張秫華 方千 賈紅梅 韓桂琪，2 嚴(yán)鑄云 何冬梅

（1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點實驗室培育基地，成都 611137；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，成都 611137）

土壤作為真菌群落的“種子庫”，是許多植物內(nèi)生菌的最初來源，植物根系分泌物可吸引特定的菌群在根際聚集，形成與植物具特殊關(guān)系的根際菌群，而植物組織作為特化性更強的環(huán)境，與其共存的真菌群落和植物生長發(fā)育更加息息相關(guān)［1-3］。李毳等［4］認(rèn)為植物-微生物-土壤相互作用形成特定的土壤生態(tài)系統(tǒng)，為道地藥材的生長提供了特異的生境。據(jù)報道，杜仲的根際真菌和內(nèi)生真菌對其道地性及其活性成分含量具重要影響影響［5］，野生地黃和懷牛膝抵御病害的能力與根際益生菌和病原菌比例有關(guān)［6-7］。由此可見健全而平衡的土壤微生物和內(nèi)生菌群落對藥用植物生長、發(fā)育、代謝及品質(zhì)形成的重要性。然而，我們對根際微生物、內(nèi)生菌群的構(gòu)建規(guī)律知之甚少，由此也在一定程度上制約了藥用植物微生態(tài)調(diào)控技術(shù)的發(fā)展。

藥材川芎是傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的根狀莖，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效，主要用于治療月經(jīng)不調(diào)、頭風(fēng)頭痛、風(fēng)濕痹痛等疾?。?］。川芎是典型的單道地藥材，近代以來，其道地產(chǎn)區(qū)由傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)都江堰向新興產(chǎn)區(qū)眉山、彭州等地擴張［9-10］。有研究顯示新老產(chǎn)地川芎有效成分具有差異［11］，還有研究顯示川芎根際真菌［12］和內(nèi)生菌群落［13-14］均存在地理差異，并發(fā)現(xiàn)川芎揮發(fā)油及其有效成分含量與內(nèi)生真菌有關(guān)［15］。此外，從川芎內(nèi)生真菌中分離出的鐮孢屬、木霉屬和青霉屬內(nèi)生真菌能有效拮抗土傳病害——川芎根腐病病原菌［16-18］，并發(fā)現(xiàn)川芎在栽培過程中始終存在一部分豐度隨栽培地變化的真菌類群［19］。由此推測川芎土壤微生物和內(nèi)生真菌菌群之間形成的微妙平衡關(guān)系對其道地性品質(zhì)和抗病性等至關(guān)重要。

然而，上述研究對川芎根際和根莖內(nèi)生真菌的探查技術(shù)的通量有限，更全面川芎微生態(tài)結(jié)構(gòu)尚不清楚，川芎內(nèi)生菌群與土壤真菌之間存在什么樣的關(guān)系未見研究報道。本研究擬通過高通量測序技術(shù)（high-throughput sequencing，HTS） 和 FUNGuild分析比較川芎內(nèi)、外環(huán)境中的真菌群落結(jié)構(gòu)，并分析真菌群落的生態(tài)功能，挖掘川芎內(nèi)、外環(huán)境真菌的關(guān)聯(lián)性，揭示川芎產(chǎn)地真菌群落結(jié)構(gòu)特征。這有助于科學(xué)認(rèn)識微生態(tài)結(jié)構(gòu)對川芎道地性品質(zhì)的貢獻，為探究川芎區(qū)域品質(zhì)與環(huán)境微生物的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

在川芎傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)及非傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)分別設(shè)置各設(shè)6個采樣點（表1）。于2018年4月下旬采集川芎非根際土（S）、根際土（R）及川芎根莖（P）。川芎傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)以都江堰市石羊鎮(zhèn)封堆村（SY1）為中心，沿東南西北設(shè)計1 km×1 km采樣套方，在4角分別設(shè)采樣點（SY2、SY3、SY4、SY5），此外，在樣方附近的川芎種植示范基地設(shè)置采樣點（SY6）。川芎非傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)選擇崇州觀勝（CZ）、邛崍回龍（QL）、眉山修文（XW）、彭州敖平（PZ）、眉山謝家（XJ）和眉山永壽（YS）進行樣品采集，采集樣地為川芎栽培地，共計12批樣品。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與前處理 在各樣點面積為100 m×100 m的川芎栽培地內(nèi)，采用十字交叉法，用已消毒的鐵鏟和土鉆（直徑5 cm）采集川芎植株之間5-20 cm的耕作層土壤作為非根際土（S），每個樣點采集20份土壤，經(jīng)除雜、混合均勻后四分法收集約2 kg，取約150 g土壤裝入經(jīng)滅菌的50 mL離心管，以冰盒臨時保存并迅速帶回實驗室，于-20℃保存以供DNA提取，剩余土壤帶回實驗室后放于陰涼通風(fēng)處自然風(fēng)干用于理化性質(zhì)的測定。另以十字交叉法采集新鮮、無病害川芎植株50株，抖根法收集根際土（R），按非根際土處理辦法對樣品進行分裝、保存。

于50株川芎植株中隨機選取15株，取根莖（P）以冰盒臨時保存，迅速帶回實驗室，洗去泥沙，用手術(shù)刀輕輕刮去外皮，75%酒精浸泡40 s，經(jīng)無菌水清洗3遍，2% NaClO溶液浸泡15 min，無菌水清洗5遍，于超凈工作臺內(nèi)平均縱剖成6小塊。從15株根莖中各取1小塊形成一份根莖混合樣品，于-20℃保存用于DNA提取。

表1 川芎樣品采集樣地信息Table 1 Sampling plot information of L. chuanxiong Hort.

1.2.2 樣品DNA提取 上述土壤及川芎根莖樣品經(jīng)液氮充分研磨成粉末，取0.5 g，按試劑盒說明書進行DNA提取，每份樣品進行3個重復(fù)。1% 瓊脂糖凝膠電泳及核酸測定儀檢測DNA濃度及純度，樣品委托上海美吉生物有限公司完成高通量測序。

1.2.3 PCR擴增及高通量測序 針對真菌ITS區(qū)選擇PCR擴增通用引物對ITS1F / ITS2R（ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；ITS2R ：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）。 擴 增 體 系（20 μL）為 10× Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，正、反引物 0.8 μL，rTaq polymerase 0.2 μL，BSA 0.2 μL，DNA 10 ng，補足ddH2O 至20 μL。反應(yīng)程序為95℃3 min ；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，35 個循環(huán)，72℃ 5 min，4℃保存。對PCR產(chǎn)物進行檢測定量，構(gòu)建MiSeq文庫后進行Illumina MiSeq PE300高通量測序。

1.2.4 土壤理化性質(zhì)的測定 總有機質(zhì)（Organic matter，OM）采用重鉻酸鉀容量法—外加熱法測定；pH值采用電位測定法；全氮（total nitrogen，TN）采用半微量凱氏法測定［20-21］。速效磷（available phosphorus，AP）采用紫外 /可見分光光度計測定［22］；速效鉀（available potassium，AK）采用火焰光度計法測定［23］；水解氮（hydrolyzed nitrogen，HN）參考采用堿解擴散法測定［24］。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 經(jīng)高通量測序得到的雙端序列經(jīng)拼接與質(zhì)控過濾得到優(yōu)化序列，采用Usearch（vesion 7.0 http：//drive5.com/uparse/） 進 行 OTU 聚類，對97%相似水平的OTU與Unite（Release 7.2 http：//unite.ut.ee/index.php）數(shù)據(jù)庫比對并進行OTU物種注釋；采用mothur（http：//www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity）指數(shù)分析軟件計算樣本α多樣性指數(shù)；采用Welch t檢驗（Welch′s t test）對α多樣性指數(shù)進行顯著性差異分析；通過R語言及vegan軟件包作Venn分析、PCoA分析、RDA分析及ANOSIM等分析；利用FUNGuild 對真菌進行功能預(yù)測分析；采用SPSS 21 對土壤理化性質(zhì)進行顯著性差異分析。

2 結(jié)果

2.1 真菌ITS測序結(jié)果和群落豐富度和多樣性

通過MiSeq測序和質(zhì)控后共得到6 841 071條優(yōu)化序列，平均長度227 bp。按照97%相似性進行OTU聚類得到6 702個OTU。其中S組注釋到15門60綱141目333科764屬5 763個OTU，R組注釋到14門60綱128目297科655屬4 448個OTU，P組注釋到11門60綱100目233科471屬1 786個OTU。

Pan/Core物種分析用于判斷樣本量是否充足以及評估環(huán)境中總物種豐富度和核心物種數(shù)。物種Pan/Core曲線（圖1）顯示隨著樣本數(shù)的增加，曲線趨于平緩，說明樣本量充足。川芎非根際土和根際土的總OTU和核心OTU的物種豐富度均高于根莖，非根際土的總OTU數(shù)高于根際土，而核心OTU數(shù)少于根際土。說明川芎非根際土具有較高的物種豐富度，而核心物種在根際土集中分布，川芎根莖的內(nèi)生真菌豐富度均明顯少于外界土壤。

真菌群落a多樣性指數(shù)分析顯示（表2），川芎非根際土、根際土及根莖真菌群落的Coverage指數(shù)大于0.99，說明測序結(jié)果能夠反映出所測樣本中真菌的真實情況。Ace指數(shù)和Chao指數(shù)顯示R＞S＞P，Shannon even 指數(shù)、Shannon 指數(shù) S＞R＞P，Simpson指數(shù)P＞R＞S；說明相較于川芎內(nèi)生菌，土壤的真菌群落具有更高的豐富度、均勻度及多樣性。而根際土相較于非根際土具有較高的物種豐富度，非根際土具有較高的物種均勻度和多樣性。

圖1 川芎非根際土、根際土真菌及內(nèi)生真菌物種曲線Fig. 1 Species curves of bulk、rhizosphere soil and endophytic fungi in L. chuanxiong Hort.

表2 川芎非根際土真菌、根際土真菌及內(nèi)生真菌的α多樣性指數(shù)Table 2 α diversity indices of bulk soil, rhizosphere soil and endophytic fungi in L. chuanxiong Hort.

2.2 真菌群落物種組成

以相對豐度＞1%的物種作為優(yōu)勢菌群，采Kruskal-Wallis秩和檢驗（Kruskal-Wallis H test）對其進行多組樣本顯著性差異分析。在門分類水平上，川芎非根際、根際及根莖內(nèi)生真菌均主要以囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、被孢菌門（Mortierellomycota）和羅茲菌門（Rozallmycota）為優(yōu)勢菌群（表3），且4 門優(yōu)勢菌在各樣本類型中的相對豐度總和均達90%以上（S 90.71%、R 96.75%、P 98.94%）。4 門優(yōu)勢菌在各樣本類型中的相對豐度菌達到顯著性差異，其中子囊菌門（Ascomycota）為3 組樣本類型的最優(yōu)勢菌群，其豐度占比從非根際到根莖內(nèi)部逐漸逐漸增大，在根莖內(nèi)生真菌中的占比高達90.05%；擔(dān)子菌門（Basidiomycota）為第二優(yōu)勢菌群，其在非根際和根際中的相對豐度顯著高于根莖內(nèi)部；其余2 門優(yōu)勢菌被孢菌門（Mortierellomycota）和羅茲菌門（Rozellmycota）的相對豐度均為S＞R＞P。

表3 川芎非根際、根際及內(nèi)生真菌優(yōu)勢門相對豐度Table 3 Relative abundance of dominate fungal communities in bulk soil, rhizosphere soil and endophytic fungi of L. chuanxiong Hort. at Phylum level

在屬分類水平（表4），川芎非根際、根際及根莖內(nèi)生真菌分別有20、24、11個優(yōu)勢屬，其相對豐度的總和均大于90%（S 93.05%、R 93.84%、P 95.01%）。Phaeosphaeria、Sordariomycetes未 定屬、Fusarium、Plectosphaerella 4屬為3組樣本共有的優(yōu)勢屬。Mortierella、Fungi未定屬、Saitozyma、Pleosporales未 定 屬、Cladosporium 5個 屬 為 非根際土與根際土中共有。Glomerellales未定屬、Dactylonectria、Cercospora、Calophoma 4屬為根際土與根莖中共有。非根際土與根莖中不存在共有優(yōu)勢屬。此外，非根際土中測定到Beauveria、Zopfiella、Cercophora、Emericellopsis等11個特有優(yōu)勢屬。根際 土 中 測 定 到 Gibberella、Cadophora、Botrytis等11個特有優(yōu)勢屬。根莖中僅見Nectriaceae未定屬、Rhizoctonia、Paraphoma 3個特有優(yōu)勢屬。除Gibberella、Sordariomycetes未定屬和Nectriacea未定屬外，其他優(yōu)勢屬的相對豐度在3組間具有顯著性差異。Plectosphaerella和Cercospora在根莖中的相對豐度分別為50.80%和10.66%，顯著高于非根土際和根際土。Phaeosphaeria在非根際土與根際土中相對豐度最高（分別為32.63%和20.33%），在根莖中卻中僅占6.08%。

以O(shè)TU為分類單元作Venn圖（圖2），結(jié)果顯示3組有1 324個共有OTU；川芎非根際土與根際土中有2 367個共有OTU；非根際土與根莖中有114個共有OTU；根際土與根莖中有166個共有OTU。非根際土中獨有1 958個OTU，根際土獨有591個OTU，根莖中獨有182個OTU。

以相對豐度＞1%的OTU作為優(yōu)勢物種，結(jié)果顯示（表5）川芎非根際、根際及根莖中分別有14、19、8個優(yōu)勢物種，其相對豐度的總和皆大于90%（S 94.85%、R 96.51%、P 98.07%）。OTU715（2.76%）為根莖中獨有；根莖中其余7個OTU可見于川芎根際土，且有6個OTU在根莖中的相對豐度高于根際土，其中OTU1565在根莖中相對豐度（50.21%）顯著高于根際土（16.35%）及非根際土（1.65%），是 3組 唯 一 共 有 的 OTU；OTU1750、OTU4345、OTU2533、OTU2449為川芎非根際和根際中的共有OTU，OTU2449在根際的相對豐度（7.05%）高于非根際土（1.26%）；OTU2533、OTU1750 和OTU4345在根際土中的相對豐度低于非根際土。

以上結(jié)果表明川芎非根際、根際及根莖皆含有豐富的真菌群落結(jié)構(gòu)，不同的分類水平上，川芎非根際、根際及內(nèi)生真菌皆由少數(shù)物種占據(jù)優(yōu)勢地位，且各優(yōu)勢菌在不同樣本類型中分布具有明顯差異，其中非根際土與川芎內(nèi)生真菌的差異性最大，非根際土和根際土之間的差異性明顯低于與川芎內(nèi)生真菌的差異性。

2.3 真菌群落組間及產(chǎn)地差異

在OTU分類單元水平上，采用weighted-unifrac算法對樣本進行PCoA、ANOSIM、距離heatmap分析。PCoA分析結(jié)果顯示3組樣本在PC1（45.93%）上分開，來自不同產(chǎn)區(qū)的同一樣本類型聚在一個置信圈內(nèi)（圖3-A）。ANOSIM分析結(jié)果顯示（圖3-B）（R=0.839 2，P=0.001）3組樣本的組間差異大于組內(nèi)差異。樣本距離heatmap圖（圖3-C）顯示川芎非根際與根莖之間的真菌群落結(jié)構(gòu)差異最大，根莖與根際土之間次之，非根際土與根際土的差異最小。以上結(jié)果顯示，樣本類型是影響川芎真菌群落結(jié)構(gòu)主要因素，其中川芎非根際與根際、根際及根莖和非根際與根莖的真菌群落結(jié)構(gòu)差異依次增大。

表4 川芎非根際土、根際土及內(nèi)生真菌中優(yōu)勢屬的相對豐度Table 4 Relative abundance of dominate fungal communities in bulk soil, rhizosphere soil and endophytic fungi of L.chuanxiong Hort. at genus level

圖2 OTU單元下川芎非根際土、根際土及內(nèi)生真菌的物種Venn圖Fig. 2 Venn diagram of species in bulk soil, rhizosphere soil and endophytic fungi of L. chuanxiong Hort. at OTU level

表5 川芎非根際土、根際土及內(nèi)生真菌的優(yōu)勢物種（相對豐度＞1%）相對豐度Table 5 Relative abundance of dominant fungal composition (Relative abundance ＞ 1%) in bulk soil, rhizosphere soil and endophytic fungi of L. chuanxiong Hort. at OTU level

圖3 川芎非根際土、根際土及內(nèi)生真菌的物種PCoA分析（A）、ANOSIM分析（B）及距離heatmap圖（C）Fig. 3 PCoA analysis (A)、ANOSIM analysis (B) and distance heatmap analysis (C) of fungal composition in bulk soil,rhizosphere soil and endophytic fungi of L. chuanxiong Hort.

以相對豐度排位前40的屬作不同產(chǎn)地群落heatmap圖（圖4），結(jié)果顯示，在非根際土中，來自傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)都江堰的樣品（SSY1、SSY2、SSY3、SSY4、SSY5、SSY6） 距 離 較 近 ；在 R組中，來自眉山的樣品（RXW、RXJ、RYS）、來自都江堰的大部分樣品（RSY1、RSY2、RSY3、RSY4、RSY5）分別相聚為1類；在P組中，來自都江堰的部分樣品如PSY1、PSY2、PSY3、PSY6聚在一起，PSY4和PSY5聚在一起，眉山產(chǎn)區(qū)的樣品聚類不整齊。由此可見，在同一樣本類型中，傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)都江堰的真菌群落存在較高的相似性；真菌群落結(jié)構(gòu)體現(xiàn)不同程度的產(chǎn)地差異性，這種差異在非根際土中表現(xiàn)最明顯，其次是根際土，川芎內(nèi)生菌的產(chǎn)地差異性相對最小。

圖4 川芎非根際土、根際土及內(nèi)生真菌群落heatmap圖Fig. 4 Heatmap of fungal communities in bulk, rhizosphere soil and endophyte in L. chuanxiong Hort.

土壤環(huán)境因子顯著性差異分析顯示（表6），在非根際土中，有效磷（AP）、有效鉀（AK）、有機質(zhì)（OM）和總氮（TN）具有顯著性差異，而水解性氮（HN）和pH在各產(chǎn)區(qū)間無顯著性差異。其中，有效磷含量以邛崍、眉山和石羊產(chǎn)區(qū)較高；邛崍產(chǎn)區(qū)有效鉀含量顯著高于其他產(chǎn)區(qū)，石羊產(chǎn)區(qū)最低；有機質(zhì)以彭州產(chǎn)區(qū)最高，崇州和眉山產(chǎn)區(qū)最低；總氮以彭州、邛崍及石羊含量最高。RDA分析（圖5-A）結(jié)果顯示除總氮以外，其余5個環(huán)境因子對川芎非根際土真菌群落具有顯著影響，眉山產(chǎn)區(qū)和和崇州產(chǎn)區(qū)與石羊產(chǎn)區(qū)在RDA1軸上分開，有效磷、水解氮和有機質(zhì)為主要解釋因子。邛崍產(chǎn)區(qū)和彭州產(chǎn)區(qū)與石羊產(chǎn)區(qū)分開在RDA2軸分開，pH值、有效鉀和有效磷為主要解釋因子。在根際土中，不同產(chǎn)區(qū)的水解氮、有效磷含量及pH值具有顯著性差異（表7）。石羊、眉山及彭州產(chǎn)區(qū)的水解氮顯著高于崇州和邛崍產(chǎn)區(qū)，石羊、眉山產(chǎn)區(qū)的有效磷含量顯著高于其他產(chǎn)區(qū)；石羊、眉山及崇州的pH值高于彭州及邛崍。RDA分析（圖5-B）結(jié)果顯示，石羊（RSY6除外）和崇州產(chǎn)區(qū)的根際土真菌群落具有較高的相似性，與其余產(chǎn)區(qū)在RDA1軸分開。值得注意的是，僅有效磷和有效鉀對川芎非根際土真菌群落具有顯著影響。以上結(jié)果說明土壤理化性子對川芎非根際和根際真菌群落結(jié)構(gòu)皆具有不同程度的影響，且對非根際真菌的影響較大。

表6 川芎非根際土壤環(huán)境因子及RDA分析結(jié)果表Table 6 Environmental factors of bulk soil of L. chuanxiong Hort. and db-RDA analysis

圖5 川芎非根際、根際真菌與環(huán)境因子RDA分析Fig. 5 RDA analysis of bulk soil and rhizosphere soil fungi with environmental factors in L. chuanxiong Hort

2.4 真菌群落功能預(yù)測

采用FUNGuild對川芎非根際、根際及根莖內(nèi)生真菌群落進行功能預(yù)測分析，置信水平僅選用probable和highly probable，以獲得真菌生態(tài)營養(yǎng)型及各營養(yǎng)型在不同樣本中的豐度信息。結(jié)果顯示樣本中的真菌類群主要預(yù)測得到病理營養(yǎng)型（pathotroph）、共生營養(yǎng)型（symbiotroph）、腐生營養(yǎng)型（saprotroph）、病理-腐生營養(yǎng)（pathotrophsaprotroph）等8個營養(yǎng)型（圖6-A）。病理、共生、腐生、病理-腐生4種營養(yǎng)型的相對豐度較高，在S、R、P組中的相對豐度總和分別達到98.06%、97.01%和94.37%，為各樣本的優(yōu)勢類群。其中腐生營養(yǎng)型（S＞R＞P）、病理營養(yǎng)型（P＞R＞S）在 3組樣本中呈現(xiàn)相反的漸次性差異。

3組樣本預(yù)測得到16個生態(tài)共位群，其相對豐度如圖6-B所示，非根際土（S）中主要包括植物病原菌（plant pathogen，13%）、動物病原菌（animal pathogen，13%）、未定腐生菌（undefined saprotroph，33%）、糞腐生菌（dung saprotroph，13%）等共位群。根際土（R）主要以植物病原菌（plant pathogen，41.05%）、 未 定 義 腐 生 菌（undefined saprotroph，15.88%），凋落腐生-植物病原菌（litter saprotrophplant pathogen，5.33%）等共位群，主要分類單元分別為小不整球殼屬（Plectosphaerella，36.28%）、帚枝霉屬（Sarocladium，2.43%）、鎖霉屬（Itersonilia，5.33%）。內(nèi)生真菌（P）中主要為病原菌功能群，其中相對豐度較高的生態(tài)功能群主要有植物病原菌（plant pathogens，71.74%），分類單元為小不整球殼菌屬（Plectosphaerella，70.41%），余下為植物病原-未 定 腐 生 菌（plant pathogen-undefined saprotroph，14.78%）、真菌寄生-植物病原-植物腐生菌（fungal parasite-plant pathogen-plant saprotroph，2.02%）、蘭花菌根-植物病原-木腐生菌（orchid mycorrhizalplant pathogen-wood saprotroph）。

圖6 川芎非根際土、根際土及內(nèi)生真菌的物種真菌功能預(yù)測分析Fig. 6 FUNGuild analysis of the fungi in bulk soil and rhizosphere soils and endophytic fungi of L. chuanxiong Hort.

3 討論

川芎主產(chǎn)區(qū)的非根際土（S）、根際土（R）及根莖（P）的真菌群落結(jié)構(gòu)之間的差異研究結(jié)果表明，子囊菌門、擔(dān)子菌門等4門真菌為川芎內(nèi)外環(huán)境的優(yōu)勢真菌，其中子囊菌門在內(nèi)生真菌中占比高達90%，是川芎根莖內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)中為優(yōu)勢類群。在屬水平和OTU水平川芎非根際土、根際土及根莖內(nèi)生真菌均具有較高的物種多樣性，但相對豐度＞1%的物種僅占少數(shù)，其相對豐度總和卻達到90%以上，說明川芎植株內(nèi)、外環(huán)境均以少數(shù)真菌物種占優(yōu)勢，尤其在川芎根莖中，真菌各屬的優(yōu)勢差異更加懸殊。赤霉菌屬（Gibberella）、Cadophora 及鏈格孢霉屬（Alternaria）等11個優(yōu)勢屬在川芎根際土中的相對豐度高于非根際土和川芎根莖，小不整球殼菌屬（Plectosphaerella）、尾孢屬（Cercospora）及球腔菌屬（Phaeosphaeria）等11個優(yōu)勢屬在川芎內(nèi)生真菌的總豐度中占比達95%，推測這幾種真菌與川芎的生長發(fā)育可能存在著密切關(guān)系。其中小不整球殼菌屬（Plectosphaerella）在川芎根莖內(nèi)生真菌中占明顯優(yōu)勢，功能預(yù)測該菌屬于植物病原菌，另有研究發(fā)現(xiàn)表明，Plectosphaerella屬真菌并非川芎植物特有，它在其他植物內(nèi)具有生防作用［25-26］。因此，Plectosphaerella屬在川芎生長發(fā)育中所起的功能作用還有待進一步研究。此外，球腔菌屬（Phaeosphaeria）、小 叢 殼 目 未 定 屬（Unclassified Glomerellales）、Dactylonectria、Calophoma等川芎內(nèi)生真菌屬為首次發(fā)現(xiàn)。

FUNGuild功能預(yù)測結(jié)果顯示，非根際土、根際土及根莖內(nèi)均含有較高比例的植物病原菌，尤其川芎內(nèi)生菌中比例最高，推測這些無癥狀植株體內(nèi)存在的致病菌在一定條件下并不引起發(fā)病，以潛伏狀態(tài)或以條件致病菌方式生活在植物組織內(nèi)部［27］，這些真菌類群也可能具有其他的生理功能有待發(fā)現(xiàn)。研究結(jié)果中還含有一定比例未知功能的真菌類群，且有一定數(shù)量的真菌具有多個生態(tài)功能群，這可能因為FUNGuild數(shù)據(jù)庫參照菌株較少，真菌功能預(yù)測的準(zhǔn)確性在未來還有待提高［28］。

土壤微生物作為環(huán)境因子和地理因素的綜合表現(xiàn)［29］，可有效反映環(huán)境的綜合生態(tài)環(huán)境，對中藥材道地性的形成有著重要作用。本研究結(jié)果顯示，從非根際土到根際土，再到川芎根莖組織內(nèi)部環(huán)境，真菌的物種多樣性、主要營養(yǎng)型、生態(tài)共位群、優(yōu)勢真菌屬、同類型樣本在不同產(chǎn)地之間的差異程度、環(huán)境因子對非根際土和根際土的影響效應(yīng)等多個方面呈現(xiàn)出明顯的漸次性增/減趨勢。某些真菌在川芎根莖內(nèi)中的富集和耗盡表明，植物可主動選擇一些專職化真菌的定殖，而真菌群落結(jié)構(gòu)可能不僅由植物單獨引起，微生物間的相互作用也是重要原因［30］。前人研究顯示川芎內(nèi)生真菌具有一定的地域性，都江堰作為川芎傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)，其微生物具有較高的豐富度及穩(wěn)定性［31］，這些菌群與宿主植物之間可能形成了相對穩(wěn)定的共生關(guān)系，因此內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)受宿主的影響明顯大于土壤對其的影響。本研究中所涉及的6個環(huán)境因子對土壤真菌群落的影響有限，說明還有其他重要的影響因子有待繼續(xù)探索。氣候因素、植被類型、土壤特性等對土壤真菌群落具重要影響［32］，根際土真菌群落除了受土壤本身影響外，還受植物類型及其基因型的影響［33］，根莖作為特化性更強的環(huán)境，對真菌群落具有更強的選擇性。因此，從非根際土壤，到根際土壤，再到根莖內(nèi)，微生物菌群的地域差異性也在不斷縮小。

4 結(jié)論

（1）川芎土壤及其根狀莖中具有豐富的真菌群落多樣性和功能多樣性，而根際土比非根際土具有更高的物種豐富度，非根際土比根際土具有更高的物種均勻度和多樣性；（2）川芎土壤及其根狀莖中僅有少數(shù)真菌類群表現(xiàn)優(yōu)勢效應(yīng)，且優(yōu)勢真菌類群的相對豐度具有較大組間差異，川芎及土壤中存在的特有優(yōu)勢類群及有差別的優(yōu)勢類群，作為潛在的微生物資源或可能的藥用植物品質(zhì)調(diào)控外因，值得深入研究和利用；（3）真菌群落的物種多樣性、主要生態(tài)功能群及產(chǎn)地差異性在非根際土、根際土與川芎根莖之間都呈現(xiàn)出明顯的漸次變化規(guī)律，證明川芎在栽培過程中，川芎植株從產(chǎn)地土壤中獲得部分物種并發(fā)生了連續(xù)積累或消減，形成特定的內(nèi)生菌群，一方面表明三者之間存在菌群的橫向聯(lián)系，另一方面也表明，微環(huán)境特化程度越高（如宿主川芎內(nèi)部環(huán)境），對微生物的選擇性和富集性越強，這為理解中藥道地性品質(zhì)形成提供了科學(xué)參考。