劉 倩 張 靜 韓福國(guó) 范雪梅 郝艷麗 史 云 劉清飛*

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院(咸陽(yáng)，712046)；2.清華大學(xué)藥學(xué)院；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院

在中醫(yī)理論體系中，宮頸HPV感染屬于“帶下病”,用藥方面通過(guò)內(nèi)服清熱利濕解毒類藥物直接清除病毒和提高免疫力達(dá)到治療目的或通過(guò)外用藥改善局部免疫環(huán)境而協(xié)助機(jī)體清除病毒[1]。康婦凝膠為中藥制劑，局部涂抹給藥，其由白芷、蛇床子、花椒、土木香、冰片5種中藥材組成，可抗病毒又可提高免疫[2],臨床已用康婦凝膠治療宮頸HPV感染[3]，但分子作用機(jī)制尚無(wú)深入研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從系統(tǒng)和網(wǎng)絡(luò)整體層面解釋藥物系統(tǒng)藥理機(jī)制的一門交叉學(xué)科，與中醫(yī)藥的“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)-多成分藥物”及整體性特點(diǎn)不謀而合[4-6]。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)探討康婦凝膠治療宮頸HPV感染的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件

TCMSP、Pubchem、SwissTargetPrediction、BATMAN-TCM等活性成分預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)；OMIM、GeneCards、DisGeNET等疾病靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)；Uniprot、RCSBPOB等靶點(diǎn)信息數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID、微生信、DEGG、String、Cytoscape 3.7.2、KNIME 4.3.1、Autodock vina、pymol、Chem 3D等結(jié)果分析軟件。

1.2 活性成分及靶點(diǎn)篩選

分別以白芷、蛇床子、花椒、冰片、土木香為關(guān)鍵詞在TCMSP中檢索其活性成分和相關(guān)靶點(diǎn)?？诜锢枚?OB)主要用于口服藥物，而康婦凝膠給藥方式為局部涂于外陰、陰道處，經(jīng)黏膜吸收而發(fā)揮藥效。藥物透過(guò)黏膜后能夠迅速入血，經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)全身或靶點(diǎn)，無(wú)需經(jīng)過(guò)肝臟，一定程度上能夠提高藥物生物利用度[7]，因此本文在TCMSP中以類藥性DL(Drug Likeness)≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)檢索活性成分及靶點(diǎn)，并在Pubchem得候選成分的SMILES字符串，導(dǎo)入SwissTargetPrediction平臺(tái)，設(shè)置屬性為”homo sapiens”，選取Probability≥0.85全部預(yù)測(cè)靶點(diǎn)或Probability≤0.85的前15個(gè)蛋白靶點(diǎn)作為該成分有效預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)按Score cutoff≥20且P-value<0.05檢索土木香的活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。結(jié)合Uniprot，校正得到中藥活性成分相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 宮頸HPV感染相關(guān)靶點(diǎn)篩選

通過(guò)OMIM、GeneCards、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Cervical HPV Infection”“Cervical Human Papillomavirus Infection”與“Cervical Human Papilloma Virus Infection”為檢索詞進(jìn)行檢索，對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行整合去冗余后獲得宮頸HPV感染相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 宮頸HPV感染的潛在作用靶點(diǎn)篩選

運(yùn)用微生信平臺(tái)繪制韋恩圖，取康婦凝膠活性成分作用靶點(diǎn)與宮頸HPV致病相關(guān)靶點(diǎn)的交集，作為康婦凝膠治療宮頸HPV感染的潛在作用靶點(diǎn)。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)與可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將1.4潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，以物種“Homo sapiens”、高可信度≥0.7作為篩選條件，得蛋白間相互作用關(guān)系，再運(yùn)用Cytoscape(3.7.2)進(jìn)行可視化，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中度值、介度、緊密度等進(jìn)行排序，篩選核心靶點(diǎn)。

1.6 GO生物過(guò)程與KEGG通路富集分析

將潛在作用靶點(diǎn)基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析其相關(guān)生物過(guò)程及作用通路，富集結(jié)果按P值由小到大(P<0.05)排序，GO分析選前10個(gè)結(jié)果，KEGG選前20個(gè)通路進(jìn)行分析和展示。運(yùn)用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋以及通路圖分析。

1.7 “藥物成分-作用靶點(diǎn)-作用通路”網(wǎng)絡(luò)圖

運(yùn)用KNIME軟件獲得前20條通路相關(guān)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分，得到活性成分-通路相關(guān)靶點(diǎn)-通路對(duì)應(yīng)關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape構(gòu)建“藥物成分-作用靶點(diǎn)-作用通路”網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)度值篩選主要活性成分。

1.8 分子對(duì)接

采用Autodock vina軟件對(duì)排名前5的核心靶點(diǎn)與1.7中對(duì)應(yīng)活性成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。從RCSB PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)得靶點(diǎn)蛋白三維結(jié)構(gòu)并保存為pdb格式，Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)出化合物三維結(jié)構(gòu)SDF格式，在chem3D中轉(zhuǎn)化成mol2格式。采用AutoDock Tools對(duì)上述蛋白受體進(jìn)行去水加氫、計(jì)算電荷后存為pdbqt格式。再運(yùn)用插件Autogrid得到活性口袋，進(jìn)行分子對(duì)接，最后用pymol可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 康婦凝膠活性成分篩選

TCMSP、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選得到來(lái)自白芷、蛇床子、冰片、花椒、土木香的活性成分?jǐn)?shù)量分別為45、29、5、8、4個(gè)，潛在作用靶點(diǎn)整合去重后得到512個(gè)。

2.2 宮頸HPV感染相關(guān)靶點(diǎn)基因篩選

從OMIM、GeneCard、DisGeNET疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)分別檢索得261、1913、429個(gè)宮頸HPV感染相關(guān)靶點(diǎn)，整合去重得2275個(gè)。

2.3 康婦凝膠治療宮頸HPV潛在作用靶點(diǎn)篩選

將活性成分作用靶點(diǎn)與宮頸HPV致病相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入微生信在線平臺(tái)得交集靶點(diǎn)，如圖1所示(2725頁(yè))，交集基因239個(gè)，占總基因數(shù)的9.4%，為康婦凝膠治療宮頸HPV感染的潛在作用靶點(diǎn)。

2.4 潛在作用靶點(diǎn)蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析

在String數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入239個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果用Cytoscape可視化，包含229個(gè)靶點(diǎn)、2315條邊。以度值≥2倍中位數(shù)即度值≥30篩得54個(gè)候選靶點(diǎn)，進(jìn)而以度值、介度、緊密度≥中位數(shù)篩選出22個(gè)核心靶點(diǎn)，見圖2(2725頁(yè))，其中顏色越深表明degree值越大。

2.5 交集靶點(diǎn)富集分析

2.5.1 GO分析通過(guò)DAVID進(jìn)行GO功能富集分析，得顯著性GO條目835個(gè)，其中生物過(guò)程(BP)條目643個(gè)，細(xì)胞組成(CC)條目72個(gè)，分子功能(MF)條目120個(gè)，分別占77.0%、8.6%、14.4%。圖3(2725頁(yè))為BP、CC及MF富集結(jié)果中顯著性最高的10條功能。BP方面主要參與對(duì)藥物的反應(yīng)性、凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化等；CC方面主要參與胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞外空間、核質(zhì)等；MF方面主要參與蛋白激酶活性、酶結(jié)合、蛋白結(jié)合等，表明康婦凝膠參與體內(nèi)多種生物學(xué)調(diào)控過(guò)程以發(fā)揮防治HPV感染的作用。

2.5.2 KEGG分析239個(gè)潛在作用靶點(diǎn)經(jīng)DAVID通路富集分析得126條顯著富集通路，運(yùn)用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路注釋分析，結(jié)果見圖4(2725頁(yè))。潛在作用靶點(diǎn)顯著富集的信號(hào)通路有PI3K-Akt、HIF-1、FoxO、TNF、ErbB等信號(hào)通路。根據(jù)現(xiàn)有與宮頸HPV感染相關(guān)的作用機(jī)制研究[8-12]，在富集得126條通路中選擇與宮頸HPV感染最為相關(guān)的5條信號(hào)通路進(jìn)行整合，構(gòu)建了康婦凝膠治療宮頸HPV感染的信號(hào)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，見圖5(2726頁(yè))。

2.6 “藥物成分-作用靶點(diǎn)-作用通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

KNIME得20條通路136個(gè)相關(guān)基因?qū)?yīng)80個(gè)活性成分，導(dǎo)入Cytoscape中構(gòu)建“藥物成分-作用靶點(diǎn)-作用通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6(2726頁(yè))。該網(wǎng)絡(luò)涉及236個(gè)節(jié)點(diǎn)和1197條邊，平均度值為6.09，大于平均度值的活性成分共有20個(gè)(表1)，提示這20種成分可能為康婦凝膠治療宮頸HPV感染的主要活性成分。其中槲皮素、(E)-2,3-二(7-甲氧基-2-氧代-8-色烯基)丙-2-烯醛、黃木亭、β-谷甾醇和二氫歐山芹醇醋酸酯為度值最高的5個(gè)活性成分。

表1 康婦凝膠20個(gè)核心成分相關(guān)參數(shù)

2.7 分子對(duì)接

為了驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，將排名前5的核心靶點(diǎn)(TP53、AKT1、STAT3、HSP90AA1、EGFR)與其對(duì)應(yīng)主要活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，部分結(jié)果見表2，部分可視化結(jié)果見圖7(2726頁(yè))。靶點(diǎn)與活性成分的結(jié)合能越小越好，結(jié)合能<-5kJ/mol，表明二者具有較好的結(jié)合活性，<-7kJ/mol表明二者的結(jié)合構(gòu)型有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。核心靶點(diǎn)均與對(duì)應(yīng)活性成分大多形成氫鍵且均有較好的結(jié)合活性。其中，槲皮素與TP53以及EGFR結(jié)合作用最強(qiáng)，均為-8.0kJ/mol，HSP90AA1與多數(shù)活性成分均有較好對(duì)接作用。不同靶點(diǎn)作用相同化學(xué)成分，不同化學(xué)成分又可作用相同靶點(diǎn)，充分提現(xiàn)了康婦凝膠能夠多成分-多靶點(diǎn)治療宮頸HPV感染。

表2 核心靶點(diǎn)與部分對(duì)應(yīng)活性成分對(duì)接結(jié)合能及氫鍵數(shù)

3 討論

HPV感染較為廣泛，女性一生有70%～80%可能性感染HPV[13]。本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)了康婦凝膠治療宮頸HPV感染的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子作用機(jī)制。數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得91個(gè)活性成分以及239個(gè)作用靶點(diǎn)，再通過(guò)網(wǎng)絡(luò)圖及分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)證實(shí)槲皮素、β-谷甾醇等化學(xué)成分可能為治療宮頸HPV感染的化學(xué)成分。槲皮素是花椒中一種黃酮類化合物，已研究出其抗炎，抗癌等作用[14]。在單層細(xì)胞培養(yǎng)中槲皮素可抑制多種病毒對(duì)細(xì)胞的感染，可通過(guò)拮抗宿主細(xì)胞的Ca2+通道阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞而達(dá)到抗病毒作用，還可抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制[15]。另一方面也可以通過(guò)刺激細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)以及免疫應(yīng)答[16]。β-谷甾醇是白芷、花椒、蛇床子的共有成分，可通過(guò)促進(jìn)IFN mRNA表達(dá)并促進(jìn)其下游相關(guān)抗病毒基因表達(dá)發(fā)揮抗病毒作用[17]。

通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)篩選得TP53、AKT1、STAT3、HSP90AA1和EGFR可能為康婦凝膠治療宮頸HPV感染的核心靶點(diǎn)。p53是一種腫瘤抑制基因，高危HPV E6蛋白可直接作用于p53核心位點(diǎn)，導(dǎo)致其介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡功能喪失[18]，而低危HPV由于E6蛋白只分布于細(xì)胞核內(nèi)，將p53隔于細(xì)胞質(zhì)中，不能靶向降解p53。這也使高低危HPV在降解p53時(shí)有差異性[19]。高危HPV E6可通過(guò)IL-6異常升高激活STAT3轉(zhuǎn)錄因子而使細(xì)胞癌變[20]。HSP90蛋白可作為分子伴侶與癌癥基因DNA結(jié)合，激活其抗腫瘤作用，有研究已驗(yàn)證HPV16 E7與HPS90融合制成的DNA疫苗可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡也可直接殺傷癌細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用[21]。宮頸癌病變部位的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)高表達(dá)且表達(dá)水平與HPV感染復(fù)發(fā)有密切關(guān)系[22]。有研究表明EGFR抑制劑TK1可抑制EGFR和AKT磷酸化作用以及阻斷JAK/STAT通路進(jìn)而抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增值[23]。

GO結(jié)果顯示這些靶點(diǎn)基因可通過(guò)參與對(duì)藥物的反應(yīng)性、凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化等生物過(guò)程；影響胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞外空間、核質(zhì)等細(xì)胞部分；調(diào)控蛋白激酶活性、酶結(jié)合、蛋白結(jié)合等分子生物功能協(xié)同發(fā)揮抗宮頸HPV感染的作用。KEGG富集分析結(jié)果表明康婦凝膠治療宮頸HPV感染涉及PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路及ErbB信號(hào)通路等相關(guān)通路，展現(xiàn)出康婦凝膠治療宮頸HPV感染“多靶點(diǎn)、多通路”的特點(diǎn)。其中最為主要的通路為P13K/Akt信號(hào)通路，AKT1既是通路中的關(guān)鍵分子也是康婦凝膠潛在作用靶點(diǎn)。有研究表明，HPV16感染與PI3K、AKT1、NF-κB表達(dá)成正相關(guān)，持續(xù)感染可以導(dǎo)致PI3K-AKT信號(hào)通路被激活，進(jìn)一步導(dǎo)致宮頸病變[8]。真核細(xì)胞自噬功能可降解自身受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)病原體，因此在防御病毒感染方面起重要作用。HPV 16感染角質(zhì)細(xì)胞后E6/E7蛋白同時(shí)表達(dá)可通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR通路而抑制自噬功能[24]。但也有研究表明，HPV11 E6蛋白過(guò)表達(dá)也可抑制AKT/mTOR和Rrk/mTOR通路而激活自噬[25]。有研究將HPV11 E6和HPV18 E6基因克隆于HaCaT細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HPV11 E6和HPV18 E6蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路以及其他DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞存活、增值等通路啟動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。雖HPV11和HPV18的E6蛋白有相似的影響，但高危HPV18E6的水平明顯要高很多[26]。

綜上可述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)揭示了康婦凝膠治療宮頸HPV感染的活性成分、作用靶點(diǎn)以及分子作用機(jī)制，體現(xiàn)其多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用的特點(diǎn)。隨著對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所涉及的數(shù)據(jù)庫(kù)、方法、應(yīng)用不斷完善，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在揭示中藥物質(zhì)基礎(chǔ)與分子作用機(jī)制方面的優(yōu)勢(shì)必將更加明顯[27-28]，特別是針對(duì)當(dāng)前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究尚存在數(shù)據(jù)缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、科學(xué)驗(yàn)證不足等問(wèn)題，2021年，首個(gè)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)正式制訂并發(fā)布[29]，必將進(jìn)一步促進(jìn)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的專業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化以及廣泛應(yīng)用。