岳茹婧，馬曉莉，郭新紅，黃川生，王新春，曹文疆

(1 石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002；2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832008)

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是許多心血管疾病的基礎(chǔ)血管病變，發(fā)病趨勢(shì)逐年上升，嚴(yán)重影響人們的健康[x]。AS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要有炎癥學(xué)說(shuō)、脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)等[2]，研究者發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞參與AS的發(fā)生發(fā)展，其中血管平滑肌細(xì)胞扮演著尤為重要角色[3]。

血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)是一種可塑性極強(qiáng)的細(xì)胞，在炎癥介質(zhì)、ox-LDL等因素的刺激下，可由成熟的收縮型轉(zhuǎn)化成增殖型、巨噬細(xì)胞型甚至是形成泡沫細(xì)胞[4,5]。

前期研究表明，香青蘭總黃酮(DracocephalumMoldavicaL.total flavonoids,TFDM)對(duì)于冠心病、心肌缺血、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病具有較好的治療作用[6,7]，但其防治AS的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。Notch1信號(hào)通路廣泛分布于多種組織細(xì)胞，控制著細(xì)胞增殖、分化和遷移等細(xì)胞命運(yùn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在心血管疾病的治療中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[8]。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)建立大鼠VSMCs表型轉(zhuǎn)化的細(xì)胞模型，探討TFDM對(duì)VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響及可能的機(jī)制，為香青蘭總黃酮防治AS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

BBS-SSC型超凈工作臺(tái)(山東BIOBASE生物產(chǎn)業(yè)有限公司)；CKX31型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；XB70型制冰機(jī)(英國(guó)Grant儀器有限公司)；2-16 K高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；THM#3131型細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific)；酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；24D制膠器(天能)、垂直電泳及電轉(zhuǎn)槽、EPS-300數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(上海天能科技有限公司)；EC3600型UVP蛋白成像儀(蘇州賽恩斯儀器有限公司)。

1.2 試劑及材料

香青蘭總黃酮提取物(新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，20161109)；0.25%胰酶-EDTA消化液、10000U青-鏈霉素雙抗、DMEM/H培養(yǎng)基(Thermo scientific，Gibco)；ox-LDL(弈源生物，YB-002)；辛伐他汀(索萊寶，IS0170)；γ-分泌酶抑制劑(APExBIO，10 mg，DMSO溶解)；CCK-8試劑(日本同仁化學(xué)，CK04)；Anti-SM22α alpha、Anti-alpha SMA(abcam,ab32575-100)、Anti-Hes1(abcam,ab108937)、Anti-RBP-Jκ(abcam,ab180588)、Anti-GAPDH(武漢三鷹，60004-1-lg)；Notch1(D1E11)XP Rabbit mab(CST，3608S)；Transwell 聚碳酸酯膜嵌套(Corning，3422)；PVDF膜(美國(guó)密理博);十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠、電泳液、轉(zhuǎn)膜緩沖液、TBST緩沖液、封閉液等為自行配制；水為超純水。

1.3 細(xì)胞

大鼠血管平滑肌A7R5細(xì)胞購(gòu)于富恒生物科技有限公司，NC025。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將A7R5細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1‰青-鏈霉素的DMEM/高糖培養(yǎng)基(即完全培養(yǎng)基，下同)，并于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至融合，使用0.25%胰酶-EDTA進(jìn)行消化而后傳代。細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.2 藥物毒性作用考察及濃度確定

采用CCK-8法測(cè)定各種刺激對(duì)細(xì)胞活力的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化，1 000 r·min-1離心5 min后重懸于完全培養(yǎng)基，并調(diào)整密度至3×104個(gè)·mL-1接種于96孔板(100 μL·孔-1)；另設(shè)空白孔，加等體積完全培養(yǎng)基(無(wú)細(xì)胞)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，細(xì)胞貼壁成形。分別加入含ox-LDL為0(對(duì)照組)、5、10、25、50、100 μg·mL-1的完全培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；棄原培養(yǎng)基，加入含10% CCK-8試劑的無(wú)血清培養(yǎng)基100 μL，2 h后于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD)。按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%(As：含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測(cè)物質(zhì)，Ac：含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒(méi)有待測(cè)物質(zhì)，Ab：不含細(xì)胞和待測(cè)物質(zhì)的培養(yǎng)基、CCK-8)。同法設(shè)置含TFDM 0、5、10、25、50、100 μg·mL-1以及含辛伐他汀為0、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2mol·L-1的劑量組，計(jì)算細(xì)胞存活率以確定藥物刺激的毒性作用，選擇細(xì)胞存活率大于80%的藥物濃度為作用劑量。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化，1 000 r·min-1離心5 min，重懸于完全培養(yǎng)基后隨機(jī)分為6組：1)正常對(duì)照組；2)模型組(50 μg·mL-1ox-LDL)；3)香青蘭總黃酮高劑量組(TFDM-H組，50 μg·mL-1ox-LDL+100 μg·mL-1TFDM-H)；4)香青蘭總黃酮中劑量組(TFDM-M組，50 μg·mL-1ox-LDL+50 μg·mL-1TFDM-M)；5)香青蘭總黃酮低劑量組(TFDM-L組，50 μg·mL-1ox-LDL+25 μg·mL-1TFDM-L)；6)辛伐他汀組(Simvastatin組，50 μg·mL-1ox-LDL+10-5mol·L-1Simvastatin)。各組細(xì)胞于鋪板12 h后更換培養(yǎng)基，對(duì)照組更換完全培養(yǎng)基；處理組細(xì)胞更換為含50 μg·mL-1ox-LDL的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h建立VSMCs表型轉(zhuǎn)化模型。TFDM及辛伐他汀組細(xì)胞于模型建立后，更換含相應(yīng)劑量藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h(各處理組劑量根據(jù)“2.2”試驗(yàn)結(jié)果，并考慮藥效及細(xì)胞毒性而確定，下同)。

1.6 TFDM對(duì)細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板中，密度、分組及細(xì)胞處理方法同“2.3”所述。分別于接種后12、36、60 h時(shí)，用CCK-8測(cè)定450 nm處測(cè)定吸光度(OD)值。每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)測(cè)定3次。

1.7 TFDM對(duì)細(xì)胞遷移的影響

采用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化、離心后重懸細(xì)胞并鋪入6孔板中，并按“2.3”所述對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組處理。收集各組細(xì)胞使之重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為5×104個(gè)·mL-1。取150 μL細(xì)胞懸液鋪入Transwell小室的上室中，下室加入600 μL含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。24 h后取出 Transwell 小室，棄培養(yǎng)基，PBS浸洗，棉簽拭去上層未遷移細(xì)胞，甲醇固定30 min，適當(dāng)風(fēng)干。0.1% 結(jié)晶紫染色 40 min，PBS浸洗，拭去水分后撕下纖維膜封于載玻片、晾干，于顯微鏡200倍視野下隨機(jī)選五個(gè)視野觀察細(xì)胞，拍照，記數(shù)。

1.8 TFDM對(duì)VSMC表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白及Notch1通路蛋白表達(dá)的影響

采用Western blotting法檢測(cè)各目的蛋白的表達(dá)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化、離心，鋪于6孔板中，按“2.3”項(xiàng)下方法分組、處理細(xì)胞。加入含1% PMSF的RIPA裂解液提取總蛋白，將總蛋白稀釋成相同濃度。蛋白于10%SDS-PAGE凝膠上電泳分離(80 V，100 V)后，濕法轉(zhuǎn)移(300 mA)至PVDF膜。將膜用5%脫脂奶粉/BSA封閉1 h，而后4 ℃過(guò)夜孵育一抗(GAPDH、SM22α、α-SMA、Notch1、a-Notch1、RBP-Jκ、Hes-1及Hes-5的稀釋比例分別為1∶4 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶500)；次日洗膜后，在室溫條件下，于搖床上與HRP偶聯(lián)的二抗孵育1 h，孵育結(jié)束后洗膜，除去多余二抗。使用ECL化學(xué)發(fā)光液，于凝膠成像儀中顯色并拍照。最后，通過(guò)Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。GAPDH為內(nèi)參，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 藥物毒性作用考察及濃度確定

與對(duì)照組比較，細(xì)胞的增殖率隨著ox-LDL對(duì)A7R5細(xì)胞刺激濃度的升高而升高，在其濃度大于50 μg·mL-1后，這種促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用減弱(圖1)。

圖1 不同濃度的ox-LDL、TFDM及simvastatin對(duì)A7R5細(xì)胞增殖率、存活率的影響

此外，細(xì)胞存活率隨著TFDM及辛伐他汀濃度的升高而降低。從細(xì)胞存活率及其總體趨勢(shì)來(lái)看，當(dāng)TFDM刺激濃度達(dá)到100 μg·mL-1、辛伐他汀濃度為10-5μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞存活率降低至80%，高于此濃度則存活率顯著下降。因此，選擇濃度為50 μg·mL-1的ox-LDL作為造模濃度，25、50、100 μg·mL-1的TFDM作為低、中、高給藥劑量組，1×10-5mol·L-1作為辛伐他汀的作用濃度。

2.2 香青蘭總黃酮對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的影響

表1所示為CCK-8實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，與正常組相比，ox-LDL作用24 h后的各組細(xì)胞異常增殖明顯增加(P<0.001)。與模型組相比，TFDM-H和辛伐他汀顯著抑制了細(xì)胞的異常增殖作用(P<0.001)，中、低劑量地TFDM對(duì)細(xì)胞異常增殖有一定的抑制作用但不明顯，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明TFDM對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs的異常增殖具有抑制作用，且具有一定劑量依賴性。

表1 香青蘭總黃酮對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的影響

2.3 香青蘭總黃酮對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ox-LDL顯著增強(qiáng)VSMCs的遷移能力(P<0.05)，中、高劑量的TFDM能明顯減弱這種異常的遷移能力(P<0.05)(圖2)，低劑量的TFDM作用效果不明顯。辛伐他汀也能有效抑制細(xì)胞遷移，且較TFDM效果更好。TFDM對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs遷移能力異常具有抑制作用。

與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較*P<0.05；放大倍數(shù)：20×10。

2.4 香青蘭總黃酮對(duì)細(xì)胞SM22α,α-SMA蛋白表達(dá)的影響

與正常組相比，模型組SM22α和α-SMA蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組比，藥物處理后，TFDM-H組和辛伐他汀組的分化型蛋白SM22α和α-SMA表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。TFDM-M 能顯著上調(diào)SM22α的表達(dá)，對(duì)α-SMA表達(dá)有上調(diào)作用，但不顯著。而低劑量的TFDM對(duì)SM22α和α-SMA的作用效果有限，其相對(duì)表達(dá)量與模型組基本無(wú)異。SM22α和α-SMA是VSMCs的收縮表型標(biāo)志蛋白，表達(dá)量反映VSMCs的表型。結(jié)果表明ox-LDL可誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化(由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?，而TFDM對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)化具有抑制作用。

與正常組比較，###P<0.001,##P<0.01,#P<0.05；與模型組比較，***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05。

2.5 TFDM對(duì)各劑量組對(duì)Notch1通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Notch1通路相關(guān)蛋白表達(dá)的WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4)。

與正常組比較，###P<0.001,##P<0.01,#P<0.05；與模型組比較，***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05。

與正常組相比，發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的VSMCs Notch1、a-Notch1、RBP-Jκ、Hes-1及Hes-5蛋白表達(dá)均明顯增加(P<0.001,P<0.01或*P<0.05)。而與模型組相比，在分別給細(xì)胞加入高、中、低濃度的TFDM后，高劑量的TFDM對(duì)Notch1、actived-Notch1、RBP-Jκ、Hes-1及Hes-5表達(dá)均有顯著的抑制作用(P<0.001,P<0.01或P<0.05)；中劑量的TFDM明顯抑制Notch1、RBP-Jκ、Hes-1及Hes-5蛋白的表達(dá)(P<0.001,P<0.01或P<0.05)，而對(duì)actived-Notch1的表達(dá)沒(méi)有明顯抑制作用；低劑量的TFDM顯著抑制a-Notch1和Hes-5的表達(dá)(P<0.01或*P<0.05)。顯然，ox-LDL誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，Notch1信號(hào)通路被激活且密切參與其中，而TFDM-H對(duì)Notch1信號(hào)通路的激活有顯著的抑制作用，從而起到抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化的作用。

3 討論

AS斑塊的形成與血管壁中各種細(xì)胞相互作用有關(guān)，包括內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)等[9]。VSMCs是AS斑塊纖維帽中膠原蛋白的主要來(lái)源，對(duì)斑塊的穩(wěn)定有益且必要。在AS致病因素(細(xì)胞因子、脂質(zhì)刺激和剪應(yīng)力)的影響下，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、分泌炎癥因子，隨后中膜的VSMCs受炎癥、氧化應(yīng)激、血流剪切力等的影響，由成熟的收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚停@使得VSMCs增殖、遷移能力增加，收縮型標(biāo)志蛋白SM22α和α-SMA表達(dá)減少，敏感性增加而收縮功能消失。隨著致病因素表達(dá)的增加和脂質(zhì)的積累，VSMCs表型逐漸向“巨噬細(xì)胞型”轉(zhuǎn)化[10]，同巨噬細(xì)胞一起匯聚至損傷部位，通過(guò)內(nèi)吞作用吞噬脂質(zhì)，形成肌源性的泡沫細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)AS斑塊的形成，加劇AS病變進(jìn)程[11-12]。因此，抑制VSMCs的表型轉(zhuǎn)化對(duì)抑制AS斑塊形成及其病情發(fā)展有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)中采用ox-LDL刺激VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)其增殖、遷移顯著增加，SM22α和α-SMA表達(dá)被顯著抑制，而香青蘭總黃酮對(duì)其表型轉(zhuǎn)化具有保護(hù)作用，TFDM-H尤為顯著地抑制了其異常增殖、遷移，并上調(diào)了SM22α和α-SMA的表達(dá)。辛伐他汀作為陽(yáng)性藥，是很好的降血脂及抗AS的藥物，對(duì)VSMCs的異常增殖及遷移具有很好的抑制作用[13-14]，但肝、腎毒性較大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TFDM-H對(duì)VSMCs表型轉(zhuǎn)化的抑制作用與辛伐他汀組的作用相當(dāng)。課題組前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TFDM可以有效抑制AS斑塊的形成，降低血脂，抑制炎癥反應(yīng)[15-16]。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平，進(jìn)一步解釋了TFDM防治AS的作用可能與抑制了VSMCs的表型轉(zhuǎn)化有關(guān)，并探討了可能的機(jī)制。

Notch信號(hào)通路是高度保守的Ⅰ型跨膜受體蛋白家族，廣泛分布于多種組織細(xì)胞，Notch1是該家族中最受關(guān)注的受體蛋白，通過(guò)相鄰細(xì)胞的交互作用調(diào)控細(xì)胞的分化[17]。Notch1與其配體結(jié)合，使Notch1胞外結(jié)構(gòu)被釋放，而胞內(nèi)域(Notch1 intracellular domain，N1ICD)在γ-分泌酶(γ-secretase protease)的作用下被釋放如細(xì)胞內(nèi)[18]。N1ICD進(jìn)入細(xì)胞核與RBP-Jκ結(jié)合形成復(fù)合體，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、激活下游靶基因Hes-1、Hes-5等的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、分化與凋亡[19]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定Notch1通路相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，ox-LDL激活了Notch1通路，相關(guān)蛋白的表達(dá)量顯著升高；而TFDM明顯下調(diào)了Notch1通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制了通路的激活。因此，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，TFDM對(duì)AS的防治作用可能是通過(guò)調(diào)控Notch1信號(hào)通路，抑制了VSMCs的表型轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)的。

本研究從另一角度探討了香青蘭總黃酮對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治作用，發(fā)現(xiàn)香青蘭總黃酮不僅可以通過(guò)降低血脂水平、抑制炎癥反應(yīng)抗動(dòng)脈粥樣硬化，還可通過(guò)在AS早期抑制Notch1通路的激活，從而抑制VSMCs的表型轉(zhuǎn)化、過(guò)度增殖和異常遷移而實(shí)現(xiàn)，對(duì)于AS病程的延緩具有重要意義。然而，本實(shí)驗(yàn)的研究?jī)H為體外細(xì)胞，具體其在機(jī)體內(nèi)是否具有同樣的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的在體研究深入探討。