田 鎮(zhèn)，陳愛華，吳楊平，陳素華，張 雨，曹 奕，張志東，李秋潔

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海201306；2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，南通 226007）

文蛤（Meretrix meretrix）隸屬簾蛤目（Veneroida），簾蛤科（Veneridae），是一種廣溫、廣鹽性灘涂埋棲型經(jīng)濟貝類，為我國主要養(yǎng)殖貝類和出口水產(chǎn)品之一［1］。近年來，有關(guān)文蛤生物學(xué)特性以及基因資源挖掘等多方面研究越來越多，極大地促進了文蛤養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展［2］。目前，關(guān)于文蛤生理脅迫［3-5］、呼吸代謝［6］、過氧化氫酶分析［7］、遺傳多樣性［8-9］等方面的研究已有眾多報道，但在轉(zhuǎn)錄組水平SSR微衛(wèi)星特征生物信息學(xué)分析方面的研究鮮有報道。

微衛(wèi)星（microsatellites），也稱簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR），為1～6個核苷酸組成的短串聯(lián)重復(fù)序列［10］，具有高穩(wěn)定性、特異性和共顯性等優(yōu)點，多應(yīng)用于水產(chǎn)生物遺傳多樣性分析和分子標(biāo)記育種等領(lǐng)域［11］。隨著高通量測序技術(shù)發(fā)展，通過轉(zhuǎn)錄組、基因組等測序平臺大量快速測定DNA分子序列技術(shù)，利用生物信息學(xué)分析開發(fā)出數(shù)量龐大的SSR標(biāo)記，已在多種水產(chǎn)動物中得到廣泛應(yīng)用［12］。

本研究采用第二代高通量測序技術(shù)對文蛤進行轉(zhuǎn)錄測序（RNA-sequencing，RNA-Seq），通過對文蛤轉(zhuǎn)錄組中不同類型微衛(wèi)星的統(tǒng)計與分析，了解其微衛(wèi)星分布頻率和數(shù)量，從轉(zhuǎn)錄組水平闡明文蛤SSR組成特征，對進一步利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)開展遺傳標(biāo)記輔助育種和種群遺傳學(xué)研究具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 動物材料

實驗用文蛤于2017年3月取自江蘇省文蛤良種場（南通），隨機挑選外形完整、無損傷的廣西和江蘇原種個體各30粒。取其鰓、肝胰腺組織樣品浸沒在RNAlater溶液（天根，中國）中，并于-80℃儲存。

1.2 數(shù)據(jù)來源

提取文蛤鰓、肝胰臟組織樣本的總RNA，送生工生物工程（上海）股份有限公司采用PacBio SMRT測序技術(shù)和Illumina RNA-Seq技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序，通過整合PacBio SMRT和Illumina測序數(shù)據(jù)，生成高質(zhì)量的文蛤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以此作為分析數(shù)據(jù)。

1.3 SSR位點搜索

用Krait10.2軟件［13］對文蛤轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點進行搜索和統(tǒng)計。搜索參數(shù)為：單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸，最少重復(fù)次數(shù)分別為12、7、5、4、4、4。SSR分布的平均距離＝總Unigene長度／搜索到的SSR數(shù)量，出現(xiàn)頻率＝搜索到的SSR數(shù)量／總Unigene數(shù)量［14］。用Perl語言操作系統(tǒng)下MISA軟件進行檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 文蛤轉(zhuǎn)錄組中SSR的數(shù)量

文蛤的轉(zhuǎn)錄組中共檢索到98 598條編碼序列（coding sequence，CDS），總長110 964 842 bp，GC含量約為36.17%。通過對文蛤進行SSR位點搜索，共發(fā)現(xiàn)完整的SSR位點8 856個，SSR總長度為162 416 bp，平均長度18.34 bp，約占總序列長度的0.15%。SSR詳細(xì)信息見表1。

2.2 微衛(wèi)星序列的重復(fù)堿基類型分析

文蛤SSR位點堿基重復(fù)數(shù)量統(tǒng)計見表2。單堿基重復(fù)序列在文蛤轉(zhuǎn)錄組中所占比例最高（33.89%），其次為三、四堿基重復(fù)序列占比（分別為25.45%、24.84%），二、五堿基重復(fù)序列占比再次之（分別為11.88%、3.79%），六堿基重復(fù)序列占比最低（0.15%）。每種重復(fù)堿基類型的分布密度情況為：四堿基＞三堿基＞單堿基＞二堿基＞五堿基＞六堿基；SSR發(fā)生頻率大小依次為：單堿基＞三堿基＞四堿基＞二堿基＞五堿基＞六堿基。

表1 文蛤轉(zhuǎn)錄組中SSR位點搜索結(jié)果Tab.1 Search results of SSR in RNA-sequencing of Meretrix meretrix

表2 文蛤微衛(wèi)星SSR位點類型Tab.2 SSR types of Meretrix meretrix

本次檢索的8 856個SSR位點中共包含26種重復(fù)堿基元（表3）。單、二、三、四、五、六堿基重復(fù)分別有2、4、5、5、5、5種。在單堿基重復(fù)中，A／T重復(fù)基元所占比例最大（31.72%）；二堿基重復(fù)基元（AT／TA）、三堿基重復(fù)基元（AAC／TTG）和四堿基重復(fù)基元（AAAC／TTTG）占比相近（分別為6.33%、10.24%、6.64%）；五堿基重復(fù)基元（AAAAC／TTTTG）和六堿基重復(fù)基元（AATACC／TTATGG和AATCCC／TTAGGG）占比最少（分別為0.25%、0.02%、0.02%）。這表明在文蛤轉(zhuǎn)錄組中微衛(wèi)星位點的分布對A／T具有偏好性。

2.3 微衛(wèi)星序列數(shù)量及長度分布

SSR重復(fù)類型的重復(fù)數(shù)存在較大差異（圖1）。SSR位點數(shù)量隨著重復(fù)次數(shù)的增加而呈明顯減少的趨勢，四堿基、五堿基、六堿基重復(fù)隨著重復(fù)次數(shù)超過4、4、5次時數(shù)量呈平滑曲線減少；單堿基重復(fù)、二堿基重復(fù)和三堿基重復(fù)隨著重復(fù)次數(shù)增加到11、6、4次后，SSR位點數(shù)量開始呈線性升高，重復(fù)次數(shù)超過5、7、12次，平緩下降，直至為0。二堿基重復(fù)、三堿基重復(fù)、四堿基重復(fù)、五堿基重復(fù)和六堿基重復(fù)的重復(fù)次數(shù)大多分布在4～11，僅單堿基重復(fù)的重復(fù)次數(shù)為11～19。

文蛤轉(zhuǎn)錄組中所發(fā)現(xiàn)的8 856個完整型微衛(wèi)星位點中，微衛(wèi)星的長度差異不大，片段長度范圍為10～35 bp，平均長度18.34 bp（圖2）。其單堿基、三堿基、四堿基重復(fù)片段長度分別為12 bp、15 bp、16 bp時SSR位點數(shù)量最高（分別為1 219條、1 193條、1 225條）約占完整微衛(wèi)星總數(shù)的41%。除單堿基重復(fù)隨著重復(fù)片段長度的增加，位點數(shù)量呈平滑曲線下降。其他堿基重復(fù)分布特點呈“波浪形”分布并逐漸下降。

表3 文蛤轉(zhuǎn)錄組SSR中優(yōu)勢重復(fù)堿基組成和頻率統(tǒng)計Tab.3 Composition and frequency of dom inant repeatmotifs in the RNA-sequencing of Meretrix meretrix（in consideration of sequence com plementarity）

圖1 文蛤轉(zhuǎn)錄組中每種類型SSR數(shù)量隨重復(fù)次數(shù)分布Fig.1 Variation of repeat times w ith the number ofm icrosatellites in the RNA-sequencing of Meretrix meretrix

圖2 文蛤轉(zhuǎn)錄組中微衛(wèi)星的長度分布Fig.2 Length distribution ofm icrosatellites in the RNA-sequencing of Meretrix meretrix

3 討論

本研究共獲得8 856個完整性SSR位點，SSR的發(fā)生頻率為8.98%，平均分布長度為18.34 bp。文蛤SSR發(fā)生頻率與櫛江珧（Atrina pectinata）（8.2%）［15］、墨西哥灣扇貝（Argopecteni rradiansconcentricus）（10%）［16］、縊蟶（Sinonovaculaconstricta）（8.89%）［17］相似，但比泥蚶（Tegillarcagranosa）（14.83%）［18］、馬氏珠母貝（Pinctadamartensii）（13.34%）［19］略低，說明文蛤SSR位點分布豐度處于較低的水平。這也可能與數(shù)據(jù)庫的大小、SSR位點的搜索標(biāo)準(zhǔn)以及物種間的分布特征有關(guān)［20］。

基于轉(zhuǎn)錄組水平搜索的文蛤微衛(wèi)星重復(fù)類型中，單堿基重復(fù)類型的占比最高為33.89%，其次為三堿基、四堿基重復(fù)類型（分別占25.49%、24.84%），這與通過EST-SSR方法開發(fā)出的文蛤［21］、馬 氏 珠 母 貝［19］、菲 律 賓 蛤 仔（Ruditapes philippinarum）［22］、羅 氏 沼 蝦（Macrobrachium rosenbergii）［23］、斑鱧（Channamaculata）［24］和扁玉螺（Neveritadidyma）［25］SSR位點中呈現(xiàn)出單堿基重復(fù)數(shù)量最多，二堿基重復(fù)、三堿基重復(fù)和四堿基重復(fù)數(shù)量依次遞減的趨勢相似；但與櫛孔扇貝（Chlamysfarreri）［26］、三 角 帆 蚌（Hyriopsis cumingii）［27］、黑鯛（Acanthopagrusschlegelii）和真鯛（Pagrusmajor）［28］SSR三堿基重復(fù)類型數(shù)量最多有所不同。不同物種間的堿基重復(fù)類型不同，研究認(rèn)為高等水生動物以低重復(fù)基元居多，而低等水生動物以高重復(fù)基元居多，但文蛤作為低等貝類動物以單堿基重復(fù)和三、四堿基重復(fù)類型的比例高，可能暗示該科貝類具有更高的進化水平、更長的進化時間或更高的突變頻率［14］。目前大部分的SSR標(biāo)記采用的是二堿基重復(fù)SSR，擴增出的產(chǎn)物常會出現(xiàn)影子帶，對于結(jié)果分析存在一定的干擾性。而四堿基重復(fù)SSR相比二堿基重復(fù)SSR標(biāo)記不但多態(tài)性更高，而且遺傳穩(wěn)定性更好［29-30］。根據(jù)文蛤SSR特征，可以嘗試開發(fā)三堿基、四堿基重復(fù)的SSR標(biāo)記，為今后開展文蛤等貝類種群遺傳多樣性分析等研究提供新的思路。

通過單堿基、三堿基和四堿基3種重復(fù)類型中各重復(fù)單元比較發(fā)現(xiàn)，在各重復(fù)長度中，A／T較G／C含量高出很多，這與很多水產(chǎn)生物基因組SSR具有的特點相一致，如金烏賊（Sepia esculenta）［31］、中 國 明 對 蝦（Fenneropenaeus chinensis）［32］、三 疣 梭 子 蟹（Portunustri tuberculatus）［33］SSR。水生生物中微衛(wèi)星富含A／T的原因可能是由于DNA復(fù)制滑動機制和重組機制，導(dǎo)致A／T重復(fù)類型的機率更高［34］。也有研究認(rèn)為，由于基因組DNA中的CpG的甲基化使之突變，甲基化的胞苷酸C易通過脫氨基作用變?yōu)樾叵汆奏，而少量的GC又是維持DNA熱力學(xué)穩(wěn)定性所必需的，故突變的A／T類型相應(yīng)增加［35］。

SSR分子標(biāo)記多態(tài)性的高低決定其潛在利用價值，其多態(tài)性取決于其SSR片段長度大?。?6］：當(dāng)長度小于12 bp時，呈低多態(tài)性；片段長度為12～20 bp時，呈中度多態(tài)性；長度大于20 bp時，呈高多態(tài)性［37］。從SSR片段長度來看，本次基于轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的文蛤微衛(wèi)星中71.22%的長度處于12～20 bp之間，屬于中度多樣性。這對后續(xù)微衛(wèi)星分子標(biāo)記開發(fā)有一定的利用價值。

4 小結(jié)

本研究利用生物信息學(xué)軟件分析比較了文蛤轉(zhuǎn)錄組中微衛(wèi)星序列的分布特征，結(jié)果顯示：文蛤具有以單堿基為主、三四堿基重復(fù)次之的微衛(wèi)星序列；文蛤轉(zhuǎn)錄組SSR共包含26種重復(fù)基元，其中優(yōu)勢基元為單堿基重復(fù)A／T有2 809個，其次為三堿基重復(fù)AAC／TTG有907個，四堿基和二堿基重復(fù)中的AAAC／TTTG、AT／TA分別有588、561個，說明文蛤轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星位點的分布對A／T具有偏好性。本研究結(jié)果將為研究文蛤SSR標(biāo)記開發(fā)、群體遺傳多樣性、遺傳連鎖圖譜、種質(zhì)資源鑒定和分子遺傳育種等后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。