鄭 迪，王 倩，王 磊，施兆鴻，彭士明

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

銀鯧（Pampus argenteus）屬鱸形目（Perciformes），鯧科（Stromateidae），鯧屬，因其肉質(zhì)細(xì)嫩、肌間刺較少，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的市場(chǎng)價(jià)值與需求，是我國(guó)主要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一［1］。20世紀(jì)80年代，國(guó)內(nèi)已陸續(xù)開(kāi)展銀鯧繁殖生物學(xué)方面的研究工作［2］，截至目前，已取得銀鯧的人工繁育［3］、人工育苗［4］等方面研究成果，并于2016年在寧波地區(qū)實(shí)現(xiàn)人工養(yǎng)殖銀鯧親魚(yú)近萬(wàn)尾［5］，但目前關(guān)于疾病方面的研究較少。由于馴化時(shí)間較短、銀鯧環(huán)境適應(yīng)能力較差等原因?qū)е碌牟『?wèn)題，是制約銀鯧規(guī)模養(yǎng)殖和推廣的主要因素之一。

早在20世紀(jì)初，科威特就報(bào)道了某銀鯧養(yǎng)殖基地由于無(wú)乳鏈球菌（Streptococcusagalactiae）感染引起的大規(guī)模死亡現(xiàn)象［6］，2015—2018年寧波象山地區(qū)銀鯧養(yǎng)殖基地先后爆發(fā)了由美人魚(yú)發(fā)光桿菌（Photobacterium damselae）感染導(dǎo)致的集體出血［7］和彩虹病毒感染導(dǎo)致的集中死亡現(xiàn)象［8］。此前研究所發(fā)現(xiàn)的均為細(xì)菌性或病毒性疾病，尚未見(jiàn)銀鯧腸道氣泡堆積相關(guān)的報(bào)道。腸道氣泡堆積是銀鯧養(yǎng)殖過(guò)程中一種常見(jiàn)的病理現(xiàn)象，從仔稚幼魚(yú)到高齡成魚(yú)都有可能發(fā)生，且該病發(fā)生在腸道內(nèi)部，難以發(fā)現(xiàn)和控制［9］，在養(yǎng)殖過(guò)程中致死率較高。本文通過(guò)對(duì)患有腸道氣泡堆積的銀鯧及健康銀鯧體內(nèi)的4種組織（肝臟、腎臟、肌肉、鰓）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活力、丙二醛（malondiadehyde，MDA）含量與總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC），以及兩種組織（鰓、腎臟）溶菌酶（lysozyme，LZM）活力的測(cè)定和比較，分析腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧組織抗氧化能力和溶菌酶活力的影響，以期為該病理現(xiàn)象的防治提供數(shù)據(jù)支持，促進(jìn)銀鯧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本實(shí)驗(yàn)用銀鯧采自東海水產(chǎn)研究所福鼎研究中心工廠化養(yǎng)殖車(chē)間，該車(chē)間擁有4個(gè)銀鯧養(yǎng)殖池，養(yǎng)殖水體20 m3，每個(gè)養(yǎng)殖池均采用相同的日常管理措施：每天飽食投喂2次（7∶00和16∶00），日換水量50%，水溫20～22℃，鹽度25～27，pH為8.1～8.2，溶解氧保持在7 mg·L-1。在管理過(guò)程中注意觀察魚(yú)的游動(dòng)行為，對(duì)行為異常如游動(dòng)速度加快［10］、垂直或水平停在水面［11］、躁動(dòng)不安、對(duì)驚嚇敏感甚至跳出水面［9］等疑似腸道氣泡堆積的銀鯧進(jìn)行采集，撈起后于25 mg·L-1丁香酚中麻醉，冰盤(pán)解剖，肉眼觀察其腸道內(nèi)是否有明顯的氣泡堆積，如有則可確認(rèn)其為所需要的病魚(yú)樣品（圖1）。取其肝臟、腎臟、肌肉和鰓在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗后，濾紙拭干，液氮速凍后于-80℃保存，待樣品全部采集完成后帶回實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一測(cè)定。病魚(yú)取15尾為有氣泡組，平均叉長(zhǎng)為（11.7±0.8）cm，平均體質(zhì)量為（42.8±4.1）g。另選攝食、游動(dòng)等行為正常，有活力、游動(dòng)有規(guī)律且解剖觀察腸道無(wú)氣泡堆積的健康魚(yú)15尾為對(duì)照組，平均叉長(zhǎng)為（12.5±0.7）cm，平均體質(zhì)量為（48.6±5.6）g。兩組樣品取樣方法一致。

圖1 病魚(yú)的腸道氣泡堆積Fig.1 Intestinal bubble accumulation in diseased Pampus argenteus

1.2 酶活力測(cè)定

銀鯧的肝臟、腎臟、肌肉和鰓組織中蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，T-AOC、CAT、SOD和LZM活力、MDA含量的測(cè)定均嚴(yán)格按照南京建成生物公司檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。隨機(jī)取3尾魚(yú)的樣品組織混為一個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)照組與病魚(yú)組每個(gè)組織分別檢測(cè)5次，每次檢測(cè)3個(gè)重復(fù)，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，分析各組間相關(guān)參數(shù)差異顯著性，并使用Excel 2010作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧4種組織中T-AOC活力的影響

腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧4種組織T-AOC活力的影響見(jiàn)圖2，相比對(duì)照組，病魚(yú)組肝臟、鰓和腎臟中T-AOC活力都有下降，其中肝臟和腎臟下降顯著（P＜0.05）；但病魚(yú)組肌肉中T-AOC活力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖2 腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧4種組織中T-AOC活力的影響Fig.2 Effect of intestinal bubble accumulation on T-AOC activity in 4 tissues of Pampus argenteus

2.2 腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧4種組織中SOD活力的影響

腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧4種組織SOD活力的影響見(jiàn)圖3，肝臟中SOD活力高于其他各組織；對(duì)照組肝臟和肌肉中SOD活力顯著高于病魚(yú)組（P＜0.05），而在鰓和腎臟SOD活力在病魚(yú)組與對(duì)照組間沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。

圖3 腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧4種組織中SOD活力的影響Fig.3 Effect of intestinal bubble accumulation on SOD activity in 4 tissues of Pampus argenteus

2.3 腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧4種組織中CAT活力的影響

腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧4種組織CAT活力的影響見(jiàn)圖4，肝臟中CAT活力高于其他組織；對(duì)照組肝臟和肌肉中CAT活力顯著高于病魚(yú)組（P＜0.05），而在鰓和腎臟中沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。

2.4 腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧4種組織中MDA含量的影響

腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧4種組織MDA含量的影響見(jiàn)圖5，病魚(yú)組肝臟和肌肉中MDA含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但鰓和腎臟中MDA含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖4 腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧4種組織中CAT活力的影響Fig.4 Effect of intestinal bubble accumulation on CAT activity in 4 tissues of Pampus argenteus

圖5 腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧四種組織中MDA含量的影響Fig.5 Effect of intestinal air bubble accumulation on MDA content in various tissues of Pampus argenteus

2.5 腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧兩種組織中LZM活力的影響

腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧兩種組織LZM活力的影響見(jiàn)圖6，病魚(yú)組鰓上LZM活力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而在腎臟中沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。

圖6 腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧兩種組織中LZM活力的影響Fig.6 Effect of intestinal bubble accumulation on LZM activity in 2 tissues of Pampus argenteus

3 討論

目前對(duì)于魚(yú)類(lèi)腸道氣泡堆積的研究還不深入，腸道內(nèi)大氣泡的形成是來(lái)自各組織以及血管的微氣泡匯集，通常在顯微鏡下便可觀察到微氣泡的移動(dòng)和匯集［12］。微氣泡最初如何形成尚待研究，但這些微氣泡的移動(dòng)和匯集會(huì)引起組織損傷并隨之導(dǎo)致自由基的增多，而過(guò)量的自由基則會(huì)破壞宿主細(xì)胞［13］。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，魚(yú)類(lèi)機(jī)體形成了一套抗氧化酶防御系統(tǒng)，主要包括CAT、SOD等，可以有效地將機(jī)體多余的自由基清除，保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷［14］。

3.1 腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧4種組織抗氧化酶活力的影響

總抗氧化能力是評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)功能的綜合性指標(biāo)［15］，可以反映機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的狀態(tài)。已有研究表明，病害的發(fā)生會(huì)顯著降低水產(chǎn)動(dòng)物抗氧化酶活力，如患水霉病鯉（Cyprinuscarpio）與健康鯉相比，血漿總抗氧化能力極顯著降低［16］；陳萍等［17］用溶藻弧菌感染三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus）后發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力顯著降低。本研究中，病魚(yú)組肝臟和腎臟T-AOC活力下降顯著，說(shuō)明腸道氣泡堆積會(huì)導(dǎo)致銀鯧部分組織T-AOC活力降低，造成魚(yú)體抗氧化系統(tǒng)紊亂。

SOD和CAT是清除活性氧自由基的重要酶蛋白，對(duì)機(jī)體細(xì)胞損傷后的氧化過(guò)程和吞噬作用具有很強(qiáng)的防御功能，通常認(rèn)為：SOD在清除活性氧的過(guò)程中最早發(fā)揮作用，它首先促使O2-歧化為H2O2和H2O，隨后CAT再將H2O2催化為H2O和O2，從而達(dá)到為機(jī)體解毒的目的［18］。在本實(shí)驗(yàn)中，患有腸道氣泡堆積的銀鯧鰓和腎臟中的SOD、CAT活力和健康銀鯧沒(méi)有顯著差異，但肝臟和肌肉中的SOD、CAT活力顯著低于健康銀鯧，說(shuō)明就抗氧化酶系統(tǒng)而言，腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧肝臟和肌肉的影響較大，對(duì)鰓和腎臟影響相對(duì)較小，這在陳寅兒等［19］對(duì)三疣梭子蟹乳化病的研究中也有類(lèi)似結(jié)論。對(duì)于肌肉中T-AOC活力的顯著上升，而SOD、CAT活力顯著下降現(xiàn)象，其原因可能是魚(yú)體在腸道氣泡堆積發(fā)生情況下的一種機(jī)體自我保護(hù)機(jī)制，具體原因需要進(jìn)一步的研究確定。

MDA是一種高活力的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，既可用作脂質(zhì)過(guò)氧化程度的衡量指標(biāo)，也可間接反映機(jī)體內(nèi)活性氧的累計(jì)［20］，該指標(biāo)常與SOD和CAT活力指標(biāo)相互配合使用［21］。在本實(shí)驗(yàn)中，患病銀鯧的肝臟和肌肉中的MDA含量顯著高于健康銀鯧，說(shuō)明這兩處組織已出現(xiàn)自由基的代謝紊亂，而過(guò)多自由基的產(chǎn)生以及自由基清除酶的活力降低或合成障礙，使得自由基進(jìn)一步堆積，加劇損害，這與前文CAT和SOD活力研究相符合。另外，本實(shí)驗(yàn)選取病魚(yú)樣品為腸道內(nèi)已有大氣泡聚集，即發(fā)病后期，氣泡在魚(yú)體內(nèi)移動(dòng)，匯集期間產(chǎn)生的組織損傷或許是導(dǎo)致這兩處組織MDA含量異常的原因之一。對(duì)于在鰓和腎臟中，患病銀鯧MDA含量顯著低于健康銀鯧，其原因可能在腸道氣泡堆積發(fā)生期間，這兩處組織應(yīng)對(duì)其病理發(fā)生的機(jī)制與肝臟和肌肉組織有所差異［22］，具體原因仍需進(jìn)一步研究分析。

3.2 腸道氣泡堆積對(duì)銀鯧兩種組織溶菌酶活力的影響

LZM是白細(xì)胞中一類(lèi)先天免疫防御成分，它通過(guò)水解細(xì)胞壁中的肽聚糖來(lái)殺滅細(xì)菌［23］，其活性一定程度上可以反映機(jī)體抵御細(xì)菌侵襲的能力［24］。在本實(shí)驗(yàn)中，患病銀鯧腎臟LZM活力與健康銀鯧沒(méi)有顯著差異，但鰓上LZM活力顯著高于健康銀鯧。腸道氣泡堆積的發(fā)生極易造成組織損傷，從而導(dǎo)致各種致病微生物繼發(fā)感染，其中尤以細(xì)菌和真菌最多見(jiàn)［12］，所以患病魚(yú)鰓上很有可能出現(xiàn)細(xì)菌感染，從而激發(fā)了鰓上溶菌酶免疫應(yīng)答體系，使得LZM的活力顯著升高，但具體原因仍有待進(jìn)一步分析確定。另外，在理化和生物因子異常引起的脅迫情況下，LZM活力也可以作為魚(yú)類(lèi)應(yīng)激程度的指示信號(hào)［25］。有研究顯示，當(dāng)水體中懸浮物過(guò)多時(shí)，半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevisGünther）肝臟中LZM活力在5d內(nèi)顯著升高［26］。華 育 平 等［27］發(fā) 現(xiàn) 嗜 水 氣 單 胞 菌（Aeromonashydrophila）感染后的施氏鱘（Acipenser schrenckii）血清及各組織中LZM出現(xiàn)不同程度升高。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)腸道氣泡堆積發(fā)生時(shí)，微氣泡從組織和血管移動(dòng)到腸道匯集成大氣泡，而鰓作為魚(yú)類(lèi)呼吸器官，同時(shí)也是微血管最密集的體組織之一，有可能處于應(yīng)激狀態(tài)，但仍需其他指標(biāo)進(jìn)行佐證。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)患有腸道氣泡堆積的銀鯧及健康銀鯧體內(nèi)4種組織（肝臟，腎臟、肌肉和鰓）SOD、CAT、T-AOC活力、MDA含量以及兩種組織（鰓和腎臟）LZM的測(cè)定和比較，發(fā)現(xiàn)該病對(duì)魚(yú)類(lèi)肝臟、肌肉抗氧化酶活力影響較大，這兩種組織的抗氧化酶活力指標(biāo)或可以成為該病檢測(cè)和病理分析的重要依據(jù)之一，而腸道氣泡堆積導(dǎo)致的鰓溶菌酶活力升高，可能是腸道氣泡堆積發(fā)生期間伴隨著鰓組織炎癥的發(fā)生，具體原因仍待進(jìn)一步深入研究分析。