苗研發(fā)提供支持。疫情爆發(fā)后，多個研究團隊［18-20］利用宏轉錄組測序技術確定了病毒的基因組，比較了不同冠狀病毒的異同，并對病毒基因組做了詳細系統(tǒng)發(fā)育樹分析，及時與多數據信息平臺分享，為各國疫情防控提供了數據支持。Wang等［21］建立了第三代測序納米孔靶向測序技術，可在6-10 h內同時檢測SARS-CoV-2和其他呼吸道病毒。高通量測序技術優(yōu)勢在于高準確性，高通量、高靈敏，檢驗RT-PCR灰度可疑區(qū)的結果，避免RT-PCR由于樣本病毒低載量問題、引物或探針結合區(qū)存在突變位點導致的假陰性結果［22］，同時還可以鑒定出其他的致病病原體，但由于檢測成本較高，檢測時間較長，且需要專業(yè)生物信息人員對測序結果進行解讀，所以不適合用于疫情高發(fā)期間臨床快速大規(guī)模檢測。

2.2.2 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）按原理主要分為兩類（圖2），一類是通過嵌入式染料（如SYBR Green）在PCR擴增反應過程中與擴增產生的雙鏈DNA結合，發(fā)射熒光信號，實現對PCR產物的實時定量檢測。另一種則通過熒光基團標記探針進行實時檢測，探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5′-3′外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。熒光探針法特異性較高，探針可根據不同需求靈活設計，區(qū)分常見的冠狀病毒，對多個靶標同時進行檢測提高準確性同時防止漏檢，所以目前多數使用的都是熒光探針法。進一步說RTPCR分為一步法和兩步法，一步法相較兩步法而言，操作簡易快速，反轉錄與PCR擴增檢測過程不相互獨立，提高樣本反應濃度，減少開蓋次數有助于降低樣本與環(huán)境污染，因而多采用一步法。Corman等［23］使用熒光探針RT-qPCR法檢測新冠病毒ORF1ab、E、N三個靶標，再另外設計1條探針，用于區(qū)分2019-nCoV、SARS-CoV及bat-SAR的RdRP靶標。RT-PCR因其快速簡便、成本低、特異性高等特點是疫情期間使用最多最廣泛的核酸檢測方法，但檢測結果容易受到諸多因素影響而變成假陰性，應多次檢測，確保結果的準確性。

目前國家藥監(jiān)局批準了16種基于熒光PCR方法的新型冠狀病毒檢測試劑盒（表1），檢測靶標涉及ORF1ab、N、E三個基因，檢測靶標至少應包括最為保守特異的ORF1ab區(qū)域。

圖2 兩種熒光PCR示意圖Fig.2 Schematic diagram of two quantitative real-time PCR

新冠病毒核酸檢測的陽性樣本檢出率僅有30%-50%［24］，導致檢出率低的原因大致可分為以下幾類，可參考相應的對策解決。（1）用于檢測的樣本不合格，樣本收集的過早或過晚，樣本采集保存運輸滅活方式不合適，樣本采集部位不同等原因導致的樣本病毒載量不高，達不到檢出限。在采集樣本時應盡量多收集各個部位的樣本混樣或者同時檢測，嚴格按照標準進行樣本采集、處理和轉運。Yang等［25］對6例新冠肺炎患者的鼻拭子、咽拭子、痰液和支氣管肺泡灌洗液進行檢測率比較發(fā)現，除支氣管肺泡灌洗液（BALF）外，痰標本陽性率最高（74.4%-88.9%）；其次為鼻拭子（53.6%-73.3%）。也有報道［26］患者糞便標本病原核酸檢測轉為陰性時間遠晚于呼吸道病原核酸檢測，提示可以參考糞便樣本檢測結果。（2）檢測試劑盒本身沒有經過大量臨床樣本優(yōu)化，選用經測試過包含多靶標的的試劑盒。郭元元等［27］對6種國產新型冠狀病毒核酸檢測試劑檢測性能比較發(fā)現，不同試劑陽性檢出率不一致，重復率也不一致。靶標不一樣，檢出率也不一樣，N亞基因拷貝數多于ORF1a/b基因，但保守程度不及ORF1a/b，導致N基因擴增陽性而ORF1a/b基因陰性［28］。（3）技術本身存在局限性使得靈敏度不高，更換更靈敏的方法檢測。（4）檢測結果判讀困難，背景信號很強導致擴增曲線基線不準，一些灰度區(qū)的判讀。重新實驗，增加陰性、陽性和內標質控對照，以監(jiān)測各個環(huán)節(jié)有無異常，增加可信度。（5）病毒已經發(fā)生了變異，引物結合區(qū)存在突變位點，更換試劑盒或檢測方法。

2.2.3 實時熒光定量數字PCR（real time digital PCR，RT-dPCR） 樣本病毒載量過低是導致RT-qPCR檢出率低的一大方面原因，RT-PCR檢測原理決定了大多試劑盒的檢測靈敏度介于100-500拷貝。數字PCR是一種核酸分子絕對定量技術，采用微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散數萬個微滴或芯片中，每個微滴反應中的核酸模板數少于等于1個。擴增完成后，只有含有核酸分子模板的微滴反應才會發(fā)出熒光信號，熒光收集后，分析軟件根據泊松分布原理及陽性反應比例計算給出待檢靶分子的濃度或拷貝數。新冠肺炎病患出院的標準之一，兩次以上核酸檢測為陰性，但常有患者連續(xù)檢測結果呈陰性，卻在后來被證實為陽性的報道，建議RT-dPCR作為現行標準的補充［29］，對即將出院的患者進行結果確認，有利于降低SARS-CoV-2疫情和社會恐慌的風險。RT-dPCR具有高靈敏度，高特異性和低檢測線等優(yōu)點［30］，能簡化判讀，分析成分復雜樣本，但由于配套試劑及設備昂貴、成本較高操作復雜、通量小易受污染等缺點，使得應用受限。

2.2.4 等溫擴增技術 傳統(tǒng)的體外核酸擴增技術需要精準控制溫度升降，且耗時較長（1-2 h），對樣本及實驗設備環(huán)境要求高，難以實現現場快速檢測。20世紀90年代以來，相繼誕生了十幾種等溫擴增技術，特點是能夠在固定反應溫度下實現核酸的快速擴增和檢測。這里主要介紹RT-LAMP、RTRPA、恒溫擴增芯片3種等溫擴增技術在新冠肺炎檢測中的應用，其他常見的等溫擴增技術如依賴核酸序列擴增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、依賴解旋酶擴增（Helicase-dependent amplification，HDA）還未見有相關報道。

2.2.4.1 環(huán)介導等溫擴增 環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是在2000年由Notomi［31］首次提出，它在等溫條件下擴增DNA，具有高特異性、高效率、快速和低成本特點，1 h內可擴增109倍。LAMP體系不同于一般的擴增反應體系，它利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，以及一對特殊設計的外部引物和一對內部引物，使得能夠擴增形成具有特殊環(huán)狀結構的DNA鏈，環(huán)狀結構存在內部引物的結合區(qū)，每經過一個擴增循環(huán)，環(huán)狀結構就多了一倍，從而實現DNA的快速擴

增。隨后在2002年，Nagamine等［32］改進了此種方法，增加一對環(huán)狀引物，將擴增時間縮短了一倍。LAMP最大的優(yōu)點是檢測可視化。伴隨著DNA迅速擴增，大量焦磷酸從底物dNTP中釋放出來，焦磷酸與溶液中的鎂離子反應，產生大量白色的焦磷酸鎂沉淀，溶液發(fā)生pH、鎂離子濃度、核酸含量和渾濁度4種變化。渾濁度可肉眼判斷［33］，pH變化可用pH敏感的染料通過顏色的改變讀出擴增反應結果［34］，由于可能存在非特異性擴增序列，因此通過渾濁度及顏色檢測結果并不十分準確，可結合熒光探針提高檢測特異性的方法解決這一問題［35］。核酸含量變化可使用安全靈敏的核酸染料GeneFinder，在藍光照射下，100 copies/μL的陽性反應即可肉眼觀察到清晰的綠色熒光，而陰性對照則保持粉紅色［36］。鎂離子濃度變化可通過添加鈣黃綠素實時監(jiān)測離子濃度變化［37］，可以肉眼觀察到從橙色到綠色的顏色變化的陽性反應。LAMP反應靈敏度高，擴增迅速，可用于即時檢測，但易受到污染影響，引物設計復雜，需要有一定經驗技術人員操作。

表1 國家藥監(jiān)局新型冠狀病毒檢測試劑注冊信息Table 1 Registration information of novel coronavirus detection reagent in the National Medical Prodical Products Administration

2.2.4.2 重組酶聚合酶擴增 重組酶聚合酶擴增技術（recombinase polymerase amplification，RPA） 是一種核酸恒溫擴增技術，具有靈敏度高、特異性強、無需對樣品進行復雜處理等特點。RPA技術利用3種在常溫下仍具有活性的蛋白：結合單鏈核酸的重組酶，單鏈DNA結合蛋白SSB和鏈置換DNA聚合酶。重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能夠幫助引物定位在雙鏈DNA中同源序列，形成一個D環(huán)結構，然后鏈置換酶替換下DNA鏈，被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進一步替換，聚合酶啟動DNA鏈延伸的同時繼續(xù)打開模板DNA雙螺旋，整個過程十分迅速，一般可在十分鐘之內獲得檢出水平的擴增產物，支持對樣品進行多重化定量分析。在RPA體系中加入反轉錄重組聚合酶，即能實現RNA的擴增。產物的檢測有多種方式，包括凝膠電泳、實時熒光定量、測流層析試紙等。RT-RPA能夠在檢測新冠病毒的同時快速區(qū)分多種常見的呼吸道病毒核酸［38］，在食品衛(wèi)生方面也同樣能發(fā)揮作用［39］，且特異性良好，與一般病毒無交叉反應。RPA能在常溫條件下靈敏擴增，無需任何儀器，試劑凍干形式保存期長，檢測極限低，但由于引物長度需要30-35 bp，所以并不適合較短的靶序列擴增。

2.2.4.3 恒溫擴增芯片 恒溫擴增芯片法的特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4對特異性物，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下經過非循環(huán)起始階段、環(huán)擴增階段、循環(huán)延伸階段，最終形成一系列有多個靶 DNA反向重復序列串聯的不同大小的產物，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等步驟，整過程15-60 min即可完成［40］。恒溫芯片擴增法檢測也存在一些局限，它只是針對某一些病原體的檢測，往往會遺漏一些少見致病性病原體的檢出。3月26日，“6項呼吸道病毒核酸檢測芯片試劑盒”獲得國家藥監(jiān)局批準上市，該試劑盒能在1.5 h內檢測包括新型冠狀病毒（2019-nCoV）在內的6項呼吸道病毒。

2.2.4.4 基于Cas酶的檢測技術 CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一種強大的基因編輯工具，同樣可以應用在核酸檢測上。SHERLOCK（specific high sensity enzymatic reporter unlock）技術是 2017年張鋒［41］教授團隊開發(fā)的一種基于CRISPR靶向RNA的核酸檢測方法。方法原理，Cas13a在crRNA引導下檢測到目標RNA序列，則會激活一種非特異性的dsRNA酶切割活性，能夠切割體系中的RNA報告分子，熒光基團與淬滅基團分離，檢測到釋放出的熒光信號，與RT-RPA擴增技術、T7轉錄技術結合靈敏度可達渺摩爾級別，特異性精確到單堿基。之后張峰對SHERLOCK進行改進，使之能夠針對不同靶點進行多重檢測，結合Cas13和一種輔助CRISPR相關酶Csm6，靈敏度提高3.5倍，達到2個渺摩爾［42］。同年，5月6日，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準了一款基于SHERLOCK技術的新冠病毒檢測試劑盒，據研發(fā)公司稱檢測可以在大約1 h后返回結果。同樣基于CRISPR的檢測技術還有DETECTR，類似于SHERLOCK工作原理，不同的是DETECTR技術使用的非特異性核酸酶為Cas12a，Cas12a檢測識別DNA而不是RNA，因此在檢測新冠病毒時需增加反轉錄步驟。Broughton等［43］開發(fā)了一種基于DETECTR技術檢測SARS-CoV-2的方法，45 min即可在測流條上肉眼查看結果，陽性率達95%?；贑RISPR的核酸檢測技術目前還處于新興階段，該技術可無需特殊儀器輔助，反應體積小又有很高的靈敏度精確度，方法成熟后可擴大通量檢測，因而顯示出極大的應用發(fā)展前景。由于病毒的高變異性，如何提高crRNA靶向識別的特異性、反應的穩(wěn)定性很是關鍵，相信經過不斷優(yōu)化改進后可以廣泛運用在核酸檢測領域。

2.2.5 抗體檢測 由于核酸檢測存在較高的假陰性，且耗時較長，對場地設備和技術人員要求較高，免疫學檢測因其快速可滿足現場檢測、診斷較為準確可輔助臨床確診，高滴度抗體血漿對重癥COVID-19患者的治療有所幫助，因此得到了越來越多的人重視?！缎滦凸跔畈《緜魅镜姆窝自\療方案（試行第七版）》首次將血清學檢測作為確診依據之一，新型冠狀病毒特異性IgM抗體和IgG陽性或新型冠狀病毒特異性IgG抗體由陰性轉為陽性或恢復期較急性期4倍及以上升高也可確診。目前免疫學的檢測方法主要有膠體金免疫層析法、磁微粒化學發(fā)光法和酶聯免疫吸附測定ELISA三種。

2.2.5.1 膠體金免疫層析法 膠體金免疫層析法（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）以抗原抗體特異性免疫反應為基礎，利用膠體金顆粒作為示蹤物標記其中之一，標記物在溶劑層析作用帶動下，于C/T線上發(fā)生免疫反應，根據T線顏色即可得到檢測結果（圖3）。GICA的樣本可以是全血，血清或者血漿，研究表明膠體金檢測試劑檢測全血、血漿或血清具有高度一致性［44］。目前獲得國家藥監(jiān)局批準的膠體金試劑盒有7種全為檢測抗體，未有針對抗原的檢測試劑盒。以RT-qPCR檢測方法作為對照發(fā)現，IgM/IgG抗體對于檢測的靈敏度和特異度不同，二者聯合檢測的檢出率最高為66.1%（125/189）［45］。膠體金試紙條法可用于企業(yè)復工、學生返校、社區(qū)人群排查等場景，只需要一滴指尖血，一般15 min即可肉眼觀察檢測結果，具有快速簡便無需特殊儀器等優(yōu)點，但是檢測存在窗口期、無法定量、有暴露風險、靈敏度低和易受環(huán)境因素干擾等缺點，需要核酸檢測進行驗證。

2.2.5.2 磁微?；瘜W發(fā)光法 磁微粒化學發(fā)光法利用表面固定重組抗原的磁微粒捕獲樣本中的特異性IgM/IgG抗體，外加磁場沉淀抗原抗體復合物，然后利用酶標二抗識別捕獲的二元復合物，之后加入發(fā)光劑后通過化學發(fā)光儀測定發(fā)光強度，從而定量分析的一種新興技術，具有快速（一般30-60 min）、靈敏度高、特異性強、檢測范圍寬等特點。目前獲批的有7種磁微粒化學發(fā)光法檢測試劑盒，最先獲批的博奧賽斯生物科技有限公司研發(fā)的試劑盒，搭配化學發(fā)光自動分析儀，可做到檢測速度240 T/H，首報告時間30 min。

2.2.5.3 ELISA 酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），將抗原或抗體結合到某種固相載體表面，保持其免疫活性，加入樣本后形成抗原-抗體復合物，之后再加入酶標記的抗原或抗體，形成三元復合物，洗滌后加入酶催化底物顯色，顏色深淺與待測樣本含量成正比，可通過酶標儀測得的吸光度大小定量分析。ELISA方法特異性主要取決于所用抗原的抗原性強弱，Liu等［46］評估了兩種基于不同抗原核蛋白、S蛋白的ELISA試劑盒COVID-19的檢測效果，結果發(fā)現214例確診新冠肺炎患者使用S蛋白抗原的試劑盒IgM/IgG陽性率均高于N蛋白，建議聯合二者檢測提高檢出率。ELISA方法具有特異性強，靈敏度高的特點，但整體檢測時間較長，通量較小，不利于基層大范圍展開應用。

研究數據顯示3種抗體檢測方法敏感性特異性均很高，總抗體檢測敏感性更高，建議免疫學檢測總抗體［47］。對患者體內總抗體、IgM和IgG隨病情進展的動態(tài)變化進行分析［48］發(fā)現，總抗體、IgM、IgG三者的陽轉時間中位數分別為11/12/14 d，而SARS-CoV-2抗原在1-5 d內即可出現，提示抗體檢測存在檢測窗口期，在發(fā)病后的7 d內RNA陽性率為66.7%，抗體陽性率小于40%，而發(fā)病15 d后RNA陽性率下降到45.5%，總抗體陽性率則達到100%，說明隨著病程不同，核酸抗體檢測陽性率不同，在發(fā)病早期7 d之內同時檢測核酸抗體可提高診斷敏感性。由于抗體的產生滯后時間較長，因此抗體檢測靈敏性不如核酸檢測，而且可能會與其他病毒產生抗體發(fā)生交叉反應，抗體水平易受到患者用藥影響，血液樣本中一些非特異性IgM、類風濕因子等物質容易產生干擾。IgM抗體一般在一周內產生，提示近期感染，IgG抗體產生晚于IgM抗體出現，但因為在體內能存在較長時間，所以檢測可鑒別急性感染和既往感染，有利于病情的分型。基于上述原因，免疫學檢測不能替代核酸檢測，必須結合核酸檢測結果進行確診，可用來輔助核酸檢測，排查檢測陰性結果人群，發(fā)現無癥狀感染者，控制病毒的傳播。

圖3 免疫膠體金原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of Immune colloidal gold technique

3 結語

目前新冠病毒的檢測方法主要以核酸、抗體檢測為主，又以核酸檢測結果陰性作為治療康復標準，因此樣本及選擇檢測方法至關重要，而造成檢測結果假陰性的大部分原因是采集的樣本病毒載量不合格或者處理保存不當。不同病程的病人宜采用不同的采樣部位，同一患者不同部位采集樣本檢出率也不一樣，具體可參照國家發(fā)布的新冠診療方案和實驗室檢測技術指南進行操作。采集過程中應盡量避免樣本RNA酶污染，使用帶螺旋蓋內有墊圈、耐冷凍的樣本采集管，樣本保存在如Hank’s病毒保存液中，必要時可以在保存液中添加RNA酶抑制劑。采集好的樣本應盡快檢測，冷鏈運輸，2-8℃條件下轉運時間不應超過72 h，24 h內檢測的標本可置于4℃保存，24 h 內無法檢測的標本則應置于-70℃或以下保存，避免反復凍融。為保證實驗室生物安全，在抽提病毒RNA基因組之前需要進行病毒滅活，不同的病毒滅活方式對檢出率有影響，普遍采用的滅活方式為75%乙醇、56℃ 30 min處理。

伴隨新冠患者不斷康復出院，治愈后“復陽”的病例也屢見不鮮，目前無確鑿證據表明新冠患者長期攜毒、存在二次感染，究其復陽原因可分為以下幾類：病毒潛伏較深，通過常規(guī)檢測方法無法發(fā)現它的存在，或者因為病毒含量較低達不到檢測線；糖皮質激素等免疫抑制治療延長了帶毒期；復陽檢測出的核酸實際上是死病毒的核酸片段。最后一類假陽性問題可通過更換檢測目標為病毒亞基因組或者活病毒顆粒解決，其余都可歸結為假陰性問題。病毒樣本采集、保存運輸、預處理、核酸提取、擴增檢測任何一個環(huán)節(jié)都有可能導致假陰性結果，臨床上可通過綜合評定不同部位多次采樣多種檢測方法連續(xù)檢測結果、多種生化及影像學指標、分層管理個性化制定患者出院標準、出院隔離并定期復查等方式避免假陰性或“復陽”結果。

新冠病毒的檢測方法有很多，各有優(yōu)劣，除上述筆者所述外，還有很多方法，如基因芯片，核酸適配體等。現場快速即時檢測產品POCT、方法的精確性、全自動流水線檢測、方法學上的優(yōu)化（如武漢全民體檢采用了混樣檢測策略）是以后檢測SARS-CoV-2的發(fā)展方向。隨著對新冠病毒的了解逐步加深，科學技術的發(fā)展，相信會有更多更準確高效的檢測方法產品被研發(fā)出來，我們期待今后出現集核酸提取、快速擴增、檢測一體化的便攜式儀器和類似禽流感檢測商品化的抗體檢測試紙條，能夠方便普通民眾在社區(qū)衛(wèi)生服務中心或者居家等場景自我篩查，以防疫情再次來臨時醫(yī)院等稀缺公共資源緊張的情況。