張 冰, 邱 礽, 闞云超

(南陽(yáng)師范學(xué)院, 河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆蟲生物反應(yīng)器河南省工程實(shí)驗(yàn)室,中英南陽(yáng)洛桑昆蟲生物學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 河南南陽(yáng) 473061)

作為遺傳物質(zhì)的載體，大部分的DNA分子在細(xì)胞內(nèi)與組蛋白一起組裝為核小體，核小體高度螺旋纏繞為20 nm染色質(zhì)絲，染色質(zhì)絲再凝聚為光鏡下肉眼可見的染色體。在細(xì)胞生命周期中，遺傳物質(zhì)就在染色體上隨著其凝聚、分離和解凝聚而穩(wěn)定傳遞。伴隨著染色體狀態(tài)變化的是組蛋白分子上存在的一系列修飾，這些修飾對(duì)于染色體的凝縮、姐妹染色單體之間的黏連以及異染色質(zhì)的形成都非常重要(Hendzeletal., 1997; Weietal., 1999; Kaszas and Cande, 2000; Fischleetal., 2005; Hirotaetal., 2005)。

真核生物的組蛋白分子包括核心組蛋白H2A, H2B, H3和H4以及連接組蛋白H1，目前關(guān)于組蛋白修飾的研究多集中在組蛋白H3上。組蛋白H3在不同物種中都比較保守，同時(shí)，一些位點(diǎn)的表觀修飾也相當(dāng)保守。例如與轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的H3K4甲基化修飾(Vallianatos and Iwase, 2015)，與異染色質(zhì)沉默相關(guān)的H3K9和H3K27的甲基化修飾(Black and Whetstine, 2011)，以及與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)的組蛋白磷酸化修飾如H3Ser10ph, H3T3ph和H3T11ph等。雖然這些修飾在很多物種中都比較保守，但是功能卻不盡相同。例如，在四膜蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中組蛋白H3Ser10磷酸化(H3Ser10ph)伴隨著染色質(zhì)的濃縮，當(dāng)?shù)?0位的絲氨酸突變?yōu)楦拾彼釙r(shí)，染色質(zhì)的濃縮發(fā)生異常(Hendzeletal., 1997; Van Hooseretal., 1998)。然而玉米中H3Ser10ph則是與染色體之間的黏連相關(guān)(Kaszas and Cande, 2000)。 具有彌散型著絲粒的昆蟲細(xì)胞中H3Ser10ph和染色質(zhì)的凝縮有關(guān)(王姣玲等, 2017)，H3T3ph則與胞質(zhì)分裂相關(guān)(張冰等, 2018)，說(shuō)明同樣的修飾在不同物種中可能發(fā)生了功能分化。

減數(shù)分裂是生殖細(xì)胞形成單倍性配子的分裂方式。生殖細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂時(shí)，遺傳物質(zhì)只復(fù)制一次，細(xì)胞連續(xù)分裂兩次，最終形成染色體數(shù)目減半的配子。減數(shù)分裂周期可以分為間期和分裂期，間期包括G1, S和G2期。分裂期則由減數(shù)第一次分裂(meiosis I)和減數(shù)第二次分裂(meiosis II)組成。減數(shù)第一次分裂分為前期I、中期I、后期I和末期I。其中前期I持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，根據(jù)這個(gè)時(shí)期染色體的形態(tài)變化又將其分為細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期和終變期5個(gè)階段(Hillersetal., 2017)。第二次減數(shù)分裂與有絲分裂非常相似，包括前期II、中期II、后期II、末期II和胞質(zhì)分裂II等幾個(gè)過(guò)程。最終形成染色體數(shù)目減半的4個(gè)配子。鱗翅目昆蟲精子發(fā)育過(guò)程中分化產(chǎn)生兩種類型的精子：有核精子和無(wú)核精子。有核精子直接與卵細(xì)胞結(jié)合形成受精卵，無(wú)核精子則輔助有核精子與卵細(xì)胞的結(jié)合。已有的研究表明產(chǎn)生無(wú)核精子與有核精子的減數(shù)分裂事件存在顯著差異，無(wú)核精子精母細(xì)胞延遲進(jìn)入前期I并且在后期產(chǎn)生大量錯(cuò)分離的染色體，有核精子精母細(xì)胞則進(jìn)行正常的減數(shù)分裂過(guò)程 (Friedl?nderetal., 2005)。已知H3Ser10ph在昆蟲有絲分裂中參與染色質(zhì)的凝縮，但是它在家蠶Bombyxmori有核精子和無(wú)核精子精母細(xì)胞減數(shù)分裂中的生物學(xué)作用尚不明確。本研究使用特異性抗組蛋白H3Ser10磷酸化的抗體，以4齡幼蟲至蛹期家蠶為實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)對(duì)家蠶精母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中組蛋白H3 Ser10磷酸化在細(xì)胞周期中的動(dòng)態(tài)分布進(jìn)行研究，為探究家蠶有核精子和無(wú)核精子精母細(xì)胞減數(shù)分裂提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx及飼養(yǎng)

供試家蠶為大造P50品種,采用新鮮桑葉飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度25±3℃，相對(duì)濕度60%±10%，光周期12L∶12D。解剖4齡幼蟲至蛹期家蠶個(gè)體，收集不同時(shí)期的精巢組織暫存于1×PBS緩沖液中。

1.2 供試抗體

H3Ser10ph抗體RB7279(P-Ab)由上海吉爾生化有限公司制備(王姣玲等, 2017)；抗組蛋白H3抗體ab1791購(gòu)自Abcam公司;Tubulin抗體(Anti-Alpha Tubulin Mouse Monoclonal, 66031-1-Ig)購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 精巢組織蛋白提取和Western blot檢測(cè)H3Ser10ph在精巢中的定位

收集1.1節(jié)50頭雄蠶個(gè)體的精巢組織，利用蛋白提取試劑盒(KGP150, KeyGEN BioTECH)進(jìn)行核蛋白和胞漿蛋白提取。對(duì)提取所得蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入H3Ser10ph抗體或抗組蛋白H3內(nèi)參抗體(1∶500稀釋, v/v)4℃孵育過(guò)夜。二抗使用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋, v/v)，室溫振蕩孵育1 h，以ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(NCI4106, SHHY)顯色之后凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.4 免疫熒光標(biāo)記分析H3Ser10ph在精母細(xì)胞減數(shù)分裂染色體上的定位

將3個(gè)不同時(shí)期的精巢組織放入同一張加有10 μL 1×PBS的多聚賴氨酸載玻片上，用鑷子壓碎，將碎片夾走，再補(bǔ)充2～3 μL 1×PBS溶液，加5 μL活化的聚丙烯酰胺溶液：100 μL 15% PAGE, 5 μL 20%過(guò)硫酸銨(w/v), 5 μL 20%亞硫酸鈉(w/v)，迅速混勻，蓋上薄蓋玻片(18 mm×18 mm)。待膠凝聚之后，取下蓋玻片，將載玻片置于1×PBS中洗兩次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，1×PBS漂洗3次，0.25% Triton X-100透化2 h，1×PBS漂洗3次，3%牛血清蛋白(BSA)室溫封閉1 h，1×PBS漂洗3次。H3Ser10ph抗體(1∶200稀釋, v/v)和Tubulin抗體(1∶1 000稀釋, v/v)混合后，4℃孵育過(guò)夜。Alexa FluorR 594標(biāo)記的羊抗兔IgG(Goat Anti-Rabbit IgG, Jackson ImmunoResearch)(1∶2 000, v/v)和FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Goat Anti-Mouse IgG, Jackson ImmunoResearch)(1∶2 000, v/v)，37℃孵育2 h。最后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI, 0.01 mg/mL+90%甘油)封片固定。利用ZEISS激光掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 組蛋白H3Ser10ph抗體的特異性分析

對(duì)精巢組織所提取的胞漿蛋白和核蛋白(圖1: A)進(jìn)行H3Ser10ph抗體特異性檢測(cè)，Western blot結(jié)果顯示在與H3組蛋白分子量相近的17 kD處有一條單一的目的條帶(圖1: B)，表明所使用的抗體可以特異識(shí)別家蠶精巢組織中的H3組蛋白，可以作為進(jìn)一步減數(shù)分裂細(xì)胞周期定位的抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)。

圖1 Western blot檢測(cè)家蠶精巢組織中H3Ser10磷酸化(H3Ser10ph)抗體的特異性Fig. 1 The specificity of the phospholated H3 Ser10(H3Ser10ph) antibody in testes of Bombyx moridetected by Western blotA: SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳之后通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)提取的精巢組織胞漿蛋白(Cy)和核蛋白(N)Detection of cytoplasmic (Cy) and nuclear protein (N) extracted from testes by Coomassie blue staining after SDS-polyacrylamide gel electrophoresis; B: Western blot檢測(cè)精巢組織所提取的胞漿蛋白(Cy)和核蛋白(N)中H3Ser10ph抗體(P-Ab)，組蛋白H3抗體(ab1791)為內(nèi)參抗體Detection of the H3Ser10ph antibody (P-Ab) in cytoplasmic (Cy) and nuclear protein (N) extracted from testes by Western blot, and the histone H3 antibody (ab1791) is the internal control antibody. MW: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker.

2.2 H3Ser10ph在有核精子精母細(xì)胞減數(shù)分裂中的動(dòng)態(tài)分布

對(duì)家蠶有核精子精母細(xì)胞減數(shù)分裂中H3Ser10ph的定位進(jìn)行觀察，免疫熒光的結(jié)果表明：在有核精子精母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)第一次分裂前期I的粗線期時(shí)即可觀察到H3Ser10ph信號(hào)定位在染色體的特定位置(圖2: A)，隨著細(xì)胞進(jìn)入雙線期，染色體上的信號(hào)逐漸變?nèi)?圖2: B)，至終變期，信號(hào)幾乎完全消失(圖2: C)；當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入中期I時(shí)，染色體上又開始出現(xiàn)紅色信號(hào)(圖2: D)，而且隨著第一次減數(shù)分裂周期繼續(xù)進(jìn)行，染色體上的信號(hào)逐漸變多變強(qiáng)，整條染色體上均可以觀察到磷酸化信號(hào)，不同位置的信號(hào)強(qiáng)弱基本一致(圖2: E)；后期I和末期I時(shí)染色體上的信號(hào)消失。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)第二次分裂前中期時(shí)，染色體臂上的信號(hào)消失，在靠近紡錘體微管的分裂面處有彌散的H3Ser10ph抗體的信號(hào)(圖2: F, H)；減數(shù)第二次分裂末期，僅剩余非常微弱的H3Ser10ph信號(hào)殘留于染色體的特定位置(圖2: G)。

圖2 組蛋白H3Ser10磷酸化(H3Ser10ph)抗體在家蠶有核精子精母細(xì)胞的定位Fig. 2 Localization of the phosphorylated histone H3Ser10 (H3Ser10ph) antibodyduring eupyrene spermatocytes of the silkworm, Bombyx moriA: 粗線期，H3Ser10ph抗體的信號(hào)出現(xiàn)在染色體的一些區(qū)域At the pachytene, the H3Ser10ph antibody signals appear in some regions of chromosome; B: 雙線期，H3Ser10ph抗體的紅色熒光信號(hào)變?nèi)?At the diplotene, the red fluorescent signals of the H3Ser10ph antibody become faint; C: 終變期，H3Ser10ph抗體的信號(hào)完全消失 At the diakinesis, the H3Ser10ph antibody signals completely disappear; D: 中期I，染色體上又開始出現(xiàn)一些較強(qiáng)的H3Ser10ph抗體的信號(hào) At the metaphase I, some of strong fluorescent staining signals of H3Ser10ph are localized on the chromosome; E: 中期I，H3Ser10ph抗體的信號(hào)在整條染色體上分布At the metaphase I, the H3Ser10ph antibody signals spread along the whole chromosomes; F: 前中期II，在靠近微管的分裂面處有彌散的H3Ser10ph抗體的信號(hào)，如放大圖H中箭頭所示At the metaphase II, there is holo-shaped fluorescent signal of the H3Ser10ph near the microtubulin attaching side, as shown by the arrows in enlarged view H; G: 末期II，僅剩余非常微弱的H3Ser10ph抗體的信號(hào)，藍(lán)色信號(hào)示DAPI，紅色示H3Ser10ph抗體的信號(hào), 綠色示α-微管蛋白。At the telophase II, there are very weak staining signals of the H3Ser10ph antibody. DAPI is indicated with blue signal, the H3Ser10ph antibody with red, and α-tubulin with green. 標(biāo)尺Bars=10 μm.

2.3 H3Ser10ph在無(wú)核精子精母細(xì)胞減數(shù)分裂中的動(dòng)態(tài)分布

對(duì)家蠶無(wú)核精子精母細(xì)胞減數(shù)分裂中H3Ser10ph的定位進(jìn)行觀察，免疫熒光的結(jié)果表明：與有核精子精母細(xì)胞中的H3Ser10ph信號(hào)相似，在無(wú)核精子精母細(xì)胞減數(shù)分裂粗線期可觀察到信號(hào)定位在染色體的特定位置(圖3: A)，隨著細(xì)胞進(jìn)入第一次減數(shù)分裂中期I時(shí)，染色體上的信號(hào)逐漸變多變強(qiáng)，整條染色體上均可以觀察到磷酸化信號(hào)，不同位置的信號(hào)強(qiáng)弱基本一致(圖3: B)。不同的是，后期I，伴隨著紡錘絲將同源染色體拉向兩極，H3Ser10ph的信號(hào)依然均勻分布在染色體上(圖3: C)；而且與有核精子精母細(xì)胞紡錘體與同源染色體結(jié)合不同，在無(wú)核精母細(xì)胞后期I時(shí)，紡錘絲微管與赤道面平行排列。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入末期I時(shí)，分離到兩端的染色體上依然存在H3Ser10ph抗體的信號(hào)(圖3: D)，減數(shù)第二次分裂中期，染色體臂上的信號(hào)消失，在靠近紡錘體微管的分裂面處有彌散的H3Ser10ph抗體的信號(hào)(圖3: E)。

圖3 組蛋白H3Ser10磷酸化(H3Ser10ph)抗體在家蠶無(wú)核精子精母細(xì)胞的定位Fig. 3 Localization of the phosphorylated histone H3Ser10 (H3Ser10ph) antibodyduring apyrene spermatocytes of the silkworm, Bombyx moriA: 粗線期，H3Ser10ph抗體的信號(hào)出現(xiàn)在染色體的一些區(qū)域At the pachytene, the H3Ser10ph antibody signals appear in some regions of chromosome; B: 中期I，H3Ser10ph抗體的信號(hào)在整條染色體上分布 At the metaphase I, the H3Ser10ph antibody signals spread along the whole chromosomes; C: 后期I，H3Ser10ph抗體的信號(hào)依然存在于整條染色體上At the anaphase I, the H3Ser10ph antibody signals spread along the whole chromosomes; D: 末期I，分離到兩端的染色體上依然存在較強(qiáng)的H3Ser10ph抗體的信號(hào)At the anaphase I, strong fluorescent staining signals of the H3Ser10ph antibody are still localized on the chromosome separated to both ends; E: 中期II，在靠近微管的分裂面處有彌散的H3Ser10ph抗體的信號(hào) At the metaphase II, there is holo-shaped fluorescent signal of the H3Ser10ph antibody close to the microtubulin attaching side. 藍(lán)色信號(hào)示DAPI，紅色示H3Ser10ph抗體的信號(hào), 綠色示α-微管蛋白。DAPI is indicated with blue signal, the H3Ser10ph antibody with red, and α-tubulin with green. 標(biāo)尺Bars=10 μm.

3 討論

減數(shù)分裂中DNA復(fù)制一次，而細(xì)胞連續(xù)分裂兩次，為了保證染色體的正確分離，細(xì)胞中存在許多精確的調(diào)控機(jī)制。其中，DNA復(fù)制之后定位在染色體上的黏連蛋白從染色體上的逐步降解對(duì)于染色體的正確分離至關(guān)重要(Hirano, 2000)。減I后期，姐妹染色單體臂上的黏連蛋白在CK1激酶的作用下被降解，而著絲粒區(qū)的黏連蛋白則在一種被稱為SHUGOSHIN蛋白的保護(hù)下直到減II后期才會(huì)被降解(Ishiguroetal., 2010)，在著絲粒區(qū)殘留的黏連蛋白對(duì)于動(dòng)粒蛋白與紡錘絲微管之間的張力維持很重要。SGO1在染色體上的重分布對(duì)于染色體的正確分離很關(guān)鍵(Liuetal., 2013)。

家蠶作為鱗翅目的模式物種，它所擁有的彌散型著絲粒染色體既丟失了著絲粒區(qū)表觀蛋白CENH3，又丟失了動(dòng)力蛋白CENPA和CENPC(Drinnenbergetal., 2014)，暗示在家蠶中可能有不依賴于這些蛋白的動(dòng)粒組裝模式。最近的研究表明CENP-T(Cortes-Silvaetal., 2020)和CENP-N(Lietal., 2019)在家蠶不依賴CENH3的動(dòng)粒組裝中發(fā)揮重要作用。對(duì)家蠶有核精子和無(wú)核精子精母細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，與有核精子精母細(xì)胞中心粒周期性地與核膜結(jié)合不同，無(wú)核精子精母細(xì)胞明顯缺乏中心粒與細(xì)胞核的附著(Yamashiki and Kawamura, 1998)。舞毒蛾精母細(xì)胞細(xì)胞學(xué)的研究結(jié)果表明無(wú)核精子精母細(xì)胞在前期I同源染色體不完全配對(duì)聯(lián)會(huì)，存在單價(jià)體，核仁不融合，后期I染色體分離異常(Reinholdtetal., 2002)。

本研究利用特異識(shí)別H3Ser10ph抗體，在家蠶精巢組織中利用免疫熒光技術(shù)，研究了這一保守的組蛋白翻譯后修飾在家蠶有核精子和無(wú)核精子精母細(xì)胞減數(shù)分裂中的動(dòng)態(tài)分布(圖2和3)。結(jié)果表明，粗線期H3Ser10ph修飾在兩種類型的精母細(xì)胞中均出現(xiàn)點(diǎn)狀信號(hào)，至中期I，高度凝縮的染色體上均勻分布較強(qiáng)的信號(hào)；不同的是，在無(wú)核精子精母細(xì)胞后期I至末期I時(shí)持續(xù)在染色體上存在均一的信號(hào)，與染色體持續(xù)凝縮的狀態(tài)相一致，而且后期I時(shí)紡錘絲與赤道面平行而不是垂直(圖3: C)，說(shuō)明H3Ser10ph可能參與家蠶有核精子和無(wú)核精子精母細(xì)胞減數(shù)分裂后期I至末期I的調(diào)控，暗示減I存在異常分離的無(wú)核精子精母細(xì)胞染色質(zhì)去凝縮也出現(xiàn)異常。結(jié)合H3Ser10ph修飾在草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞有絲分裂中參與染色質(zhì)凝縮的功能，推測(cè)該修飾在鱗翅目的彌散型著絲粒染色體上參與染色質(zhì)凝縮與去凝縮的調(diào)控。未來(lái)可以通過(guò)克隆家蠶中催化組蛋白磷酸化修飾的相關(guān)蛋白激酶進(jìn)行深入的功能研究。該結(jié)果為進(jìn)一步探討組蛋白翻譯后修飾在家蠶精母細(xì)胞減數(shù)分裂中的功能提供了前期基礎(chǔ)。