胡 麗，陳 敏，殷高方，趙南京，甘婷婷

1.合肥師范學(xué)院物理與材料工程學(xué)院，安徽 合肥 230061 2.中國科學(xué)院安徽光學(xué)精密機(jī)械研究所中科院環(huán)境光學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031 3.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)研究生院科學(xué)島分院，安徽 合肥 230026

引 言

隨著現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，各種各樣除草劑被過量使用，大量殘存的除草劑進(jìn)入水環(huán)境中，給流域生態(tài)環(huán)境、水產(chǎn)養(yǎng)殖和飲水安全帶來巨大威脅[1]。區(qū)別理化分析方法，水質(zhì)生物毒性檢測方法利用生物在脅迫條件下的生理或行為等變化衡量污染物毒性，能綜合反映污染物對生態(tài)系統(tǒng)的危害程度，滿足生態(tài)環(huán)境風(fēng)險評估需求[2]。藻類作為單細(xì)胞生物，其個體小、繁殖快、對毒物敏感、易于培養(yǎng)，是水質(zhì)生物毒性檢測的理想受試生物[3]，國際經(jīng)合組織將“藻類生長抑制試驗(yàn)”列為化學(xué)品毒性測試標(biāo)準(zhǔn)方法，以96h作用下藻類細(xì)胞密度生長的半數(shù)抑制效應(yīng)濃度(EC50)來表征急性毒性作用的程度。然而，“藻類生長抑制試驗(yàn)”依賴于藻類細(xì)胞的繁殖代謝過程，毒性響應(yīng)慢，測量周期長[4]，已有研究表明細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞酶活性變化、遺傳物質(zhì)損傷等抑制細(xì)胞生長因素都會作用于光合作用過程[5]，其響應(yīng)速度和靈敏度明顯優(yōu)于“藻類生長抑制試驗(yàn)”[6]。近年來，人們開展了一些污染物毒性的藻類光合抑制實(shí)驗(yàn)，熒光測量多跟隨國外技術(shù)(如PAM[7])，獲得的光合熒光參數(shù)大多與可變熒光Fv或最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm有關(guān)。已有研究也多選用Fv或Fv/Fm表征藻類受脅迫程度[8]，如Mallick等[9]實(shí)驗(yàn)證明(F0/Fv)是評估重金屬毒性的最佳參數(shù)；Pérez等[10]研究認(rèn)為可變熒光(Fv)對Cu2+脅迫響應(yīng)最為快速敏感；Tiam等[11]研究表明快速光響應(yīng)曲線的反演參數(shù)Yield(光照狀態(tài)下PSⅡ的實(shí)際量子產(chǎn)量)對農(nóng)藥毒性更敏感，是較好的藻類生物毒性反應(yīng)終點(diǎn)。然而，隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)不同類型污染物對藻類細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)的光合作用位點(diǎn)和損傷程度具有明顯差異，與之對應(yīng)的敏感熒光參數(shù)差異較大[12]?，F(xiàn)有研究采用單一、固定的光合熒光參數(shù)作為生物毒性反應(yīng)終點(diǎn)，缺乏對多個光合熒光參數(shù)響應(yīng)敏感性的對比分析，造成生物毒性定量檢測的靈敏度不高。因此，針對特定污染物(如除草劑)，在準(zhǔn)確獲得多個光合熒光參數(shù)的基礎(chǔ)上，如何從眾多的光合熒光參數(shù)中篩選出能夠精確反映其抑制效應(yīng)的關(guān)鍵參數(shù)，成為當(dāng)前該領(lǐng)域急需解決的問題。

本研究以蛋白核小球藻為受試對象，以葉綠素?zé)晒庾鳛樵孱惞夂献饔脿顟B(tài)快速無損探針，采用熒光動力學(xué)手段測量藻類光合熒光參數(shù)，對典型除草劑敵草隆(dichlorophenyl dimethylurea，DCMU)抑制下的多個光合熒光參數(shù)的毒性響應(yīng)敏感性進(jìn)行對比分析，得到適用于快速、定量評價DCMU脅迫效應(yīng)的關(guān)鍵光合參數(shù)，提高DCMU生物毒性檢測的速度和靈敏度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藻種培養(yǎng)與溶液配制

實(shí)驗(yàn)選取的蛋白核小球藻選種及擴(kuò)大培養(yǎng)方法同參考文獻(xiàn)[8]，實(shí)驗(yàn)在100 mL三角錐形瓶中進(jìn)行，量取藻液50 mL，實(shí)驗(yàn)藻類初始葉綠素濃度控制在100～200 μg·L-1，DCMU脅迫物的添加體積為1 mL(排除藻液稀釋造成的干擾)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，DCMU抑制液濃度梯度設(shè)定為1，2，5，10，20，40，80和160 μg·L-1，每個樣品設(shè)置3個平行樣。

1.2 光合熒光參數(shù)及獲取

藻類光合熒光參數(shù)通過可變光脈沖誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒夥治鰞x(AGHJ-TPLIF-I，中國科學(xué)院安徽光學(xué)精密機(jī)械研究所研制)測量[13]。該儀器通過測量水體藻類葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線及光合響應(yīng)曲線(FLC曲線)，能夠在數(shù)十秒內(nèi)準(zhǔn)確反演獲得表征藻類光合作用過程特征的光合熒光參數(shù)，儀器主要功能結(jié)構(gòu)如圖1所示，得到的光合熒光參數(shù)如表1所示。

圖1 可變光脈沖誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒夥治鰞x結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of chlorophyll fluorescence analyzer induced by variable light pulse

表1 可變光脈沖誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒夥治鰞x測量得到的光合熒光參數(shù)Table 1 Photosynthetic fluorescence parameters acquired by the chlorophyll fluorescence analyzer

光合熒光參數(shù)對DCMU的響應(yīng)結(jié)果以抑制率和促進(jìn)率表征，分別用Y抑制和Y促進(jìn)表示，其計算公式見式(1)和式(2)[14]

(1)

(2)

式中，X0為對照組光合熒光參數(shù)數(shù)值；Xi為實(shí)驗(yàn)組光合熒光參數(shù)數(shù)值。

2 結(jié)果與討論

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取DCMU脅迫5 min后的對照組和實(shí)驗(yàn)組12個光合熒光參數(shù)，利用成對樣本T檢驗(yàn)得到實(shí)驗(yàn)組與對照組的顯著性差異，初步篩選有顯著性響應(yīng)的參數(shù)。結(jié)果表明，DCMU在蛋白核小球藻的多個光合作用位點(diǎn)都產(chǎn)生了抑制，10個光合熒光參數(shù)F0，F(xiàn)m，σPSⅡ，τQA，F(xiàn)v，F(xiàn)v/Fm，Yield，rP，NPQ，α存在顯著性差異；JVPⅡ和Ek在測量濃度范圍內(nèi)出現(xiàn)了中濃度區(qū)域顯著響應(yīng)，但低濃度和高濃度區(qū)域非顯著性響應(yīng)，不適宜作為生物毒性定量檢測的響應(yīng)指標(biāo)。因此，選取上述10個顯著響應(yīng)參數(shù)，進(jìn)一步研究DCMU毒性作用下的時間和劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.1 時間效應(yīng)關(guān)系

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)測試周期設(shè)置為5 min，1 h，3 h，6 h，24 h，48 h，72 h和96 h，得到10個顯著響應(yīng)參數(shù)在DCMU抑制下的時間-效應(yīng)變化規(guī)律。同時，為了比較光合抑制和生長抑制的差異，以藻類葉綠素含量(chlorophyll，Chl，可變光脈沖誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒夥治鰞x測量)代替藻類生物量，得到DCMU抑制下的藻類生物量隨時間的響應(yīng)規(guī)律。

結(jié)果表明，10個光合熒光參數(shù)可分為三類：第一類為表征藻類生長狀態(tài)的參數(shù)α，rP，F(xiàn)v/Fm，yield和NPQ，各參數(shù)的時間-效應(yīng)趨勢大致相同，如圖2所示。樣液的抑制率在測量周期內(nèi)呈現(xiàn)出先下降的趨勢，6 h后抑制率達(dá)到最低值；后呈現(xiàn)上升趨勢，48 h后基本趨于穩(wěn)定，且此時的抑制率值基本和5 min的測量值持平。6 h內(nèi)抑制率下降可能與受試藻類毒性脅迫自適應(yīng)有關(guān)，但藻類細(xì)胞自適應(yīng)能力達(dá)到極限后，毒性脅迫效應(yīng)將隨時間延長呈增加趨勢，直至穩(wěn)定，這與文獻(xiàn)[8]研究結(jié)果一致。因此，考慮到生物毒性快速測量需求，可以選擇5 min作為定量測量的時間節(jié)點(diǎn)，此時的測量數(shù)據(jù)可以代表長期(如96 h)抑制效果。

圖2 光合熒光參數(shù)α，rP，F(xiàn)v/Fm，yield和NPQ時間響應(yīng)變化趨勢Fig.2 The variation trend of α， rP， Fv/Fm， yield and NPQ with time

第二類為F0，F(xiàn)m和Fv，結(jié)果如圖3所示。在整個測量周期內(nèi)，低濃度樣液呈現(xiàn)出刺激生長效應(yīng)，在48 h后趨于穩(wěn)定；而中高濃度樣液呈現(xiàn)先促進(jìn)后抑制的效應(yīng)，6 h為時間拐點(diǎn)，之后抑制率隨時間呈累積增長效應(yīng)，在48 h后趨于穩(wěn)定，這種先促進(jìn)后抑制的趨勢類似第一類參數(shù)，與藻類毒性脅迫短期內(nèi)的自適應(yīng)效應(yīng)和脅迫極限有關(guān)。同時，對比上述參數(shù)和藻類生長抑制的時間響應(yīng)規(guī)律(即chl-a含量隨時間的變化趨勢)，發(fā)現(xiàn)其響應(yīng)規(guī)律類似，說明參數(shù)F0，F(xiàn)m和Fv除了與藻類的生長狀態(tài)有關(guān)外，還與藻類生物總量有關(guān)。因此，第二類參數(shù)同藻類生長抑制方法，適合選取較長時間為定量測量的時間節(jié)點(diǎn)(如48 h)，以獲得較為穩(wěn)定、精確的測試結(jié)果。

圖3 光合熒光參數(shù)F0，F(xiàn)m、Fv和Chl時間響應(yīng)變化趨勢Fig.3 The variation trend of F0， Fm， Fv and Chl with time

第三類為光合參數(shù)σPSⅡ和τQA，此類參數(shù)的抑制率值在整個測量周期內(nèi)都是負(fù)值，為研究方便，使用促進(jìn)率表征參數(shù)對DCMU的響應(yīng)規(guī)律，如圖4所示。樣液的促進(jìn)率在6 h內(nèi)呈現(xiàn)出下降的趨勢，6 h后隨時間延長累積變化較小，基本趨于穩(wěn)定。因此，可以選擇6 h作為第三類參數(shù)毒性測量的時間節(jié)點(diǎn)，確保此時的測量數(shù)據(jù)與長時間測量數(shù)據(jù)保持一致，避免短時測量出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。

圖4 光合熒光參數(shù)σPSⅡ和τQA時間響應(yīng)變化趨勢Fig.4 The variation trend of σPSⅡ and τQA with time

綜合三類參數(shù)的時間響應(yīng)規(guī)律，考慮到DCMU生物毒性快速測量的需求，選取5 min作為測量的時間節(jié)點(diǎn)，第一類參數(shù)Yield，rp，α，F(xiàn)v/Fm和NPQ作為定量測量的關(guān)鍵光合參數(shù)，進(jìn)一步研究其劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.2 劑量效應(yīng)關(guān)系

根據(jù)2.1節(jié)，進(jìn)一步分析關(guān)鍵參數(shù)Yield，rp，α，F(xiàn)v/Fm和NPQ在DCMU 5 min抑制時的劑量效應(yīng)關(guān)系，并與96 h長時抑制的劑量效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行對比，以確保短時測量結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性。通常生物毒性實(shí)驗(yàn)獲取的毒性強(qiáng)度與受試生物受抑制程度間的劑量-效應(yīng)曲線呈現(xiàn)反“S”形，一般以阻滯增長模型(Logistic)為基礎(chǔ)進(jìn)行非線性擬合[15]。以抑制物濃度代表其毒性強(qiáng)度，光合參數(shù)的抑制率代表受試生物受抑制程度，利用Logistic函數(shù)進(jìn)行擬合，得到對應(yīng)的擬合相關(guān)系數(shù)及EC50值。結(jié)果顯示，DCMU抑制5 min后，參數(shù)α，rP，F(xiàn)v/Fm，yield和NPQ抑制率對DCMU濃度具有良好的劑量效應(yīng)關(guān)系(如圖5)，擬合相關(guān)系數(shù)R2分別為0.996 9，0.997 3，0.998 5，0.998 5和0.998 5，由此得到的EC50-5 min值分別為10.31，11.59，13.03，13.94和2.41 μg·L-1，如表2所示。對比96 h長時抑制的劑量效應(yīng)關(guān)系，結(jié)果表明參數(shù)Yield，rp，α，F(xiàn)v/Fm的擬合相關(guān)系數(shù)短時效應(yīng)優(yōu)于長時效應(yīng)，但EC50值長時效應(yīng)優(yōu)于短時效應(yīng)。同時，實(shí)驗(yàn)還表明參數(shù)NPQ對DCMU毒性的響應(yīng)靈敏度和響應(yīng)速度極佳，其5 min抑制對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)和EC50優(yōu)于其他四個參數(shù)，且優(yōu)于96h的測量結(jié)果。因此，可以選取參數(shù)NPQ作為5min定量測量DCMU生物毒性的響應(yīng)指標(biāo)，既可大幅縮短檢測時間，還可以提高檢測的靈敏度。

表2 5 min和96 h抑制的擬合相關(guān)系數(shù)和EC50值Table 2 The fitting correlation coefficient and EC50 value of 5 min and 96 h inhibition

圖5 5 min脅迫下α，rP，F(xiàn)v/Fm，yield和NPQ值隨DCMU濃度的變化趨勢Fig.5 The trend of α， rP， Fv/Fm， yield and NPQ with DCMU concentration under 5 min stress

3 結(jié) 論

基于藻類光合熒光參數(shù)的生物毒性監(jiān)測方法，具有響應(yīng)快速、參數(shù)豐富、測量簡捷的特點(diǎn)。對DCMU抑制下的多個光合熒光參數(shù)毒性響應(yīng)敏感性進(jìn)行了對比分析，首先通過成對樣本T檢驗(yàn)，得到光合熒光參數(shù)F0，F(xiàn)m，σPSⅡ，τQA，F(xiàn)v，F(xiàn)v/Fm，Yield，rP，NPQ，α顯著響應(yīng)；通過分析顯著響應(yīng)參數(shù)的時間-效應(yīng)規(guī)律，得到參數(shù)α，rP，F(xiàn)v/Fm，yield和NPQ在5 min即體現(xiàn)出類似長時抑制效應(yīng)的關(guān)系，5 min可作為DCMU毒性分析的時間測量節(jié)點(diǎn)；最后，研究5 min脅迫下DCMU濃度與參數(shù)α，rP，F(xiàn)v/Fm，yield，NPQ抑制率之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系，利用Logistic函數(shù)進(jìn)行擬合，同時對比96 h長時抑制的劑量效應(yīng)關(guān)系，結(jié)果顯示參數(shù)NPQ的相關(guān)系數(shù)和EC50分別為0.998 5和2.41 μg·L-1，顯著優(yōu)于其他四個參數(shù)，且優(yōu)于96 h的測量結(jié)果。因此，采用光合熒光參數(shù)NPQ作為5 min定量測量DCMU生物毒性的反應(yīng)終點(diǎn)，可極大縮短DCMU生物毒性檢測的檢測時間(從數(shù)小時縮短至5 min)，并顯著提高檢測靈敏度(與光合抑制方法常規(guī)參數(shù)Fv/Fm相比，EC50降低了81.4%)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基于藻類光合抑制效應(yīng)的DCMU生物毒性定量檢測提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，研究方法也為其他污染物脅迫下的藻類光合熒光參數(shù)篩選提供了參考。