祝峰 韓曙光 徐珂 滕懿群

母代肥胖會(huì)導(dǎo)致子代成年期肥胖、心血管疾病、非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）和脂肪性肝炎形成[1]。Baker[2]認(rèn)為早期生活環(huán)境的改變會(huì)增加子代的表型和代謝紊亂風(fēng)險(xiǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明母體孕期肥胖、哺乳期高脂飲食會(huì)導(dǎo)致小鼠活動(dòng)和進(jìn)食節(jié)律改變，并會(huì)在小鼠成年后導(dǎo)致代謝異常，包括糖代謝異常、脂代謝異常、NAFLD等[3]。自噬是真核細(xì)胞特有的一種分解代謝過程，其在維持細(xì)胞能量代謝平衡、控制細(xì)胞器質(zhì)量、細(xì)胞應(yīng)激應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子 EB（transcription factor EB，TFEB）在肝臟中增加可以調(diào)節(jié)溶酶體和自噬相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)肝臟自噬表達(dá)的增加，從而有效改善肝臟脂肪變性[4]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)去乙酰化酶3（sirtuin3，SIRT3）過表達(dá)可以導(dǎo)致錳超氧化物歧化酶的去乙?；突罨?，在耗盡細(xì)胞的超氧化物后實(shí)現(xiàn)自噬的抑制，促使肝臟脂滴的形成[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)母代肥胖和母乳喂養(yǎng)方式改變會(huì)導(dǎo)致后代17歲時(shí)更容易發(fā)生NAFLD[6]，具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確。Devarajan等[7]通過研究發(fā)現(xiàn)，早期宮內(nèi)環(huán)境變化會(huì)使子代產(chǎn)生營養(yǎng)敏感記憶，通過自噬調(diào)節(jié)在晚年對子代肝臟代謝產(chǎn)生保護(hù)作用。對此，本研究提出假設(shè)，肥胖母鼠子代在早期會(huì)發(fā)生肝臟改變，并且自噬可能在其中發(fā)揮作用。目前肝代謝的研究主要集中在成年期，但是關(guān)于母代肥胖的子代早期肝臟脂滴形成易感性，及其與自噬之間的關(guān)系研究較少。因此，本研究通過高脂喂養(yǎng)構(gòu)建肥胖母鼠模型，以探究母代肥胖及哺乳期高脂飲食對子代肝臟早期脂滴形成的易感性及可能的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡SPF級(jí)C57BL/6J雌鼠20只及雄鼠10只，購自蘇州大學(xué)，被安置在嘉興學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件為（24±2）℃，相對濕度（50±10）%，12 h/12 h明暗循環(huán)照明，自由獲取水和食物。實(shí)驗(yàn)過程中，雄鼠均普通糧喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)嘉興市第二醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過，實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)原則指南（1996修訂版）的要求。

1.2 試劑和儀器 TC（A111-1-1）、TG（A110-2-1）、HDL（A112-1-1）、LDL（A113-1-1）試劑盒均購自中國南京建成生物有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本Takara公司；自噬相關(guān)基因Beclin-1、自噬相關(guān)基因3（autophagy associated gene 3，ATG3）、自噬相關(guān)基因5（autophagy associated gene 5，ATG5）、自噬相關(guān)基因 12（autophagy associated gene 12，ATG12）、p62 及輕鏈 3B（light chain 3B，LC3B）等mRNA引物由中國通用生物技術(shù)公司合成；Beclin-1（A10101）、ATG3（A5809）、ATG5（A0203）、ATG12（A19610）、p62（A7758）、LC3B（A5618）、生物素二抗（AS014）等蛋白抗體均購自中國ABclonal公司；微管蛋白（Tubulin）（KM9003）購自天津 Sungene Biotech公司；多功能酶標(biāo)儀（SPARK）購自瑞士TECAN公司；普通PCR儀購自德國Eppendorf公司；Thermo Fisher-QS3實(shí)時(shí)定量PCR儀購自美國Thermo公司；Bio-Rad凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與喂養(yǎng) 采用隨機(jī)數(shù)字表法將20只雌鼠分為肥胖母鼠（obese maternal，OM）組和普通母鼠（common maternal，CM）組，每組10只。OM組雌鼠接受高脂飼料（含60%脂肪，江蘇南通特洛菲生物有限公司）喂養(yǎng)；CM組雌鼠接受普通飼料（含4%脂肪，江蘇南通特洛菲生物有限公司）喂養(yǎng)，喂養(yǎng)4周后，兩組雌鼠出現(xiàn)明顯體重差異。將普通雄鼠與雌鼠按1∶2進(jìn)行交配，它們的后代被定義為OM子代鼠（OM offspring，OM-O）、CM子代鼠（CM offspring，CM-O）。兩組母鼠哺乳期間統(tǒng)一高脂飼料喂養(yǎng)，按照每只母鼠2 g/d進(jìn)行飼喂。兩組子代鼠均母乳喂養(yǎng)4周，并在4周時(shí)斷乳，同時(shí)每組隨機(jī)選取7只子代雄鼠，麻醉后分別收集眼球靜脈血和肝臟組織，并保存于-80℃冰箱備用。所有子代雄鼠均采用脫頸椎法處死。

1.3.2 肝臟病理切片檢測 采用油紅O染色法。取4周齡子代雄鼠的新鮮肝臟右葉小塊組織，迅速放入4%多聚甲醛中固定肝臟樣本，石蠟包塊，4 μm厚切片，常規(guī)油紅O染色（紅色代表脂滴沉積），顯微鏡下觀察肝臟組織變化。

1.3.3 血清脂代謝指標(biāo)檢測 采用ELISA法。取4周齡子代雄鼠眼球靜脈血，收集的全血4℃隔夜放置，在4℃低溫下3 500 r/min離心10 min，取上清液。嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書檢測TC、TG、HDL、LDL水平。

1.3.4 自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測 采用RTPCR法。用Trizol試劑從肝臟組織中提取總RNA。在Thermo Fisher-QS3實(shí)時(shí)定量PCR儀上檢測Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG12、p62及 LC3B 等 mRNA 表達(dá)情況。以β-actin為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)步驟：變性程序（95℃10 min），擴(kuò)增定量程序重復(fù)40次（95℃ 15 s，60℃ 10 s，72℃和15 s，單熒光測量），熔融曲線程序（60～95℃，加熱速率0.1 C/s，連續(xù)熒光測量）。采用 2-ΔΔCt法測定相對 mRNA的表達(dá)。相關(guān)基因引物序列見表1。

表1 相關(guān)基因引物序列

1.3.5 自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。提取肝臟組織總蛋白，使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定總蛋白濃度。將各樣本的蛋白濃度調(diào)整一致，再與1/4體積的蛋白上樣緩沖液混合后煮沸，變性；通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)膜；在室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜2 h，按照 1:1 000 稀釋 Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG12、p62及LC3B等抗體原液，根據(jù)分子量大小分別以Tubulin作為內(nèi)參，于4℃過夜孵育；第2天洗膜，用5%脫脂奶粉稀釋HRP標(biāo)記的二抗（1∶1 000）于搖床上孵育90 min，洗膜后，加發(fā)光液，用Bio-Rad成像系統(tǒng)曝光，采用Image J軟件測定灰度值，目標(biāo)蛋白分別與內(nèi)參灰度值相比為各自相對表達(dá)水平。

1.3.6 肝臟組織LC3B含量檢測 采用免疫組化染色法。肝臟組織切片以新鮮配置體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2滅活細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶，然后用血清封閉，根據(jù)測試指標(biāo)分別滴加LC3B以及相應(yīng)生物素二抗AS014；DAB顯色，封片。采用Image J軟件對肝臟中LC3B的積分光密度（IOD）值進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，方差齊時(shí)，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組子代雄鼠肝臟組織病理變化比較 與CM-O組比較，OM-O組肝臟切片中脂滴形成不明顯，肝臟脂滴沉積較輕，見圖1（插頁）。

圖1 兩組子代雄鼠肝臟組織病理變化[a：普通母鼠子代鼠（CM-O）組；b：肥胖母鼠子代鼠（OM-O）組；油紅O染色，×100]

2.2 兩組子代雄鼠血清脂代謝指標(biāo)比較 兩組子代雄鼠血清TC、TG、HDL、LDL水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＞0.05），見表 2。

表2 兩組子代雄鼠血清脂代謝指標(biāo)比較（mmol/L）

2.3 兩組子代雄鼠肝臟自噬相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 與CM-O組比較，OM-O組Beclin-1、LC3B mRNA表達(dá)水平均上調(diào)，p62 mRNA表達(dá)水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而兩組子代雄鼠ATG3、ATG5、ATG12 mRNA表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表3。與CM-O組比較，OM-O組 Beclin-1、ATG12、LC3B蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，p62蛋白表達(dá)水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而兩組子代雄鼠ATG3、ATG5蛋白表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖2和表4。

圖2 兩組子代雄鼠肝臟自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)的電泳圖（肥胖母鼠子代鼠為OM-O；普通母鼠子代鼠為CM-O；自噬相關(guān)基因3為ATG3；自噬相關(guān)基因5為ATG5；自噬相關(guān)基因12為ATG12；輕鏈3B為LC3B；Tubulin為微管蛋白）

表3 兩組子代雄鼠肝臟自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平比較

表4 兩組子代雄鼠肝臟自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平比較

2.4 兩組子代雄鼠肝臟組織中LC3B含量比較 兩組肝臟組織免疫組化染色結(jié)果見圖3（插頁）。OM-O組LC3B的 IOD值為 2.43±1.02，高于 CM-O組的0.70±0.20，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.88，P＜0.05）。

圖3 兩組小鼠肝臟中輕鏈3B（LC3B）免疫組化染色結(jié)果[a：普通母鼠子代鼠（CM-O）組；b：肥胖母鼠子代鼠（OM-O）組；×100]

3 討論

母代肥胖或早期營養(yǎng)過剩對子代代謝影響深遠(yuǎn)。既往研究發(fā)現(xiàn)孕前肥胖導(dǎo)致的宮內(nèi)環(huán)境改變或母代哺乳期高脂飲食會(huì)導(dǎo)致子代肥胖、脂代謝異常[8-9]。目前代謝異常的研究都集中于成年期，很少有研究關(guān)注到幼年的代謝改變。兒童早期健康狀況往往是其成年后健康的重要基礎(chǔ)，例如臨床研究發(fā)現(xiàn)兒童早期肥胖或超重會(huì)導(dǎo)致成年后更容易出現(xiàn)NAFLD和ALT異常[10]，兒童青春期血壓變化將影響成年后的人體代謝[11]，因此關(guān)注早期子代代謝改變將對預(yù)防成年后的疾病有重要意義。本研究選擇4周齡子代雄鼠進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組子代雄鼠血清脂代謝指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在哺乳期高脂飲食的母乳喂養(yǎng)下，兩組子代雄鼠肝臟內(nèi)出現(xiàn)了脂質(zhì)沉積。這也與之前的臨床研究：哺乳期母代高脂飲食容易導(dǎo)致子代青年期NAFLD的形成[6]相一致。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，與CM-O組比較，OM-O組肝臟脂沉積等代謝異常表現(xiàn)較輕。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，OM-O組肝臟中自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC3B mRNA表達(dá)水平均上調(diào)，p62 mRNA表達(dá)水平下調(diào)；在蛋白層面的驗(yàn)證下，本研究發(fā)現(xiàn)Beclin-1及LC3B蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，p62蛋白表達(dá)水平下調(diào)，結(jié)果表明與CM-O組相比，OM-O組子代雄鼠肝臟內(nèi)自噬表達(dá)增加。Liu等[12]發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)的SD大鼠，肝臟脂肪變性前期自噬會(huì)增加，而晚期脂肪變性加重同時(shí)會(huì)導(dǎo)致自噬降低，這一結(jié)論與本研究結(jié)果一致。

自噬不僅能維持體內(nèi)細(xì)胞的平衡狀態(tài)及正常功能，還可以作為一種重要的脂質(zhì)代謝途徑[13]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)抑制自噬可以導(dǎo)致饑餓小鼠胚胎成纖維細(xì)胞里的脂滴數(shù)量和尺寸更大[14]，在使用氯喹（自噬抑制劑）后，自噬表達(dá)降低加重了脂肪變性。而當(dāng)使用雷帕霉素（自噬激活劑）時(shí)，激活后的自噬可顯著減輕肝細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積[12]。Devarajan等[7]通過對母代孕期限飼喂養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)子代小鼠肝臟自噬表達(dá)在成年期出現(xiàn)下降而形成脂代謝異常，但在老年期會(huì)因?yàn)闋I養(yǎng)敏感記憶出現(xiàn)肝臟的脂代謝改善，這表明母代的營養(yǎng)狀況可以通過記憶的方式傳遞給子代，從而激發(fā)子代的自我保護(hù)機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)母代肥胖的子代雄鼠在早期雖然沒有明顯出現(xiàn)肝臟脂質(zhì)改變，但自噬出現(xiàn)增加，這可以認(rèn)為是一種保護(hù)機(jī)制，母代肥胖對子代雄鼠肝臟脂代謝穩(wěn)態(tài)的影響可能與肥胖母代早期的營養(yǎng)記憶有關(guān)，這一記憶通過遺傳傳遞給后代，使子代早期激活了自噬調(diào)節(jié)，對自身肝臟脂代謝形成代償作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)母代肥胖對其子代肝脂代謝影響可能與自噬在其中發(fā)揮了一定的積極作用有關(guān)。當(dāng)然，本研究還存在一定的不足：（1）未通過調(diào)節(jié)自噬的表達(dá)來進(jìn)一步明確自噬與子代雄鼠肝臟脂質(zhì)改變之間的相關(guān)性；（2）未對這一變化的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行深入探究，今后將進(jìn)一步開展后續(xù)工作。