王 瓅，王素雅，周芹芹，張萬(wàn)佳

（1. 南京財(cái)經(jīng)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210023；2. 江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；3. 江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

中國(guó)栽培及食用竹筍的歷史十分悠久，已有千年。竹筍味甘、微寒，具有消渴、清肺及化痰的效用，有“寒土山珍”之稱[1]。此外，竹筍還具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有豐富的多糖、黃酮、生物堿及鈣、鐵、硒、磷等多種微量元素成分，具有消炎、防癌、抗衰老、降血壓等[2]作用。

毛竹（Phyllostachys pubescensy）屬于禾本科竹亞科，是一種多功能林業(yè)植物，具有強(qiáng)季節(jié)性特征。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，毛竹中的天然多糖有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)腸道微生物等多種生理活性[3-4]。目前，對(duì)于毛竹多糖的研究尚存在提取率低，純度不高等問(wèn)題，且關(guān)于毛竹多糖的結(jié)構(gòu)和物質(zhì)組成報(bào)道較少。因此，本研究以毛竹為研究對(duì)象，結(jié)合傳統(tǒng)的水提醇沉法提取多糖，利用響應(yīng)面法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)對(duì)其理化性質(zhì)及初步結(jié)構(gòu)進(jìn)行探究，以期能更好地開發(fā)利用毛竹資源，為毛竹多糖的工業(yè)化生產(chǎn)及結(jié)構(gòu)活性的研究提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮毛竹采：購(gòu)于江蘇省南京眾彩果蔬市場(chǎng)，貯藏于-20 ℃；95%乙醇：無(wú)錫市亞盛化工有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：科密歐化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白：惠興生化試劑有限公司；明膠：九鼎化學(xué)有限公司；氯化鋇、硫酸鉀、咔唑、D-半乳糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、木糖、硫酸鐵：麥克林生化科技有限公司；鹽酸、濃硫酸、三氯甲烷：南京化學(xué)試劑股份有限公司；苯酚、溴化鉀：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；透析袋MD44（截留分子質(zhì)量3 500 Da）、考馬斯亮藍(lán)G250：北京索萊寶科技有限公司；正丁醇：西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE52CS 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FreeZone 4.5Plus 型冷凍干燥儀：美國(guó)Labconco 公司；ST-110A 型水分測(cè)定儀：廈門易仕特儀器有限公司；GC436 型氣相色譜儀：北京布魯克科技有限公司；Waters1525 型凝膠滲透色譜儀：美國(guó)沃斯特有限公司；TENSOR27 型傅立葉紅外光譜儀：德國(guó)Bruker公司；TM3000 型掃描電鏡：日本Hitachi 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 預(yù)處理

將新鮮毛竹去籜后，用蒸餾水漂洗干凈，切成1 cm3的方塊并打漿，于55 ℃烘干，粉碎后過(guò)60 目篩密封保存。

1.3.2 毛竹多糖的制備

將預(yù)處理后的毛竹粉按一定料液比溶于蒸餾水中，在要求的溫度下浸提一定時(shí)間，采用Sevag 法脫蛋白，離心去除下層有機(jī)溶液，加入3 倍體積95%乙醇混勻，靜置24 h 后離心收集沉淀，流水透析1 ～2 d，透析液經(jīng)過(guò)冷凍干燥得到毛竹水溶性多糖。按式（1）計(jì)算多糖提取率。

式中：c 為毛竹水溶性多糖提取率，%；m1為凍干的水溶性多糖質(zhì)量，g；m2為毛竹粉質(zhì)量，g。

1.3.3 提取工藝優(yōu)化

在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）三個(gè)因素為自變量進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。根據(jù)Box-Behnken 原理，以多糖提取率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)三因素三水平的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

1.3.4 毛竹多糖化學(xué)成分的測(cè)定

（1）多糖含量：硫酸-苯酚法[5]。

（2）蛋白質(zhì)含量：考馬斯亮藍(lán)G-250 法[6]。

（3）水分含量：稱量多糖樣品500 mg，置于托盤上，放入快速水分測(cè)定儀，測(cè)定水分含量。

（4）糖醛酸含量：硫酸-咔唑法[7]。

（5）硫酸根離子含量：氯化鋇-明膠法[8]。

1.3.5 毛竹多糖理化性質(zhì)的測(cè)定

（1）紅外光譜分析：取多糖樣品1～2 mg，置于瑪瑙研缽中充分研磨，加入溴化鉀固體粉末150 mg，研磨均勻后用壓片機(jī)壓片，用傅立葉紅外分光光度計(jì)在4 000～500 cm-1范圍內(nèi)檢測(cè)紅外吸收光譜。

（2）單糖組成分析：采用氣相色譜法（GC）[9]。GC分析參數(shù)：毛細(xì)管柱DB-5MS，載氣為氮?dú)?，分流?0∶1，檢測(cè)器溫度250 ℃，柱溫起始50 ℃，以10 ℃/min 升至230 ℃，汽化室溫度280 ℃。

（3）相對(duì)分子量測(cè)定：采用凝膠滲透色譜（GPC）法[10]。GPC 參數(shù)：2414 示差折光檢測(cè)器；PL aquqgel-OH MIXED 凝膠色譜柱；流動(dòng)相：0.2 mol/L NaNO3溶液混合0.01 mol/L NaH2PO4溶液配成pH 7 的溶液；流量精度0.1%；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

（4） 掃描電鏡分析：用導(dǎo)電膠將毛竹多糖均勻地粘在樣品臺(tái)上，吹除多余浮粉，噴金鍍膜后用掃描電鏡在15 kV 加速電壓下觀察樣品在不同倍數(shù)下的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25 軟件進(jìn)行單因素分析，采用Design Expert 11 軟件對(duì)Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化毛竹多糖的提取條件

2.1.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與方差分析

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 原理，采用Design Expert 11軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。以多糖提取率為響應(yīng)值進(jìn)行擬合，得到回歸方程：

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

為進(jìn)一步確定回歸模型的可靠性，對(duì)其進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。模型的P 值＜0.000 1，表示模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.080 6 ＞0.05），說(shuō)明該模型擬合度高，實(shí)驗(yàn)誤差小[11]。決定系數(shù)R2=0.981 5，表明模型響應(yīng)值的變化有98.15%來(lái)自所選因變量，進(jìn)一步表明模型中實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值符合情況較好，可以用回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)[12]。由P 值可知，一次項(xiàng)B、C、交互項(xiàng)AB、BC 和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)提取率均存在顯著影響（P ＜0.01），且對(duì)響應(yīng)值的影響大小依次為：B ＞ C ＞ A，驗(yàn)證了上述回歸方程得出的影響程度順序。

2.1.2 兩因素交互作用分析與最佳工藝的確定

圖1—圖3 中響應(yīng)面曲圖的陡峭順序?yàn)锳B ＞BC ＞ AC，結(jié)合等高線觀察發(fā)現(xiàn)，AB、BC 等高線呈橢圓形，而AC 更接近圓形，說(shuō)明料液比與提取溫度間交互作用對(duì)多糖提取率的影響最明顯，其次是提取溫度與提取時(shí)間的交互作用，而料液比與提取時(shí)間的交互作用最不顯著。

利用軟件Design Expert 11 對(duì)擬合方程進(jìn)行優(yōu)化，得到提取毛竹多糖的最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶26.39（g/mL），提取溫度77.42 ℃，提取時(shí)間3.82 h，毛竹多糖的提取率達(dá)到5.22%。綜合實(shí)際操作的方便性考慮，將最佳工藝條件調(diào)整為：料液比1∶27 g/mL，提取溫度78 ℃，提取時(shí)間4 h，經(jīng)過(guò)3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，毛竹多糖最終實(shí)際提取率為（5.18±0.07）%，與理論值接近，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)擬合的優(yōu)化工藝條件具有可行性和實(shí)用價(jià)值。

2.2 主要成分分析

由表4 可知，BSP 中多糖含量72.14%，較殷凱[13]獲得的毛竹粗多糖含量（23.68%）顯著提高，但比Zhang 等[14]提取毛竹粗多糖的總糖含量88.40%低，可能與竹筍的產(chǎn)地、采收季節(jié)與提取方法不同有關(guān)。BSP 中含0.95%蛋白質(zhì)，該部分蛋白可能是與多糖結(jié)合生成糖蛋白而被保留下來(lái)，這與吳金松等[15]報(bào)道的Sevag 法不能完全脫除多糖中蛋白質(zhì)的結(jié)果一致。BSP 含糖醛酸9.76%，與王靜等[9]報(bào)道的毛竹多糖中糖醛酸含量8.36%～12.99%的結(jié)果一致。此外，BSP 中含有極其微量的硫酸根，而Chen 等[16]和Wu等[17]研究發(fā)現(xiàn)方竹、大葉麻竹多糖中不含硫酸根離子，說(shuō)明不同品種的竹筍多糖，化學(xué)組成差異明顯。

表3 提取率回歸方程的方差分析結(jié)果

表4 毛竹多糖的主要化學(xué)成分 單位：%

2.3 紅外光譜分析

紅外光譜圖（圖4）顯示，BSP 在3 419.67、2 928.73、1 652.68、1 558.47、1 418.90 和1 075.50 cm-1有吸收峰。3 419.67 cm-1吸收峰為多糖分子間或分子內(nèi)氫鍵O—H 伸縮振動(dòng)的強(qiáng)吸收峰，2 928.73 cm-1處吸收峰是烷基的C—H 伸縮振動(dòng)，這兩個(gè)吸收峰是多糖類的特征峰[18]，1 652.68 cm-1附近的振動(dòng)是氨基的N—H 變角振動(dòng)，表明毛竹多糖還含有少量蛋白質(zhì)，此結(jié)果與上述化學(xué)成分結(jié)果（毛竹多糖含0.95%蛋白質(zhì)）符合，1 418.90 cm-1處吸收峰為羧基的C ═O 對(duì)稱伸縮振動(dòng)，根據(jù)化學(xué)法分析，此處可能是糖醛酸的羧酸部分[19]，與上述硫酸-咔唑法檢測(cè)出含有少量的糖醛酸結(jié)果一致，說(shuō)明BSP是一種酸性多糖。1 075.50 cm-1處吸收峰為常見(jiàn)的吡喃型糖環(huán)[20]，表明BSP 中存在吡喃型單糖。

2.4 單糖組成分析

BSP 酸解后衍生化的氣相色譜如圖5 所示。經(jīng)計(jì)算可知其單糖組成及摩爾比為n甘露糖∶n葡萄糖∶n阿拉伯糖∶n木糖∶n鼠李糖∶n半乳糖＝62.52∶23.05∶10.35∶2.78∶0.79∶0.51，其中甘露糖的含量最高，其次是葡萄糖，半乳糖最少。而唐莉莉等[21]提取的毛竹葉多糖中，各單糖摩爾比分別為n甘露糖∶n葡萄糖∶n阿拉伯糖∶n木糖∶n鼠李糖∶n半乳糖＝0.52∶2. 84∶1.08∶0.24∶0.13∶0. 95，含量最高的是葡萄糖，最少的是鼠李糖。可見(jiàn)毛竹不同部位提取的多糖，其單糖的組成類型相同，但含量存在顯著差異。

2.5 相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

由圖6 可知，BSP 有3 個(gè)較明顯的峰，但峰3不屬于聚合物的峰，可能是由空氣、雜質(zhì)或小分子物質(zhì)造成的雜峰。峰1 和峰2 為BSP 的峰，保留時(shí)間分別為7.400、8.817 min，經(jīng)計(jì)算可知兩個(gè)主峰的相對(duì)分子質(zhì)量分別是91.11、4.55 kDa。Zheng等[22]曾報(bào)道綠竹筍殼提取純化的多糖相對(duì)分子質(zhì)量為1.63×104kDa，He 等[23]報(bào)道了雷竹水溶性多糖相對(duì)分子質(zhì)量為83.50、80.08 kDa；陳光靜[24]測(cè)定方竹純化多糖的分子質(zhì)量為24.58、123.45 kDa。由此可知BSP 的相對(duì)分子質(zhì)量與雷竹多糖最為接近，與其他品種的竹筍多糖相對(duì)分子質(zhì)量相差較大。

2.6 掃描電鏡分析

通過(guò)掃描電鏡可以觀察到BSP 的微觀結(jié)構(gòu)特征。如圖7 所示，放大150 倍時(shí)可以清晰地看到BSP 呈光滑的片狀，帶有部分碎屑物；當(dāng)放大3 000 倍時(shí)，可觀察到BSP 截面呈蜂巢狀，結(jié)構(gòu)疏松，表面附著許多小顆粒，說(shuō)明其具有更大的比表面積。這種結(jié)構(gòu)賦予多糖較好的吸附力，說(shuō)明熱水浸提法條件較為溫和，BSP 的結(jié)構(gòu)保留較為完整[25]。

3 結(jié) 論

以水提醇沉得到的毛竹多糖為研究對(duì)象，考察不同料液比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以響應(yīng)面法優(yōu)化毛竹多糖的提取工藝，其最佳工藝條件為：料液比1∶27（g/mL），提取溫度78 ℃，提取時(shí)間4 h，該條件下多糖提取率為（5.18±0.07）%，含量為（72.14±0.02）%。該多糖是一種混合酸性多糖，主要由甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖組成，其分子質(zhì)量集中分布在9.11、4.55 kDa兩個(gè)主峰。掃描電鏡圖顯示，毛竹多糖呈蜂窩狀，附著許多細(xì)小顆粒，說(shuō)明BSP 有較好的黏附能力。