張柱亭 ，英 美 ，周金成 ?，董 輝

（1. 凱里學院，凱里 556011；2. 沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，沈陽 110866）

松毛蟲赤眼蜂Trichogramma dendrolimi是一種被廣泛應用于防治多種鱗翅目害蟲的卵期寄生蜂[1,2]。自20世紀50年代至今，我國逐漸形成了一套以柞蠶卵Antheraea pernyi為替代寄主的大卵繁育技術(shù)體系[3-5]。柞蠶卵繁育松毛蟲赤眼蜂具有繁蜂效率高、寄主易于獲得、便于貯藏和運輸?shù)葍?yōu)點。然而，柞蠶卵育出的松毛蟲赤眼蜂在規(guī)模化生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)中均長期脫離其自然寄主，因而缺乏自然寄主的嗜好性刺激和聯(lián)系性學習，對田間自然寄主的定位、搜尋和識別能力存在衰退風險，導致赤眼蜂可能只“認識”其替代寄主而“不認識”其自然寄主[6]。因此，要想從根本上提高釋放赤眼蜂的防效，首先應改善室內(nèi)規(guī)?；庇乃擅x赤眼蜂對田間靶標寄主害蟲的嗜好性。

寄生蜂的記憶和學習行為是影響其寄主選擇行為的重要因子。寄生蜂可通過接受各種外界刺激，建立起對寄主昆蟲的“聯(lián)想”，在成長過程中逐步積累起新的行為模式。寄生蜂的學習行為不僅存在于成蟲階段，也可發(fā)生于幼期及羽化早期[7]。這種動物的早期學習行為曾被廣泛報道于脊椎動物中，如某些成年動物個體總是偏向于選擇其出生地相似的環(huán)境，這種現(xiàn)象被稱為出生地偏好誘導（Natal habitat preference inducing，NHPI）。在昆蟲中最早的描述則見于“Hopkins寄主選擇原理”（Hopkins’s host selection principle）。該理論認為昆蟲幼期的經(jīng)歷會塑造成蟲對化學氣味的選擇偏好[8]。例如，以非自然寄主小蠟螟 Meliphora grisella繁育的倉蛾姬蜂Venturia canescens對非自然寄主的嗜好程度顯著提高[9]。在該原理基礎上，Corbet[10]進一步提出了“化學遺贈假說”，認為寄生蜂在羽化過程中已經(jīng)與寄主物質(zhì)發(fā)生接觸，而這種寄主棲境遺贈的化學信號將對寄生蜂隨后的行為產(chǎn)生深遠影響，即羽化條件作用（Emergence condition）。這種作用同樣存在于赤眼蜂中，有學者發(fā)現(xiàn)一種赤眼蜂Trichogramma nrivelae對不同寄主的嗜好性受其早期羽化經(jīng)歷的影響[11]。Scholz[12]則認為，要想充分發(fā)揮赤眼蜂的防治效果，就應該盡可能選取其目標害蟲的卵作為飼養(yǎng)寄主。然而以自然寄主繁育赤眼蜂存在飼養(yǎng)成本高、產(chǎn)能不足及難以儲存等諸多問題，以替代寄主大規(guī)模繁育赤眼蜂仍然是主要方式。在規(guī)?；庇倪^程中，如果能在赤眼蜂幼期或早期羽化階段增加自然寄主的某些化學刺激，可能將改善子代蜂對自然寄主的靶向作用。

為改善柞蠶卵繁育的松毛蟲赤眼蜂對自然寄主害蟲的靶向作用，本研究以其主要目標害蟲之一亞洲玉米螟為例，利用亞洲玉米螟卵、幼蟲、雌蛾腹部的正己烷粗提取液，在松毛蟲赤眼蜂寄生及子代羽化前分別施加不同提取液的氣味刺激，比較處理后孤雌產(chǎn)雌品系和兩性品系子代雌蜂對目標寄主（亞洲玉米螟）和替代寄主（柞蠶卵）的選擇偏好。研究結(jié)果將為提高規(guī)?；庇奶鞌忱ハx對目標害蟲的靶向作用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis由沈陽農(nóng)業(yè)大學害蟲生物防治研究室連代飼養(yǎng)，成蟲通過無菌棉球蘸取15%蜂蜜水每日飼喂，以硫酸紙作為其產(chǎn)卵介質(zhì)。玉米螟產(chǎn)卵后，將新鮮 1日齡卵塊剪下后備用。柞蠶Antheraea pernyi由遼寧省蠶業(yè)科學研究所（遼寧省鳳城市）提供。柞蠶卵屬于目前工廠化繁育赤眼蜂的中間寄主，為柞蠶雌蛾腹部解剖后獲得的未受精剖腹卵。取羽化后2日齡的雌蛾剖腹卵，經(jīng)無菌水漂洗并去除綠卵、病卵后備用。

本試驗所使用松毛蟲赤眼蜂Trichogramma dendrolimi品系分別為感染W(wǎng)olbachia的產(chǎn)雌孤雌品系和未感染W(wǎng)olbachia的兩性品系。兩種品系均來源于同一個自然種群，感染W(wǎng)olbachia的產(chǎn)雌孤雌品系最初通過顯微注射，將Wolbachia人工轉(zhuǎn)染至未感染W(wǎng)olbachia的兩性生殖品系雌蜂后獲得。

所有供試昆蟲均在（25±1）℃，相對濕度（70±5）%，光周期16L:8D條件下飼養(yǎng)。

1.2 提取液的制備

本試驗雌蜂預設4種提取液處理水平，分別為亞洲玉米螟卵提取液、幼蟲提取液、成蟲腹部提取液以及正己烷溶液對照。不同提取液的制備方法如下：

卵提取液：用毛刷將新鮮玉米螟卵塊從產(chǎn)卵介質(zhì)上刮下后稱取1 g，加正己烷溶液50 mL浸提2 h，取上清液轉(zhuǎn)移至-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

蛾腹部提取液：取羽化后2日性成熟的玉米螟雌蛾腹部鱗片，稱取10 g鱗片后加入正己烷溶液50 mL浸提2 h，取上清液轉(zhuǎn)移至-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

幼蟲提取液：取3齡玉米螟幼蟲研磨后稱取10 g 幼蟲勻漿，50 mL浸提2 h，取上清液轉(zhuǎn)移至-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

正己烷溶液：取20 mL正己烷溶液作為對照，置于-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗設計

為使松毛蟲赤眼蜂在幼期和羽化前期接觸到不同提取液的氣味，本試驗取新鮮的柞蠶卵 50粒置于玻璃試管內(nèi)，接蜂前1 h，用塑料霧化噴頭分別將卵、幼蟲、雌蛾腹部提取液及正己烷溶液約1 mL均勻噴涂于柞蠶卵卡表面。之后接入孤雌產(chǎn)雌品系或兩性品系雌蜂約100頭，寄生24 h后移出雌蜂。待柞蠶卵內(nèi)子代蜂羽化前24 h（發(fā)育14 d）時，再次在寄生柞蠶卵塊表面均勻噴涂相應提取液或正己烷溶液，使初羽化的子代蜂能充分接觸到提取液的氣味。

本試驗采用改裝的“Y”形管檢驗雌蜂對寄主的選擇性?！癥”形管（臂長6 cm，內(nèi)徑0.8 cm，夾角75°）分別與空氣泵、加濕器、流量計相連接，直型臂（管長5 cm）不接任何裝置，該區(qū)是空氣混合通過的區(qū)域，直管管口引入的雌蜂在此區(qū)域接觸亞洲玉米螟卵和柞蠶卵的氣味源?！癥”形管兩臂用于隨機放置亞洲玉米螟卵塊或柞蠶卵，本試驗采用的空氣流速為200 mL/min。根據(jù)赤眼蜂趨光性強的特點，光源保持在直通區(qū)域的正上方，以避免干擾試驗結(jié)果。

試驗每次于直通區(qū)接入1頭雌蜂，在“Y”型玻璃管兩臂各放置1粒柞蠶卵和1塊玉米螟卵塊，并使氣流由兩臂流向直通臂。接入雌蜂后開始計時，觀察300 s內(nèi)雌蜂選擇寄主的類型、時間和寄主駐留累積時間。300 s內(nèi)未選擇寄主的雌蜂則被視為無效重復，更換雌蜂重新開始試驗。每測1頭雌蜂后用無水乙醇擦拭各區(qū)域后自然晾干，再開始下一頭雌蜂的測試。試驗每測試1頭雌蜂則交替更換Y型玻璃管兩臂內(nèi)的寄主卵類型，以避免因兩臂結(jié)構(gòu)、氣流流量的微小差異帶來的試驗誤差。試驗共設提取液處理類型和雌蜂品系兩因素，共8組處理水平，每處理水平重復觀察20頭雌蜂。

統(tǒng)計每頭雌蜂對靶標寄主卵（亞洲玉米螟卵）和替代寄主卵（柞蠶卵）的選擇比例，并記錄對靶標寄主卵的選擇時間，以及選擇靶標寄主后雌蜂在靶標寄主卵塊上的單次駐留時間。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

因數(shù)據(jù)不滿足方差同質(zhì)性假定，本研究采用非參數(shù)檢驗中的符號單尾測驗（One side sign test）分別檢驗了不同提取液馴化的雌蜂對靶標寄主卵的選擇比例是否顯著高于對照組。為檢驗長期飼養(yǎng)對孤雌產(chǎn)雌品系和兩性品系雌蜂寄主嗜好性的影響，采用符號雙尾測驗（Two side sign test）分析了對照組孤雌產(chǎn)雌品系和兩性品系雌蜂間對靶標寄主卵選擇比例的差異。為比較不同提取液對雌蜂對目標寄主的靶向性改善效果，不同提取液處理的同品系雌蜂對靶標寄主卵的選擇比例差異也采用符號雙尾測驗進行檢驗[12]。

隨接蜂時間的延長，雌蜂對選擇靶標寄主卵的累積風險采用考克斯比例風險模型（Cox’s cumhazed risk model）進行分析[14]。采用廣義線性模型（Generalized linear model）分析不同馴化處理和雌蜂品系對雌蜂在靶標卵塊駐留時間的影響。為滿足模型正態(tài)性和方差同質(zhì)性假定，模型選用伽馬分布（Gamma distribution），以避免統(tǒng)計學第二類錯誤。不同處理組下試驗指標間的多重比較采用 Tukey-HSD法進行檢驗[12]。本試驗所得數(shù)據(jù)均使用R統(tǒng)計軟件進行分析[15]，差異顯著水平設定為0.05。

2 結(jié)果與分析

符號檢驗結(jié)果表明，對照組孤雌產(chǎn)雌品系雌蜂（55.00%）對靶標寄主的選擇性顯著高于對照組兩性生殖品系雌蜂（20.00%）。單尾測驗表明，分別經(jīng)玉米螟卵、幼蟲和雌蛾腹部提取液馴化的兩性生殖品系雌蜂（卵：40.00%，P＝0.032；幼蟲：45.00%，P＝0.010；雌蛾腹部：60.00%，P＜0.001）對靶標寄主卵的選擇比例均顯著高于對照組雌蜂（20.00%）（圖 1A）。分別經(jīng)玉米螟卵、幼蟲和雌蛾腹部提取液馴化的孤雌產(chǎn)雌品系雌蜂（卵：50.00%，P＝0.75；幼蟲：60.00%，P＝0.41；雌蛾腹部：70.00%，P＝0.13）對靶標寄主卵的選擇比例與對照組雌蜂（55.00%）相比均無顯著差異（圖 1B）。不同提取液馴化的同品系雌蜂中，雌蛾腹部提取液馴化的兩種品系雌蜂對靶標寄主卵的選擇比例均最高，但與幼蟲和卵提取液相比均無顯著差異（圖1）。

圖1 不同提取液處理的兩性品系（A）和孤雌產(chǎn)雌品系（B）雌蜂對替代寄主和靶標寄主的選擇比例Fig. 1 The selection proportion of bisexual (A) and thelytokous (B) females treated by different extracts on alternative and target host eggs

考克斯比例風險模型分析表明，雌蜂對靶標寄主的選擇傾向受雌蜂品系和提取液類型的交互作用影響（χ2＝10.18，P＝0.017）。在兩性生殖品系雌蜂中，雌蛾腹部提取液馴化的雌蜂選擇靶標寄主的時間最短（選擇中位時間：16.00 s；瞬時選擇風險：2.95%/s），顯著短于幼蟲提取液馴化的雌蜂（143.00 s，0.31%/s；z＝3.30，P＝0.0049），但與卵提取液和對照組雌蜂的選擇傾向（卵：27.50 s，1.22 %/s，z＝1.56，P＝0.40；CK：19.50 s，1.36%/s，z＝1.09，P＝0.69）相比均無顯著差異（圖2A）。而在孤雌產(chǎn)雌品系雌蜂中，不同提取液類型對雌蜂選擇傾向均無顯著影響（χ2＝1.02，P＝0.80），卵提取液、幼蟲提取液、雌蛾腹部提取液和正己烷對照處理的雌蜂選擇中位時間分別為51.50 s、74.50 s、46.50 s和70.00 s，瞬時選擇風險分別為1.14%/s、0.92%/s、0.84%/s和1.22%/s（圖2B）。

圖2 不同提取液處理的兩性生殖品系（A）和孤雌產(chǎn)雌品系（B）雌蜂對靶標寄主的累積選擇比率Fig. 2 The cumulative probability of choosing target host eggs by bisexual (A) and thelytokous (B) females treated with different extracts

雌蜂在靶標寄主卵塊的駐留時間均不受雌蜂品系（χ2＝0.36，P＝0.55）、提取液類型（χ2＝0.031，P＝0.99）以及兩因素間的交互作用影響（χ2＝7.69，P＝0.053）。卵提取液、幼蟲提取液、雌蛾腹部提取液和正己烷對照處理的兩性生殖品系雌蜂的卵塊駐留時間分別為57.88 s、59.78 s、141.71s和118.25 s（圖3A）。卵提取液、幼蟲提取液、雌蛾腹部提取液和正己烷對照處理的孤雌產(chǎn)雌品系雌蜂的卵塊駐留時間分別為99.90 s、95.01 s、47.21 s和69.45 s（圖3B）。

圖3 不同提取液處理的兩性生殖品系（A）和孤雌產(chǎn)雌品系（B）雌蜂的卵塊駐留時間Fig. 3 The residence duration of bisexual (A) and thelytokous (B) females treated by different extracts

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)提取液處理的對照組兩性生殖雌蜂對替代寄主柞蠶卵的偏好性較高（圖1A），而孤雌產(chǎn)雌生殖的雌蜂對柞蠶卵和亞洲玉米螟卵的選擇未表現(xiàn)出顯著偏好性（圖1B）。這說明長期以替代寄主飼養(yǎng)的兩性生殖的松毛蟲赤眼蜂對替代寄主已產(chǎn)生依賴，結(jié)果支持“Hopkins寄主選擇原理”及化學遺贈假說。而孤雌產(chǎn)雌品系雌蜂未表現(xiàn)出對替代寄主的嗜好性，這可能與其體內(nèi)受Wolbachia感染有關。

一些研究發(fā)現(xiàn)，Wolbachia感染的赤眼蜂對寄主的評估和選擇能力下降，導致雌蜂無法通過判斷寄主卵的質(zhì)量，進而未表現(xiàn)寄生偏好。這種現(xiàn)象可由兩種假說解釋：（1）記憶剝奪假說（Memory retention hypothesis）。有研究發(fā)現(xiàn)Wolbachia削弱了宿主赤眼蜂的記憶能力，使得寄生蜂“遺忘”之前的學習經(jīng)驗，進而降低其對寄主質(zhì)量的判斷能力[16]。這可能與Wolbachia對宿主中樞神經(jīng)組織的侵染有關。病原學檢測發(fā)現(xiàn)，Wolbachia可侵染果蠅的腦組織[17,18]及麗蚜小蜂Encarsia formosa頭部[19]。在本研究中，Wolbachia誘導的赤眼蜂記憶機能衰退可能使雌蜂遺忘了幼期寄主信息，導致其未能表現(xiàn)出對柞蠶卵的嗜好性。（2）感知功能衰退。感知功能的衰退將使宿主雌蜂對寄主識別及評估能力下降[20]。有研究發(fā)現(xiàn)Wolbachia對擬澳洲赤眼蜂T. confusum嗅覺反應存在負面影響，而感染W(wǎng)olbachia的松毛蟲赤眼蜂雌蜂對米蛾卵提取物的嗅覺反應下降[21]。本研究揭示了長期以替代寄主飼養(yǎng)的兩性品系松毛蟲赤眼蜂對替代寄主表現(xiàn)出依賴性和嗜好性，對田間自然寄主的寄生功能存在衰退風險，而孤雌產(chǎn)雌赤眼蜂在寄主選擇偏好上存在天然的“缺陷”。

在兩性生殖的松毛蟲赤眼蜂中，利用亞洲玉米螟的不同提取物可顯著改善雌蜂對玉米螟卵的嗜好性。有學者用香草素刺激幼蟲期煙蚜繭蜂Aphidius ervi后，羽化后的成蜂會對香草素產(chǎn)生趨性[22,23]。另一項研究則發(fā)現(xiàn)，末齡幼蟲階段及羽化階段的經(jīng)歷對煙蚜繭蜂的棲息地選擇存在顯著影響[7]。一種姬小蜂Hyssopus pallidus幼期經(jīng)過蘋果提取液處理后，成蟲會表現(xiàn)出對相同氣味的趨性[22]。以黎豆夜蛾Anticarsia gemmatalis卵育出的短管赤眼蜂T. pretiosum在氣味選擇試驗中，總是偏好于選擇黎豆夜蛾[24]。柞蠶卵育出的松毛蟲赤眼蜂寄生玉米螟卵后，子代蜂對玉米螟卵的寄生偏好將得到改善，且隨飼養(yǎng)世代的增加，對玉米螟卵的偏好也逐漸增強。然而以少量蓖麻蠶卵Philosamia cynthia馴化羽化早期的赤眼蜂并不能增強寄生蜂對蓖麻蠶卵的嗜好性[6]。雖然以自然寄主飼養(yǎng)赤眼蜂能夠使子代蜂保持對自然寄主的嗜好性，但繁殖成本將成倍增加，因此通過利用自然寄主提取物處理替代寄主繁育的子代蜂更具可行性。我們認為通過人為施加對赤眼蜂子代的化學遺贈信號，使赤眼蜂在人工繁育條件下保持對寄主害蟲的聯(lián)想式經(jīng)驗，可改善雌蜂在野外對目標害蟲的靶向作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，以雌蛾腹部提取液處理的雌蜂對玉米螟卵塊的嗜好性最高。鱗翅目害蟲的腹部是其生殖和代謝中心，是性信息素的分泌部位，同時也是雌蛾的抱卵部位，因而對卵寄生蜂具有較強的吸引力。一些研究發(fā)現(xiàn)，赤眼蜂可憑借鱗翅目昆蟲的性信息素對寄主環(huán)境進行定向和搜尋[25,26]。有些寄生蜂甚至通過性信息素找到性成熟的雌蛾，通過搭乘雌蛾的“順風車”，找到其產(chǎn)卵場所[27]。因此，雌蛾腹部存在的各種信息素對赤眼蜂具有天然的吸引力，使其更易于在幼期及羽化前期建立起對寄主害蟲的聯(lián)想式條件反射。

本研究利用行為學原理，為改善規(guī)?；曫B(yǎng)的松毛蟲赤眼蜂對田間害蟲的靶向作用提供了新的思路，并提供了初步研究結(jié)果。未來仍有必要圍繞此方面開展更深入的研究，例如寄主害蟲粗提物的哪些有效成分有助于改善赤眼蜂對寄主害蟲的嗜好性？能否復合植物揮發(fā)物和寄主害蟲提取物，進一步增強赤眼蜂對寄主害蟲的搜尋效率？開展這些方面的研究，將有助于解決目前規(guī)?；庇嘌鄯湓谔镩g應用中的瓶頸。