王 臻，朱 婧，薛 彤，白 寧

(陜西省人民醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710068)

谷氨酸(glutamate，Glu)是哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中含量非常豐富的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，通過突觸間隙的相應(yīng)受體，在神經(jīng)元分化、生長、遷移等過程中發(fā)揮重要作用[1]。然而，Glu過度釋放或堆積會(huì)引起神經(jīng)元損傷，表現(xiàn)為興奮性神經(jīng)毒性，最終誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞的重要細(xì)胞器，主要負(fù)責(zé)蛋白的合成、分泌及降解；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能異常會(huì)引發(fā)錯(cuò)誤蛋白超載，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[3]?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)是Glu致神經(jīng)元損傷的另一主要機(jī)制[4]，能通過介導(dǎo)ERS廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變過程[5]。

淫羊藿苷(icariin，ICA)是小檗科植物淫羊藿的主要活性成分。有研究顯示，ICA通過調(diào)節(jié)顆粒蛋白前體的表達(dá)減輕低濃度Glu誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷[6]，然而ERS信號通路是否同樣參與上述過程尚不清楚。因此，本研究篩選合理的ICA濃度，探討ICA預(yù)處理對Glu介導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及調(diào)控機(jī)制，旨在為ICA治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供新的理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞和主要試劑：小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞系于我院中心實(shí)驗(yàn)室保種,CCK-8試劑盒(七海復(fù)泰生物科技有限公司，上海),JC-1和ROS檢測試劑盒(翊圣生物技術(shù)研究所，上海),TUNEL凋亡試劑盒(Roche公司，德國),DAPI(Sigma-Aldrich公司，美國),乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(建成生物工程研究所，南京),DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司，美國),青—鏈霉素雙抗混合液(100×)和DMSO(索萊寶科技有限公司,北京),p-eIF2α、eIF2α、GRP78和CHOP抗體(Cell Signaling Technology公司，美國),Bcl2、Bax、β-actin抗體及CHOPsiRNA(SantaCruz公司，美國),辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京)。

儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國),酶標(biāo)儀(MolecularDevices，美國),高速低溫離心機(jī)(艾本德公司，德國),激光共聚焦顯微鏡(奧林巴斯公司，日本),Western blot蛋白分離及成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2的飽和濕環(huán)境中常規(guī)培養(yǎng)HT22細(xì)胞，添加青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 mg/mL)。每2 d換液1次，待細(xì)胞生長達(dá)90%左右時(shí)以0.25%胰酶消化傳代，傳代比例為1∶2。取對數(shù)生長期的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象。

1.2.2 藥物處理和實(shí)驗(yàn)分組 ICA以DMSO助溶配成母液，于4 ℃保存，用時(shí)以無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋(DMSO<0.1%)。首先，檢測不同濃度ICA(0.1～100 μmol/L)處理24 h后對HT22細(xì)胞的毒性作用，最終選擇濃度5 μmol/L和10 μmol/L用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。隨后，將細(xì)胞分為對照組、Glu損傷組、低劑量ICA+Glu(L-ICA+Glu)組和高劑量ICA+Glu(H-ICA+Glu)組。根據(jù)毒性試驗(yàn)結(jié)果分別給予L-ICA+Glu組和H-ICA+Glu組低濃度(5 μmol/L)和高濃度(10 μmol/L)ICA預(yù)處理24 h后[7-8]，加入Glu(5 mmol/L)繼續(xù)孵育18 h[9]；Glu損傷組單純用Glu處理18 h；對照組則以等體積的無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋液(DMSO<0.1%)孵育18 h。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活性 將HT22細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種于96孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。按照1.2.2方法處理后，棄培養(yǎng)基，PBS緩慢沖洗。每孔加入100 μL無血清的DMEM和10 μL的CCK-8試劑混合液，37 ℃孵育2 h后，于450 nm波長處測定吸光度(opticaldensity，OD)。以對照組結(jié)果為100%。

1.2.4 比色法檢測細(xì)胞LDH釋放量 將HT22細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6孔板，按1.2.2方法處理后，收集上清培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)移至96孔板內(nèi)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。每孔加入50 μL反應(yīng)底物，37 ℃孵育30 min，加入等量終止液。室溫放置3 min，于440 nm波長處測定吸光值。對照組的值設(shè)為1。

1.2.5 TUNEL染色顯示凋亡細(xì)胞 將HT22細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種于24孔板內(nèi)制作細(xì)胞爬片，并按1.2.2方法處理后，4%多聚甲醛室溫固定10 min，并以Triton X-100溶液(0.1%)于室溫孵育10 min。嚴(yán)格按照試劑盒步驟對細(xì)胞進(jìn)行TUNEL染色[5]，并用DAPI溶液(1 μg/mL)室溫、避光復(fù)染細(xì)胞核10 min。甘油封片后，激光共聚焦顯微鏡下計(jì)算隨機(jī)10個(gè)視野中的細(xì)胞凋亡率，凋亡率=綠色細(xì)胞數(shù)/藍(lán)色細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 JC-1染色檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)變化 調(diào)整HT22細(xì)胞密度為3×105個(gè)/孔，接種至24孔板中，并制作細(xì)胞爬片。按1.2.2方法處理后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌、備用。按照每50 μL的JC-1(200×)加入8 mL超純水的比例稀釋JC-1原液，劇烈振蕩；然后再加入2 mL的JC-1染色緩沖液(5×)，混勻后即為JC-1染色工作液。向各孔中加入400 μL JC-1染色工作液和等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃避光孵育20 min。激光共聚焦顯微鏡下觀察染色結(jié)果，并用Image J分析結(jié)果。

1.2.7 DCFH-DA檢測細(xì)胞ROS含量 用無血清DMEM培養(yǎng)液將DCFH-DA稀釋成10 μmol/L的工作液。將HT22細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種于24孔板內(nèi)制作細(xì)胞爬片，按1.2.2方法處理后，取一定量的上述工作液覆蓋于處理后的細(xì)胞爬片，37 ℃避光孵育20 min，并以無血清DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次。于488 nm激發(fā)波長和525 nm發(fā)射波長處測定熒光強(qiáng)度，單純DCFH-DA溶液用做調(diào)零，Image J分析結(jié)果，對照組的值設(shè)為1。

1.2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HT22細(xì)胞以0.5×106個(gè)/孔接種于6孔板，根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道[10]，嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染說明書，對細(xì)胞進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染48 h后，Western blot檢測目的蛋白的表達(dá)情況。隨后分為Glu+ControlsiRNA組、Glu+CHOPsiRNA組、H-ICA+Glu+ControlsiRNA組、H-ICA+Glu+CHOPsiRNA組，經(jīng)ICA(10 μmol/L)和Glu處理后，再次檢測細(xì)胞活性、凋亡率、ROS含量、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)以及MMP水平。

1.2.9 Western blot檢測關(guān)鍵蛋白的表達(dá) 制備處理后的細(xì)胞裂解液，分別提取總蛋白。定量后，高溫變性，取20 μg蛋白液行SDS-PAGE(8%)電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，加入含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，室溫封閉2 h，分別加入一定濃度的一抗(p-eIF2α、eIF2α、GRP78和CHOP為1∶1 000，Bcl2、Bax和β-actin為1∶500)，于4 ℃孵育過夜。加入相應(yīng)的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光法顯影，并用軟件Image Lab 5.1分析蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ICA對Glu誘導(dǎo)HT22細(xì)胞損傷后細(xì)胞活性的影響

過量的Glu具有明顯的神經(jīng)毒性，以濃度為5 mmol/L的Glu作用18 h后能夠顯著抑制HT22細(xì)胞增殖，見圖1。光鏡下發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，Glu損傷組細(xì)胞表現(xiàn)為皺縮、變圓、折光性增強(qiáng)，并可見大量懸浮體；ICA預(yù)處理24 h有效緩解上述情況。CCK-8結(jié)果進(jìn)一步提示，Glu損傷組細(xì)胞活性明顯較低，ICA干預(yù)明顯提高損傷后各組細(xì)胞活性，并呈劑量依賴性(P<0.05)。提示ICA可以減輕Glu對HT22細(xì)胞的抑制。

*:與對照組比較，P<0.05；#：與Glu損傷組比較，P<0.05；△：與L-ICA+Glu組比較，P<0.05

2.2 ICA對Glu誘導(dǎo)HT22細(xì)胞損傷后LDH釋放和凋亡的影響

Glu損傷組中LDH的釋放量明顯增加(P>0.05)，ICA可降低LDH的釋放量，以H-ICA+Glu組最明顯(P<0.05)，見圖2a。TUNEL染色提示，Glu(5 mmol/L)處理18 h后HT22細(xì)胞中綠色熒光所占的比例增加(P<0.05)，而ICA(5、10 μmol/L)均能有效降低細(xì)胞凋亡率，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見圖2b。說明ICA能顯著抑制Glu誘導(dǎo)HT22細(xì)胞分泌LDH以及凋亡。

a:LDH釋放量;b:細(xì)胞凋亡率(綠色表示凋亡細(xì)胞，藍(lán)色表示細(xì)胞核) *：與對照組比較，P<0.05；#：與Glu損傷組比較，P<0.05；△：與L-ICA+Glu組比較，P<0.05

2.3 ICA對Glu誘導(dǎo)HT22細(xì)胞損傷后MMP變化和ROS含量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞以紅色熒光為主；Glu損傷組紅色熒光減弱，綠色熒光增強(qiáng)，提示MMP明顯降低(P<0.05)；L-ICA+Glu組和H-ICA+Glu組綠色熒光受到抑制，紅色熒光增加(P<0.05)，見圖3a。Glu提高HT22細(xì)胞中ROS的表達(dá)量，表現(xiàn)為綠色熒光增加(P<0.05)，ICA預(yù)處理則顯著降低其表達(dá)量(P<0.05)，見圖3b。以上結(jié)果提示，ICA對Glu誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用。

a:MMP水平(紅色表示高M(jìn)MP，綠色表示低MMP);b:DCF熒光強(qiáng)度(綠色表示ROS陽性) *:與對照組比較，P<0.05；#：與Glu損傷組比較，P<0.05；△：與L-ICA+Glu組比較，P<0.05

2.4 ICA對Glu誘導(dǎo)HT22細(xì)胞損傷后ERS及凋亡信號通路的影響

相對于對照組，Glu損傷組p-eIF2α、GRP78和CHOP表達(dá)量增加；同時(shí)抗凋亡蛋白Bcl2下調(diào)，促凋亡蛋白Bax上調(diào)(P<0.05)；不同濃度(5 μmol/L和10 μmol/L)的ICA能顯著抑制ERS的激活，表現(xiàn)為下調(diào)p-eIF2α、GRP78和CHOP的表達(dá)，Bcl2表達(dá)增加，Bax表達(dá)降低，Bcl2/Bax比值升高(P<0.05)，見圖4。提示ICA可有效抑制Glu誘導(dǎo)HT22細(xì)胞中ERS及凋亡相關(guān)蛋白的活性。

*:與對照組比較，P<0.05；#：與Glu損傷組比較，P<0.05；△：與L-ICA+Glu組比較，P<0.05

2.5 抑制CHOP對ICA保護(hù)HT22細(xì)胞抗Glu損傷的影響

與Control siRNA組比較，CHOP siRNA組CHOP蛋白表達(dá)明顯受到抑制(P<0.05)，見圖5a。同時(shí)，與Glu+ControlsiRNA組比較，H-ICA+Glu+ControlsiRNA組細(xì)胞活性更高(P<0.05)，細(xì)胞TUNEL陽性率更低(P<0.05)，細(xì)胞MMP水平更穩(wěn)定(P<0.05)，細(xì)胞ROS活性更弱(P<0.05)，見圖5b～e。同時(shí)，降低CHOP表達(dá)能夠有效增強(qiáng)ICA對Glu損傷HT22細(xì)胞后的保護(hù)作用，表現(xiàn)在相對于H-ICA+Glu+ControlsiRNA組，H-ICA+Glu+CHOPsiRNA組細(xì)胞活性和MMP水平升高(P<0.05)，凋亡率和ROS活性降低(P<0.05)，見圖5b～e。此外，Western blot結(jié)果顯示，聯(lián)合應(yīng)用ICA和CHOP siRNA可以進(jìn)一步下調(diào)ERS相關(guān)蛋白(p-eIF2α、GRP78和CHOP)及Bax的表達(dá)，上調(diào)Bcl2的表達(dá)(P<0.05)，見圖5f。表明抑制ERS通路可以明顯敏化ICA對Glu誘導(dǎo)HT22損傷的保護(hù)作用。

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)疾病是危害人類健康的常見病和多發(fā)病，不僅致死率高，而且其后遺癥給患者家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[11]。神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的基本組成單位，機(jī)體內(nèi)外的多種損傷因素均可以引起神經(jīng)元功能紊亂。Glu是重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，高濃度Glu能夠激活突觸后膜的相應(yīng)受體，通過改變細(xì)胞內(nèi)離子濃度(如Ga2+)或者氧化應(yīng)激水平，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[12]。HT22細(xì)胞是永生化的小鼠海馬神經(jīng)元，因缺乏離子型Glu受體[13]，而常用于研究Glu的氧化應(yīng)激損傷[14]。有研究表明，Glu通過競爭性抑制半胱氨酸攝取，導(dǎo)致細(xì)胞谷胱甘肽耗竭和ROS累積而誘導(dǎo)凋亡[15]。因此，有效地逆轉(zhuǎn)上述過程是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵，探索新的神經(jīng)保護(hù)方法以及潛在的調(diào)控機(jī)制，成為目前該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

a:CHOP蛋白表達(dá);b:細(xì)胞活性;c:凋亡率;d:MMP水平；e:DCF熒光強(qiáng)度；f:ERS(p-eIF2α、GRP78和CHOP)及凋亡相關(guān)蛋白(Bcl2和Bax)表達(dá)情況 *：與Control siRNA組比較，P<0.05；#：與Glu+ControlsiRNA比較，P<0.05；△：與Glu+CHOPsiRNA組比較，P<0.05；▲：與H-ICA+Glu+ControlsiRNA組比較，P<0.05

ICA是小檗科植物淫羊藿的主要活性成分，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有益精氣、堅(jiān)筋骨、補(bǔ)腰膝、強(qiáng)心力的功效[16]。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，ICA是含有8-異戊烯基的黃酮醇苷類化合物，具有更廣泛的藥理學(xué)作用，包括抗癌、增強(qiáng)免疫、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及改善心腦血管功能等[17-18]。近年來，ICA對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用受到廣泛的關(guān)注。Li等[19]的研究證實(shí)，ICA調(diào)節(jié)乙酰-α-微管蛋白和磷酸化的微管蛋白結(jié)合蛋白Tau，修復(fù)受損的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)骨架并恢復(fù)磷酸化蛋白激酶B，介導(dǎo)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元抗高半胱氨酸的毒性反應(yīng)。重要的是，ICA通過突觸間隙的Glu受體在大鼠抑郁癥模型中發(fā)揮保護(hù)作用[20]。因此，ICA具有多種神經(jīng)保護(hù)作用；然而，其對Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷的調(diào)控機(jī)制未見報(bào)道。因此，本研究以Glu預(yù)處理HT22細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡模型，探討ICA對其拮抗作用。結(jié)果顯示，Glu(5 mmol/L)處理18 h可引起HT22細(xì)胞活性降低以及凋亡和LDH分泌增加，與以往研究一致[21-22]。不同濃度(5 μmol/L和10 μmol/L)的ICA顯著增加細(xì)胞活性并降低凋亡率和LDH釋放量，說明ICA具有抗Glu誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡作用。

線粒體是細(xì)胞進(jìn)行氧化磷酸化、合成三磷酸腺苷的主要場所，在細(xì)胞能量代謝中扮演重要角色[23]。線粒體功能損傷后可使呼吸鏈障礙、膜電位去極化、三磷酸腺苷合成減少等，干擾正常的細(xì)胞代謝[23]。線粒體既是ROS產(chǎn)生的主要場所，也是ROS攻擊的靶器官，因而在其損傷后會(huì)產(chǎn)生放大效應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[23]。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體MMP的理想熒光探針。正常情況下，JC-1聚集在線粒體內(nèi)，可以產(chǎn)生紅色熒光；線粒體損傷后，JC-1外漏并以單體形式存在，發(fā)出綠色熒光。目前常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例[24]。本研究熒光檢測顯示，Glu明顯誘導(dǎo)MMP降低，同時(shí)引起細(xì)胞內(nèi)ROS堆積，ICA預(yù)處理能有效逆轉(zhuǎn)上述變化，說明ICA具有清除過度ROS的功能[25]，進(jìn)而提高線粒體膜的穩(wěn)定性，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。

PERK-eIF2α-CHOP是ERS重要的調(diào)控通路[26]。靜息狀態(tài)下，PERK與GRP78相互結(jié)合處于穩(wěn)態(tài)；當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的錯(cuò)誤蛋白增多，PERK解離并激活，磷酸化下游分子eIF2α，并上調(diào)CHOP分子入核誘導(dǎo)凋亡[27]。已有研究證實(shí)，CHOP可以通過抑制抗凋亡蛋白(如Bcl2)和活化多種促凋亡蛋白(如Bax、Bak)發(fā)揮作用[28-29]。此外，ROS介導(dǎo)的ERS是Glu損傷神經(jīng)元的重要分子病理基礎(chǔ)[15]，可能與凋亡相關(guān)蛋白促進(jìn)MMP去極化有關(guān)[30]。本研究顯示，經(jīng)ICA處理后，HT22細(xì)胞中p-eIF2α、GRP78和CHOP的表達(dá)明顯降低，而Bcl2/Bax比值增加。以上結(jié)果說明，ICA能有效阻斷HT22細(xì)胞中Glu誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)及ERS，進(jìn)一步穩(wěn)定線粒體功能，從而抑制凋亡發(fā)生。更重要的是，本研究應(yīng)用siRNA特異性抑制效應(yīng)分子CHOP后，ICA的作用明顯增強(qiáng)，提示ICA部分通過下調(diào)PERK-eIF2α-CHOP介導(dǎo)HT22細(xì)胞抗Glu誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)性凋亡。

綜上，ICA可以保護(hù)神經(jīng)元，其作用機(jī)制一定程度上與抑制細(xì)胞ROS堆積，進(jìn)而抑制ERS信號通路激活，最終穩(wěn)定MMP水平并恢復(fù)其功能，以減輕細(xì)胞凋亡有關(guān)(圖6)；然而，其具體作用機(jī)制仍需深入研究。

圖6 ICA通過抑制ERS通路保護(hù)HT22細(xì)胞抗Glu損傷的機(jī)制圖