洪旭東 沈盛縣 金劍 張炳臣 范浩 張旭東 吳思捷 羅鵬飛

增生性瘢痕（hypertrophic scar，HS）是一種皮膚纖維增生性疾病，常發(fā)生于嚴(yán)重創(chuàng)傷、深度燒傷和外科手術(shù)切口等創(chuàng)面愈合過(guò)程中[1]。創(chuàng)傷后組織細(xì)胞過(guò)度增生、細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度表達(dá)并沉積在局部造成局部結(jié)構(gòu)紊亂是HS具有破壞性的特征[2-3]。長(zhǎng)期反復(fù)的炎性刺激是導(dǎo)致瘢痕呈增生性生長(zhǎng)的最重要致病因素[4]。除此之外，HS的發(fā)病機(jī)制與感染、傷口內(nèi)異物、過(guò)度的傷口張力或傷口邊緣的持續(xù)牽拉活動(dòng)等也密切相關(guān)[5]。糖皮質(zhì)激素是治療HS的一線藥物之一，給藥途徑為瘢痕內(nèi)注射，給藥頻次通常為每月注射1次，屬于有創(chuàng)操作，存在注射時(shí)不適和疼痛明顯、注射阻力極大、醫(yī)患雙方體驗(yàn)感均差以及瘢痕內(nèi)藥物分布不均勻等問(wèn)題，因此部分學(xué)者將其作為HS的二線治療藥物[6]。盡管早期干預(yù)性治療是防治HS的第一步，但糖皮質(zhì)激素的使用會(huì)降低患者免疫力，增加創(chuàng)面感染及延遲愈合的風(fēng)險(xiǎn)，因此，臨床中應(yīng)盡量減少糖皮質(zhì)激素的用量。研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用可提高HS的治療效果，包括聯(lián)合使用5-氟尿嘧啶（5-FU）、維拉帕米等[7]。近年來(lái)激光在HS防治中的作用越來(lái)越受到重視和認(rèn)可[8]，其中點(diǎn)陣激光自2003年首次報(bào)道以來(lái)被越來(lái)越多地用于HS防治（能量和范圍根據(jù)HS實(shí)際情況確定，頻次為每月1次）[9]。相較于常規(guī)有創(chuàng)治療，點(diǎn)陣激光具有精準(zhǔn)和微創(chuàng)兩大優(yōu)勢(shì)，理論上將點(diǎn)陣激光和藥物注射聯(lián)合應(yīng)用，不僅可以降低損傷程度和疼痛不適感，還可以解決藥物分布不均勻等問(wèn)題，有可能使治療效果倍增。因此，本研究通過(guò)建立兔耳HS模型，采用CO2點(diǎn)陣激光聯(lián)合糖皮質(zhì)激素（曲安奈德）防治HS，以期為臨床兩者聯(lián)合應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性新西蘭大白兔15只，體重2.5～3.0 kg，由海軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)得并飼養(yǎng)。將大白兔置于特定的SPF級(jí)別環(huán)境中，控制室溫23～27℃、相對(duì)濕度45%～65%、12 h光照/暗循環(huán)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均符合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院出版的《護(hù)理和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南》（出版號(hào)：96-01）。

1.2 主要儀器及試劑 CO2點(diǎn)陣激光治療儀（型號(hào)：UltraPulse Encore，以色列Lumenis科醫(yī)人醫(yī)療激光公司）；皮膚活檢器（中國(guó)精工儀表儀器廠，直徑：8 mm）；顯微鏡及其配套拍照測(cè)量軟件（型號(hào)：DMI3000B LAS AF系統(tǒng)，德國(guó)Leica公司）；凝膠成像系統(tǒng)及其配套拍照測(cè)量軟件（型號(hào)：ImageQuant LAS 4000系統(tǒng)，美國(guó)GE Healthcare公司）；曲安奈德注射液（昆明積大制藥股份有限公司，8 mg/ml）；平滑肌肌動(dòng)蛋白（smooth muscle actin，SMA）抗體（英國(guó) Abcam 公司，批號(hào)：ab240654）；Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）抗體（美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：MA1-26771）；β-actin抗體（英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)：ab8227）。

1.3 兔耳HS模型建立和治療方法 兔耳HS模型建立方法：兔耳緣靜脈注射1%戊巴比妥鈉（3 ml/kg），手術(shù)部位局部注射2%利多卡因和1∶20萬(wàn)稀釋的腎上腺素。用皮膚活檢器在每只耳的腹側(cè)表面各打6個(gè)直徑8 mm、間隔10 mm以上的圓形創(chuàng)面，再用手術(shù)刀片切除表皮、真皮和軟骨膜，在軟骨上用手術(shù)刀反復(fù)刮擦，徹底去除軟骨膜（圖1），用棉球加壓止血；造模第14天左右，創(chuàng)面痂皮自然脫落，形成HS。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大白兔分為對(duì)照組、激素組和激光激素組3組，每組5只共10只耳朵，每只耳朵制備6個(gè)瘢痕創(chuàng)面，每組共60個(gè)瘢痕創(chuàng)面。造模第14天，對(duì)照組用0.9%氯化鈉溶液涂抹創(chuàng)面；激素組用胰島素注射器（29G針頭：0.33 mm×12.7 mm）在HS內(nèi)注射8 mg曲安奈德注射液（每點(diǎn)2 mg，共4個(gè)點(diǎn)位）；激光激素組給予激光治療（參數(shù)設(shè)置如下：body模式，能量 80 mJ，范圍 1 cm×1 cm，密度 11.1%），繼而在創(chuàng)面涂抹8 mg曲安奈德注射液。造模后第14、21、28、35天，分別行HS大體形態(tài)觀察，擴(kuò)大切取HS組織（每只大白兔每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3處，每組共計(jì)取15處，切取范圍擴(kuò)大至HS組織周邊1～2 mm寬度的正常組織）行病理檢查并測(cè)定瘢痕增生指數(shù)（hypertrophic index，HI）；造模后第35天檢測(cè)HS組織中Collagen Ⅰ和SMA蛋白表達(dá)水平。

圖1 兔耳增生性瘢痕（HS）模型建立（a：皮膚活檢器，直徑為8 mm；b：在兔耳腹側(cè)用直徑為8 mm的皮膚活檢器建立兔耳HS模型，各創(chuàng)面之間距離＞10 mm）

1.4 病理檢查 HS組織固定于4%多聚甲醛24 h，經(jīng)脫水、浸蠟、石蠟包埋后，自HS組織中間部位（瘢痕增生最顯著部位）開(kāi)始向兩端作連續(xù)切片（5 μm）并置于載玻片上，脫蠟后行HE染色，觀察HS形成狀況。

1.5 HI測(cè)定 將造模后第14、21、28、35天的HS組織切片置于DMI3000B顯微鏡低倍鏡下進(jìn)行拍照，并通過(guò)LAS AF軟件分別測(cè)量HS厚度A和正常皮膚厚度B（具體測(cè)量方法見(jiàn)圖2）。計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)各組HI，HI計(jì)算公式[10]如下：HI=（HS厚度A-正常皮膚厚度B）/正常皮膚厚度B。

圖2 HE染色后在顯微鏡下觀察利用LAS AF軟件測(cè)量瘢痕增生指數(shù)（HI）（HS為增生性瘢痕）

1.5 Collagen Ⅰ和SMA表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。HS組織研磨后加入組織裂解液冰上裂解10 min，4℃12 000 r/min離心10 min，取上清液作為HS組織蛋白提取液，SDS-PAGE凝膠電泳（分離膠8%，濃縮膠5%）分離蛋白并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入一抗（SMA抗體1∶1 000稀釋，Collagen Ⅰ抗體 1∶2 000稀釋，β-actin抗體 1∶2 000稀釋）4 ℃孵育過(guò)夜；加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果拍照并用自帶軟件進(jìn)行灰度值分析，目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值的比值即為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模后不同時(shí)間點(diǎn)各組兔耳HS大體形態(tài)比較 對(duì)照組兔耳創(chuàng)面在造模后第14天脫痂時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)瘢痕增生，造模后第21、28和35天時(shí)瘢痕繼續(xù)增生，而激素組和激光激素組兔耳瘢痕增生速度明顯慢于對(duì)照組。造模后第35天，對(duì)照組兔耳創(chuàng)面肉眼可見(jiàn)明顯高于周圍正常皮膚的HS組織，與周圍正常皮膚比較，顏色明顯更深、色澤更暗、質(zhì)地更硬；激素組和激光激素組兔耳創(chuàng)面均未見(jiàn)明顯高于周圍正常皮膚的HS組織，但激素組兔耳HS組織顏色更深、質(zhì)地偏硬，而激光激素組兔耳HS組織顏色和質(zhì)地均與周圍正常皮膚無(wú)明顯差別，顯示出對(duì)HS最佳的抑制效果（圖3，見(jiàn)插頁(yè)）。

圖3 造模后不同時(shí)間點(diǎn)各組兔耳創(chuàng)面增生性瘢痕（HS）大體形態(tài)比較

2.2 各組兔耳HS組織病理檢查結(jié)果比較 造模后第35天，對(duì)照組兔耳HS組織中成纖維細(xì)胞數(shù)目增多明顯，微血管密集，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，纖維組織排列紊亂，無(wú)規(guī)律；而激素組和激光激素組兔耳HS組織中成纖維細(xì)胞數(shù)目明顯減少，微血管密度也較對(duì)照組減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較輕，纖維組織相對(duì)規(guī)律，成線條狀排列；較激素組而言，激光激素組兔耳HS組織中成纖維細(xì)胞數(shù)目和微血管密度更少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)更輕（圖4，見(jiàn)插頁(yè)）。

圖4 造模后第35天各組兔耳增生性瘢痕（HS）組織病理檢查結(jié)果比較（a：對(duì)照組；b：激素組；c：激光激素組；HE染色，×20）

2.3 造模后不同時(shí)間點(diǎn)各組兔耳HS組織HI比較 造模后第14天各組兔耳HS組織HI比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模后第 21、28、35 天，激光激素組和激素組HS組織HI均低于對(duì)照組（均P＜0.05）；造模后第28天，激光激素組HS組織HI低于激素組（P＜0.05），見(jiàn)表 1。

表1 造模后不同時(shí)間點(diǎn)各組兔耳HS組織HI比較

2.4 各組兔耳HS組織中Collagen Ⅰ和SMA表達(dá)水平比較 激光激素組和激素組兔耳HS組織中Collagen Ⅰ和SMA表達(dá)水平均低于對(duì)照組（均P＜0.05）；激光激素組兔耳HS組織中SMA表達(dá)水平低于激素組（P＜0.05），而兩組兔耳HS組織中Collagen Ⅰ表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 各組兔耳增生性瘢痕（HS）組織中Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）和平滑肌肌動(dòng)蛋白（SMA）表達(dá)水平比較（a：各組兔耳HS組織中Collagen Ⅰ和SMA蛋白表達(dá)的電泳圖；b：各組兔耳HS組織中Collagen Ⅰ表達(dá)水平比較，與對(duì)照組比較，*P＜0.05；c：各組兔耳HS組織中SMA表達(dá)水平比較，與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與激素組比較，△P＜0.05）

3 討論

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)面愈合后、HS尚未明顯成形的早期便開(kāi)始激光干預(yù)，可以有效預(yù)防HS的形成，減緩其發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，具體表現(xiàn)為瘢痕體積縮小、瘙癢感改善、增生期時(shí)間窗縮短等[11]。研究還證實(shí)，在多種激光技術(shù)中，早期應(yīng)用非剝脫性點(diǎn)陣鉺激光[12]、脈沖染料激光[13]和磷酸鉀鈦激光[14]均可以有效地預(yù)防手術(shù)和創(chuàng)傷后HS的形成。除了預(yù)防作用外，CO2點(diǎn)陣激光還可有效治療創(chuàng)傷和手術(shù)后已經(jīng)形成的HS[15-16]。

糖皮質(zhì)激素常作為治療HS和瘢痕疙瘩的瘢痕內(nèi)注射的首選藥物[17-18]，其作用機(jī)制包括：抑制成纖維細(xì)胞增生和膠原合成、促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡和局部組織重塑等，從而達(dá)到軟化硬度、降低高度、縮小體積、促進(jìn)成熟的治療效果。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也證實(shí)，單獨(dú)糖皮質(zhì)激素處理創(chuàng)傷后早期兔耳HS，可以有效抑制HS形成（造模局部?jī)H有顏色更深、質(zhì)地更硬的的HS，未見(jiàn)明顯高于周圍正常皮膚），減少Collagen Ⅰ和SMA的表達(dá)，具有一定防治瘢痕過(guò)度增生的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，CO2點(diǎn)陣激光可以和防治HS的多種措施聯(lián)用，兩者發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，使治療效果倍增。具體包括：CO2點(diǎn)陣激光與5-FU聯(lián)合使用，其熱分解作用有助于穿透HS組織的形成微細(xì)孔道，從而提高5-FU的通透性和彌散率[19]；CO2點(diǎn)陣激光與富血小板血漿組織聯(lián)合治療還能顯著改善痤瘡瘢痕組織的外觀和皮膚紋理[20]。本研究利用CO2點(diǎn)陣激光作用于組織后能夠穿透HS組織的形成微細(xì)孔道的機(jī)制，聯(lián)合外用糖皮質(zhì)激素達(dá)到類似注射糖皮質(zhì)激素治療的目的，能有效解決藥物分布不均、注射阻力大、疼痛不適感強(qiáng)等傳統(tǒng)瘢痕內(nèi)注射遇到的難題。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：經(jīng)過(guò)CO2點(diǎn)陣激光與糖皮質(zhì)激素的聯(lián)合處理后，激光激素組創(chuàng)面未見(jiàn)明顯高于周圍正常皮膚的HS，顏色和質(zhì)地與周圍正常皮膚也均無(wú)明顯差別；而激素組創(chuàng)面盡管未見(jiàn)明顯高出正常皮膚的HS，但局部顏色偏深、質(zhì)地偏硬，說(shuō)明CO2點(diǎn)陣激光與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合應(yīng)用抑制HS的總體效果最佳。此外，造模后第28天激光激素組HI明顯低于激素組，進(jìn)一步說(shuō)明兩者聯(lián)合應(yīng)用的療效優(yōu)于單用糖皮質(zhì)激素，可以在更短的時(shí)間內(nèi)形成對(duì)HS的抑制效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，激素組部分愈合創(chuàng)面因注射藥物不均勻、局部壓力過(guò)大造成局部組織缺血甚至尖端組織壞死脫落形成局部缺損，而激光激素組并未發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象，這提示CO2點(diǎn)陣激光治療可以在一定程度上避免HS內(nèi)注射遇到的上述難題。

綜上所述，本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示，CO2點(diǎn)陣激光聯(lián)合糖皮質(zhì)激素治療可以有效防治HS，為臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。