張玉寧，章 群，黃柏炎，宮亞運，羅 純，黃志基

（暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣州 510632）

緣邊銀鱸（GerreslimbatusCuvier，1830）隸屬于鱸形目（Perciformes）銀鱸科（Gerreidae）銀鱸屬，主要分布于印度洋西部、北部至西太平洋的東南亞海域及中國南海、東海等海域［1］，棲息于河口、紅樹林地帶等近海海岸和淺海區(qū)。短棘銀鱸（G.lucidus）為緣邊銀鱸的同物異名，有研究認(rèn)為前者為后者的幼年狀態(tài)［2］。緣邊銀鱸體長通常不超過15 cm，是小型經(jīng)濟魚類，肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，具有一定的資源開發(fā)和利用價值。緣邊銀鱸是低等捕食者，主要攝食底棲生物［3］，也是上層獵食者的食物，在食物鏈的關(guān)系中處于中下水平的位置，在近海生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用。近年來由于海洋環(huán)境惡化和過度捕撈等原因［4-5］，緣邊銀鱸逐漸成為近海漁獲中的偶見物種，其群體資源量和遺傳特性的狀況，也可以在一定程度上間接反映近海漁業(yè)資源量的動態(tài)變化。

研究中國沿海緣邊銀鱸種群遺傳背景，有利于了解其種群的資源現(xiàn)狀，并可為其種質(zhì)遺傳資源的保護(hù)和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。目前國內(nèi)外對緣邊銀鱸的研究主要涉及資源狀況、生長發(fā)育、形態(tài)比較區(qū)分、新種分布等方面［6-8］，國內(nèi)尚未見對于緣邊銀鱸遺傳背景的研究。動物線粒體DNA屬母系遺傳，拷貝數(shù)多，無組織特異性，具有閉合環(huán)狀相對穩(wěn)定的基因結(jié)構(gòu)，不易降解，成為動物種群遺傳研究的首選分子標(biāo)記［9］。其中，細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ（cytochrome oxidase subunitⅠ，COⅠ）5′約652 bp序列已廣泛應(yīng)用于動物種類鑒定的DNA條形碼研究中［10］。目前國內(nèi)外建立了FishBol（http：／／www.fishbol.org／）等大型數(shù)據(jù)庫，為開展相關(guān)物種的種群遺傳學(xué)研究提供了大量數(shù)據(jù)可茲利用。近年來，國內(nèi)外有不少研究同樣利用COⅠ基因來研究魚類遺傳多樣性狀況的報道，如褐籃子魚（Siganusfuscescens）［11］、多鱗四指馬（Eleutheronemarhadinum）［12］、星點東方鲀（Takifuguniphobles）［13］等。本研究基于線粒體COⅠ基因片段序列對中國東南沿海多個緣邊銀鱸群體進(jìn)行遺傳學(xué)分析，探究該物種群體分布區(qū)的遺傳多樣性狀況，以期為物種保護(hù)和遺傳狀況評估提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

實驗材料采自中國東南沿海4省9個地理群體，鑒定后以95%乙醇溶液保存?zhèn)溆谩y定的樣本包括廣西東興（GDX）13尾、合浦（GHP）15尾，海南新盈（QXY）14尾，廣東安鋪（YAP）25尾、硇洲島（YNZ）8尾、陽江（YYJ）22尾、碣石（YJS）19尾，福建福清（MFQ）7尾、寧德（MND）12尾共4省9個群體135尾緣邊銀鱸COⅠ基因序列。結(jié)合GenBank下 載 的 廣 東 陽 江（EF607388、EF607392）、福建福清（KY315350、KY315355、KY315357）等序列，總共分析了9個地理群體的140條COⅠ基因序列。緣邊銀鱸采樣地點分布見圖1所示。

圖1 緣邊銀鱸采樣點分布圖（仿自孫湘平［14］）Fig.1 Sampling sites of G.limbatus（adopted from SUN Xiangping［14］）

1.2 DNA提取與PCR擴增

取適量標(biāo)本魚體背部肌肉，經(jīng)蛋白酶K消化完全后，采取酚-仿法提取DNA［15］。PCR反應(yīng)體系和擴增條件參考WARD等［10］的實驗方法。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測電泳條帶，確認(rèn)得到預(yù)期PCR擴增產(chǎn)物后，送華大基因測序公司純化測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序所得序列使用Bioedit 7.0.9.0進(jìn)行人工校對和多序列比對。利用MEGA 7.0計算核苷酸組分占比、堿基變異值、轉(zhuǎn)換顛換值，統(tǒng)計突變位點數(shù)。采用DnaSP 6.12.03軟件計算單倍型數(shù)、單倍型多樣性（haplotype diversity，Hd）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，π）、核酸不配對分析（mismatch distribution）。采用Network 5.0構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。以Arlequin 3.5.2.2估算遺傳分化系數(shù)（Fst）和群體間基因流的值（Nm）；通過分子方差分析（analysis of molecular variation，AMOVA）分析遺傳變異分布情況，以1 000次置換分析統(tǒng)計學(xué)顯著性；計算Tajima'sD和Fu'sFs值并進(jìn)行中性檢驗，得到方差值（sum of square deviations，SSD）、參差指數(shù)r值（Harpending's raggedness index，Rg）、τ值參數(shù)。結(jié)合中性檢驗和核酸不配對分析檢測種群歷史動態(tài)。根據(jù)公式“T＝（τ／2μk）×世代時間”計算種群擴張時間。其中，T是種群擴張時間；τ是種群擴張時間參數(shù)；μ是序列的變異速率；k是序列長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 COⅠ基因片段序列特征和遺傳多樣性

在140條緣邊銀鱸COⅠ基因5′端652 bp序列中，T、C、A和G含量分別為28.7%、30.7%、22.7%和17.9%。A＋T含量（51.4%）略高于C＋G含量（48.6%），堿基組成顯示一定的偏倚性，與其他魚類的COⅠ堿基含量分布特性相似［10］。發(fā)現(xiàn)變異位點14個，簡約信息位點6個，單倍型13個。轉(zhuǎn)換和顛換比（Ts／Tv）為4.0，表明序列進(jìn)化還未趨于飽和，適用于進(jìn)行種群遺傳分析［16］。緣邊銀鱸整體的單倍型多樣性指數(shù)（Hd＝0.276±0.050）和核苷酸多樣性（π＝0.000 5±0.000 1）都相對較低。其中單倍型多樣性最高的是碣石群體（Hd＝0.456），其次是寧德群體（Hd＝0.439）。核苷酸多樣性最高的是硇洲群體（π＝0.001 1），其次是寧德群體（π＝0.001 0）。合浦群體和新盈群體遺傳多樣性指數(shù)均呈現(xiàn)最低（Hd＝0，π＝0）。以瓊州海峽為界，北部灣沿海的廣西東興與合浦與廣東安鋪和海南新盈群體遺傳多樣性普遍低下（Hd＜0.300，π≤0.000 5）；而瓊州海峽以東廣東至福建沿海群體的遺傳多樣性則相對較高（Hd＞0.300，π≥0.000 6）。各群體的遺傳多樣性指數(shù)詳見表1。

2.2 緣邊銀鱸遺傳分化

140條COⅠ序列中總共檢測到13個單倍型。其中單倍型Hap_1數(shù)量最多（119條），其他單倍型數(shù)量較少，單倍型內(nèi)的個數(shù)均不超過6個。Hap_1為所有群體共享，Hap_3為東興、碣石、福清和寧德群體共享，Hap_4為安鋪和碣石群體共享，Hap_8為陽江、碣石群體共享，其余單倍型分布于各群體。除新盈和合浦群體僅含共享單倍型Hap_1外，其他群體都擁有幾個獨有的單倍型。

單倍型最大簡約性網(wǎng)絡(luò)圖為典型的星狀放射結(jié)構(gòu)，沒有明顯的地理聚群和譜系結(jié)構(gòu)（圖2）。主體單倍型Hap_1（占比85.00%，119／140）位于網(wǎng)絡(luò)中心，其他單倍型由此衍生，表明緣邊銀鱸群體經(jīng)過歷史上的種群擴張。

群體間遺傳分化（Fst＝-0.041 5～0.169 6，P＞0.05）詳見表2。其中，硇洲群體與其他群體間為不顯著的中低度分化（0.077 3～0.169 6）。寧德群體和合浦群體、新盈群體的Fst值分別為0.061 2和0.054 2，也表現(xiàn)為不顯著的低度分化。其他各群體間的Fst值為-0.041 5～0.044 6，不存在明顯分化。

表1 緣邊銀鱸的遺傳多樣性指數(shù)Tab.1 Genetic diversity of G.limbatus

圖2 緣邊銀鱸單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Parsimony network of G.limbatus haplotypes

將9個群體依照海區(qū)位置，通過3種不同方式進(jìn)行AMOVA分析：①9個地理群體；②北部灣群組（東興、合浦、新盈、安鋪）、廣東群組（硇洲、陽江、碣石）、福建群組（福清、寧德）；③海島群組（硇洲、新盈）、大陸群組（東興、合浦、安鋪、陽江、碣石、福清、寧德）。AMOVA分析（表3）表明3種分組方式的主要變異均發(fā)生在群體內(nèi)，群體間的差異來源非常小，而群體內(nèi)的變異來源比例達(dá)到95%以上，變異比例分別為97.17%、96.95%、95.81%。同時3種分組方法下3種群組間的Fst值為0.028 3～0.041 9，說明群組間無明顯分化（0.05＜Fst＜0.15，0.01＜P＜0.05）。

表2 緣邊銀鱸群體的遺傳分化系數(shù)（F st）Tab.2 F st among G.limbatus populations

表3 緣邊銀鱸種群結(jié)構(gòu)的分子方差分析Tab.3 Analysis ofmolecular variation（AMOVA）among populations of G.limbatus

2.3 緣邊銀鱸種群歷史動態(tài)

中性檢驗結(jié)果見表4。在Tajima'sD結(jié)果中，除合浦、新盈、硇洲群體外，安鋪、陽江、福清群體為顯著性負(fù)值（-1.987 3～-1.400 9，P＜0.05），其他群體為不顯著性負(fù)值。在Fu'sFs結(jié)果中，東興、安鋪、陽江、碣石、福清5個群體為顯著性負(fù)值（-3.143 5～-1.163 9，P＜0.05）。9個群體整體的Tajima'sD＝-2.254 9、Fu'sFs＝-16.472 5，均為顯著性負(fù)值，呈現(xiàn)出群體擴張跡象。群體整體SSD值及Rg值數(shù)值均較小且不具統(tǒng)計顯著性（P＞0.05），表明上述觀測值沒有顯著偏離擴張模型。Fu'sFs檢驗比Tajima'sD檢驗對近期群體擴張更為敏感，且群體整體核苷酸錯配圖（圖3）呈現(xiàn)出明顯單峰，加上單倍型網(wǎng)絡(luò)圖為典型的星型結(jié)構(gòu)，說明其種群在歷史上經(jīng)歷過快速擴張事件［17-18］。緣邊銀鱸樣本群體總體擴張參數(shù)τ為0.566 7，參考WANG等［19］，以COⅠ基因進(jìn)化速率為每百萬年1%～3%計算，參考同屬長棘銀鱸（G.filamentosus）生長特性［20］，以性成熟期3年為參數(shù)，估算種群擴張時期大約為距今0.130 4～0.043 5百萬年，地質(zhì)史上處于晚更新世時期。

3 討論

3.1 緣邊銀鱸種群歷史動態(tài)

當(dāng)單倍型多樣性Hd小于0.5、核酸多樣性π小于0.005時，表示種群近期可能經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)［21］。緣邊銀鱸COⅠ序列遺傳多樣性水平（Hd＝0.276±0.050，π＝0.000 5±0.000 1）遠(yuǎn)低于上述標(biāo)準(zhǔn)，表明中國沿海緣邊銀鱸種群近期經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)。根據(jù)中性檢驗的Tajima'sD檢驗法重點關(guān)注較長跨度時間范圍內(nèi)所發(fā)生的擴張事件；而Fu'sFs檢驗法則更側(cè)重反映種群近期的擴張事件，當(dāng)種群在近期積累較多突變時，F(xiàn)s往往是較大的負(fù)值［22］。緣邊銀鱸總體Tajima'sD（-2.254 9，P＜0.01）和Fu'sFs值（-16.472 5，P＜0.01）均為顯著性負(fù)值；同時緣邊銀鱸13種單倍型中各群體的共享單倍型Hap_1占比達(dá)到85.00%，單倍型網(wǎng)絡(luò)圖呈現(xiàn)明顯的星狀結(jié)構(gòu)［23］；另外核苷酸錯配圖為明顯單峰；表明緣邊銀鱸在歷史上經(jīng)歷過種群擴張事件。根據(jù)中性溯祖理論，估算緣邊銀鱸種群擴張時期大約發(fā)生在距今0.130 4～0.043 5百萬年。這一地質(zhì)時期的北半球歷經(jīng)冰期／間冰期的交替變化［24］，海平面升降變動，大部分近海魚類因此交替發(fā)生瓶頸效應(yīng)與種群的快速擴張［25］。冰盛期北部灣大陸架出露，緣邊銀鱸種群生存空間被迫壓縮至瓊州海峽以東的邊緣海，出現(xiàn)瓶頸效應(yīng)；間冰期海平面上升，緣邊銀鱸群體出現(xiàn)種群的快速擴張。

圖3 緣邊銀鱸群體整體核苷酸錯配圖Fig.3 Nucleotidem ismatch distribution of G.limbatus haplotypes

表4 緣邊銀鱸中性檢驗和不對稱分析Tab.4 Neutrality tests and m ism atch analysis of G.limbatus

3.2 緣邊銀鱸遺傳多樣性與遺傳分化

物種遺傳多樣性模式受其進(jìn)化歷史影響。與同海域的長棘銀鱸（Hd＝0.767±0.018，π＝0.005 5±0.003 7）［26］、多鱗四指馬（Hd＝0.759±0.035，π＝0.001 98±0.003 26）［12］、鯔（Mugilcephalus）（Hd＝0.956，π＝0.027 9）［27］等魚類的遺傳多樣性相比，緣邊銀鱸遺傳多樣性明顯偏低。由于緣邊銀鱸在河口、內(nèi)灣的潮汐帶和非常淺的海區(qū)棲息，易受近海污染、棲息地破壞、過度捕撈等制約因素的影響，在一定程度上也導(dǎo)致了遺傳多樣性的進(jìn)一步降低。與棲息于深層水域的魚類相比，更新世以來的冰期和間冰期交替變化所造成的海平面升降波動，更容易使生活于近海淺海區(qū)的緣邊銀鱸面臨瓶頸效應(yīng)的脅迫。

緣邊銀鱸群體間Fst為-0.041 5～0.169 6（P＞0.05）。AMOVA分析結(jié)果顯示遺傳變異主要來源于群體內(nèi)個體間的分化，幾種不同分組方式下的群體內(nèi)的變異來源比例均達(dá)到95%以上，表明中國沿海的緣邊銀鱸為一個隨機交配種群。由于有研究認(rèn)為瓊州海峽形成于全新世中期的海侵，在地質(zhì)史上形成年代較晚［28］，據(jù)此推測緣邊銀鱸主群體方擴張至北部灣海區(qū)時間短，以致群體間遺傳分化不明顯；東興、合浦、安鋪、新盈等4個邊緣群體，沒有足夠時間積累遺傳變異，遺傳多樣性明顯低于瓊州海峽以東群體。

3.3 緣邊銀鱸種群資源保護(hù)

緣邊銀鱸棲息于近岸海域，其生境生態(tài)受沿海地區(qū)環(huán)境變動和人類活動的影響較大。由于海洋環(huán)境惡化，海岸污染持續(xù)［4］，加上長期以來近海捕撈壓力的增大，許多漁業(yè)資源總體上是退化的［5］。緣邊銀鱸遺傳多樣性不高，群體數(shù)量不多，其種群資源亟需保護(hù)。本研究中，緣邊銀鱸各地理群體間的分化程度較低，可以將其看作一個進(jìn)化顯著單位。而寧德群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性都相對較高，此外硇洲群體與其他群體的遺傳分化系數(shù)較大且其核苷酸多樣性最高，均可作為優(yōu)先管理保護(hù)單位。北部灣群體整體上的遺傳多樣性最低，應(yīng)重視對其群體資源的保護(hù)。由于本研究所選取的COⅠ序列片段中的基因變異程度低，推測其變異速率不夠高，同時受采集地點及樣本數(shù)量的限制，在今后的研究中，可以采用測序線粒體控制區(qū)，基于微衛(wèi)星標(biāo)記或簡化基因組等方法分析更多大樣本的地理群體，深入了解緣邊銀鱸遺傳背景，以更好地為中國緣邊銀鱸的種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)利用提供更多的理論科學(xué)依據(jù)。