劉妍如，唐志書*，宋忠興，劉 峰，段金廒，陳 琳，史鑫波，楊寧娟，江大海

以藥效成分群-活性-功效關(guān)聯(lián)作用篩選當(dāng)歸質(zhì)量標(biāo)志物

劉妍如1，唐志書1*，宋忠興1，劉 峰2，段金廒3*，陳 琳1，史鑫波1，楊寧娟1，江大海1

1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室（培育），陜西省中藥產(chǎn)業(yè)研究院，陜西 咸陽 712083 2. 陜西國際商貿(mào)學(xué)院，陜西步長制藥有限公司，陜西 咸陽 712046 3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省方劑高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023

基于質(zhì)量標(biāo)志物（quality markers，Q-Marker）概念，通過構(gòu)建當(dāng)歸的藥效成分群-生物活性關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，確定影響當(dāng)歸藥材質(zhì)量的Q-Marker，建立當(dāng)歸藥材的整體質(zhì)控方法。以當(dāng)歸藥材表征成分結(jié)合主成分分析結(jié)果，對15批次不同產(chǎn)地當(dāng)歸藥材差異顯著的活性成分進行篩選，將初步選定的差異成分作為當(dāng)歸質(zhì)控的藥效成分群?；陉P(guān)聯(lián)規(guī)則，建立體外、體內(nèi)活性成分篩選評價模型，通過挖掘組分間關(guān)系，以此確定當(dāng)歸藥材的Q-Marker，并建立了Q-Marker同時定量的測定方法。經(jīng)UPLC-TOF/MS技術(shù)及藥動學(xué)參數(shù)預(yù)測，找到當(dāng)歸中11個具有潛在藥效活性的藥效成分群。經(jīng)藥效成分群-生物活性關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析，將阿魏酸、-藁本內(nèi)酯和歐當(dāng)歸內(nèi)酯A作為當(dāng)歸質(zhì)控的Q-Marker，其方法學(xué)結(jié)果顯示，3種化合物線性關(guān)系良好，＞0.990，精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，平均加樣回收率范圍為99.18%～100.25%。基于藥效成分群-生物活性關(guān)聯(lián)概念，采用多元統(tǒng)計結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)的當(dāng)歸藥材Q-Marker辨析方法，可以初步明確與當(dāng)歸藥效緊密聯(lián)系的化學(xué)成分來源，為當(dāng)歸的整體質(zhì)量控制提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

當(dāng)歸；質(zhì)量標(biāo)志物；藥效成分群；活性；功效；阿魏酸；Z-藁本內(nèi)酯；歐當(dāng)歸內(nèi)酯A；關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)；UPLC-TOF/MS

中藥材是生產(chǎn)中藥飲片和中成藥的基本原料，其質(zhì)量是保證中藥飲片和中成藥質(zhì)量的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。因此，中藥材質(zhì)量的規(guī)范化是保證中藥材質(zhì)量的重要措施和重要前提。國務(wù)院于2016年發(fā)布了《關(guān)于促進醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的指導(dǎo)意見》，明確提出完善中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，提高中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性和合理性。同年，劉昌孝院士[1]率先提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）的核心概念和理論，為提升我國中藥產(chǎn)品質(zhì)量和質(zhì)量控制水平研究指明了方向[2-3]?；谥兴幷w質(zhì)量控制的研究要求，本課題組認為，中藥的整體質(zhì)量不是單一成分藥效的簡單加合，而是存在著成分間多層次、多環(huán)節(jié)、多維度的非線性/線性協(xié)同作用。因此，要建立中藥整體質(zhì)量評價體系，首先要對影響中藥質(zhì)量的藥效成分群-生物活性的互作因素及其功效相關(guān)的生物效應(yīng)進行關(guān)聯(lián)性分析，挖掘其內(nèi)在的規(guī)律，對于找到關(guān)系藥材整體質(zhì)量的Q-Marker有重要涵義。這也是對于中藥材、中成藥整體質(zhì)量提升與開發(fā)研究關(guān)鍵科學(xué)問題的初步認知。

當(dāng)歸為傘形科二年生草本植物當(dāng)歸(Oliv.) Diels的干燥根，其藥用記載始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，距今已有2000多年歷史。當(dāng)歸具有濃郁的香氣，味甘、辛、微苦，具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功效。臨床主要用于治療血虛萎黃、眩暈心悸、虛寒腹痛、風(fēng)濕痹痛、跌撲損傷、腸燥便秘等癥[4]。作為典型的生境主導(dǎo)型道地藥材，產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境是影響當(dāng)歸品質(zhì)的主要因素，其道地主產(chǎn)區(qū)為甘肅南部，如岷縣、宕昌等地區(qū)。其他產(chǎn)地如云南、四川、湖北等地也有少量分布。由于受到當(dāng)歸價格上漲等因素的影響，當(dāng)歸的種植規(guī)模在非傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)有迅速擴張趨勢。然而，由于藥材生態(tài)環(huán)境的適宜性差異導(dǎo)致了各產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸藥材的質(zhì)量參差不齊，也給當(dāng)歸質(zhì)量控制帶來很大困難[5-6]。目前對當(dāng)歸質(zhì)量的控制主要參考《中國藥典》2020年版，其中僅以阿魏酸作為單指標(biāo)成分來評價當(dāng)歸質(zhì)量，而川芎、藁本的指標(biāo)性控制成分也是阿魏酸，因此單一成分并不能科學(xué)、全面、準(zhǔn)確反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量[7-8]。針對目前當(dāng)歸質(zhì)量參差不齊導(dǎo)致臨床療效不穩(wěn)定的問題，本研究采用高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫對當(dāng)歸提取物的化學(xué)成分進行表征，以藥動學(xué)參數(shù)（absorption-distribution-metabolism- excretion/toxicity，ADME/T）建議篩選標(biāo)準(zhǔn)對匹配化合物進行藥效成分群篩選；選擇當(dāng)歸的主要體外抗氧化指標(biāo)和體內(nèi)抗血虛、抗血瘀功效指標(biāo)，通過建立體外和體內(nèi)生物活性和主要成分的關(guān)聯(lián)，找到與當(dāng)歸生物活性相關(guān)系數(shù)較高的成分，并將這些成分作為當(dāng)歸質(zhì)控的Q-Marker。最后建立當(dāng)歸Q-Marker含量測定方法學(xué)，以此完成以成分映射藥效的當(dāng)歸質(zhì)量標(biāo)志物的研究方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Acquity H-CLASS型超高效液相色譜（UPLC，美國沃特世科技有限公司）串聯(lián)Triple TOFTM5600+質(zhì)譜儀（美國愛博才思公司），液相配置：二元超高壓溶劑系統(tǒng)、FTN自動進樣管理器、PDA檢測器和Empower3色譜工作站；Agilent 1290 Infinity II型超高效液相色譜（UHPLC，美國Agilent公司）串聯(lián)AB Sciex 4500 Qtrap三重四級桿線性離子阱質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司），液相配置：G7120A四元梯度泵、G7129B自動進樣器、G7116A柱溫箱；Sartorius CPA225D型十萬分之一電子分析天平，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，江蘇昆山市超聲儀器有限公司；DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋，上海科恒實業(yè)發(fā)展有限公司；GeneVac miVac低溫離心濃縮儀，英國GeneVac公司；Thermo1510型全波長酶標(biāo)儀、Thermo Micro17R微量低溫冷凍離心機，美國賽默飛世爾科技有限公司；FT-200動物跑步機，成都泰盟軟件有限公司。

1.2 試劑

對照品阿魏酸，批號110773-201614，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%，中國食品藥品檢定研究院；對照品-蒿本內(nèi)酯，批號wkq16052404，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司；對照品歐當(dāng)歸內(nèi)酯A，批號MUST-18032812，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.90%（HPLC），成都曼思特生物科技有限公司；GSH-PX試劑盒、羥自由基試劑盒，南京建成生物工程研究所；DPPH試劑，批號W27F10E81251，上海源葉生物科技有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS快速法），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；肝素鈉一次性使用真空采血管，江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司；鹽酸腎上腺素注射液，遠大醫(yī)藥（中國）有限公司，批號181201；甲酸（FlukaTM），色譜純，美國霍尼韋爾公司；乙腈，色譜純，德國默克公司；其他試劑均為分析純。實驗用水為屈臣氏蒸餾水。

1.3 藥材

本研究所用各批次當(dāng)歸藥材購于甘肅省，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)劉世軍教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸(Oliv.) Diels的干燥根。當(dāng)歸對照藥材，批號120927-200613，購于中國藥品生物制品檢定研究院。15批當(dāng)歸藥材及對照藥材信息見表1。

1.4 動物

SPF級SD雄性大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量為 （200±20）g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（川）2015-030。環(huán)境溫度（23±2）℃，濕度（50±10）%，12 h光/暗循環(huán)（光照時間8:00～20:00），自由進食飲水。在實驗開始前每天給予連續(xù)5 min的撫摸適應(yīng)，1周后大鼠隨機分組，每組6只。所有動物實驗遵循陜西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

表1 15批當(dāng)歸信息

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC/Q-TOF-MS/MS成分表征及指紋圖譜測定

2.1.1 色譜條件優(yōu)化 流動相分別比較了乙腈-水和甲醇-水2個溶劑系統(tǒng)，結(jié)果表明，用乙腈-水二元梯度洗脫系統(tǒng)比用甲醇-水梯度洗脫基線平，且耗時短。分析時間僅用30 min，樣品1 h譜圖顯示，30 min后無特征峰出現(xiàn)。

以相鄰2峰的分辨率之和（∑s）、色譜分離系數(shù)（*）、色譜信息量（）和分層色譜響應(yīng)值（hierarchical chromatographic response function，HCRF）對指紋圖譜的分離峰個數(shù)（）、分離度和分析時間性能進行評價，色譜分離質(zhì)量評價計算公式見式1～3[9]。

A為色譜峰面積，R為相鄰兩峰間分離度，n為理論塔板數(shù)

HCRF＝1 000 000＋10 000min＋max－min（3）

min為最小分離度，max－min為最大與最小保留時間之差

為了獲得最佳的參數(shù)設(shè)置，選擇柱溫（25～35 ℃）、體積流量（0.2～0.5 mL/min）、緩沖液濃度（0.1%～0.2%甲酸水溶液、0.05%～0.2%乙酸水溶液）、水相初始比例（95%～99%），色譜柱類型［柱1（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱2（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱3（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）］作為優(yōu)化參數(shù)，結(jié)果見表2。

優(yōu)化結(jié)果顯示，緩沖系統(tǒng)為0.1%甲酸水溶液，柱溫為30 ℃時，水相初始比例為98%，體積流量為0.3 mL/min時，各峰分離度均＞1.5，理論塔板數(shù)參數(shù)優(yōu)化結(jié)果較好，以各色譜峰計算均＞8000，因此將此作為固定條件進行樣品測定。

表2 色譜條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.2 測定波長選擇 檢測波長經(jīng)過對光電二級陣列管檢測器檢測三維圖譜分析，根據(jù)當(dāng)歸藥材中主要成分的特征波長，從波長210～400 nm選取代表各單味藥材的重點波長323 nm，進行指紋圖譜評價。

2.1.3 測定條件

（1）質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI），正離子模式下，采用信息依賴采集（IDA）、動態(tài)背景扣除（DBS）和高靈敏度模式采集數(shù)據(jù)。母離子（TOF-MS）掃描范圍/50～1200，對超過100 cps的8個最強峰進行MS2采集數(shù)據(jù)，子離子（MS/MS）掃描范圍為/50～1200。源噴射電壓（ion spray voltage floating）為5500 V，裂解電壓（declustering potential，DP）為40 V，碰撞能量（collision energy，CE）為10 eV，霧化氣（ion source gas 1，GS1）和輔助氣（ion source gas 2，GS2）為氮氣，皆為344.738 kPa（50 psi），氣簾氣（curtain gas，CUR）241.316 kPa（35 psi），霧化溫度（temperature，TEM）550 ℃。

（2）色譜條件：采用Acquity UPLC?BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫程序為0～1 min，2%乙腈；1～18 min，2%～100%乙腈；18～20 min，100%乙腈；20～23 min，100%～2%乙腈；23～25 min，2%乙腈；體積流量為0.3 mL/min；進樣量2 μL；柱溫30 ℃。

2.1.4 供試品溶液的制備 參照《中國藥典》2020年版一部當(dāng)歸含量測定項下供試品溶液的制備方法，稱取當(dāng)歸粉末（過三號篩）約0.2 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入20 mL 70%甲醇，稱定質(zhì)量，85 ℃水浴回流30 min，靜置放冷，稱定質(zhì)量，加入溶劑補足減少的質(zhì)量，搖晃均勻后靜置，取上清液濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，至10 mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，即為供試品溶液，備用。

2.1.5 對照品溶液的制備 參照《中國藥典》2015年版一部當(dāng)歸含量測定項下對照品溶液的制備方法，取阿魏酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成含阿魏酸12 μg/mL的對照品溶液，即得。

2.1.6 譜峰篩選 將UPLC/Q-TOF-MS/MS分析檢測得到的圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入PeakView 2.2軟件對化合物進行鑒定（圖1-A）。通過對各樣品正離子模式下UPLC/Q-TOF-MS/MS總離子流圖比較、分析及篩選得到18個共有特征峰，其峰面積之和占總峰面積的90%以上（圖1-B）。具有一定的代表性。根據(jù)PeakView 2.2軟件、Masterview的中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫并結(jié)合一級質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰、二級質(zhì)譜碎片信息以及文獻對18個化合物進行鑒定。根據(jù)PeakView 2.2軟件分析其元素組成，并結(jié)合一級、二級質(zhì)譜碎片信息以及文獻，對當(dāng)歸指紋圖譜中的共有峰進行鑒定，大致推斷出18個化合物的可能結(jié)構(gòu)信息 （表3）。

2.2 藥效成分群篩選

本標(biāo)準(zhǔn)采用AB Sciex master view中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫（TCM Library 1.0）作為從指紋圖譜共有峰中篩選藥效成分群的匹配庫，參考TCMSP數(shù)據(jù)庫參數(shù)及SwissADME（http://www.swissadme.ch/）計算結(jié)果，對匹配化合物進行藥動學(xué)參數(shù)預(yù)測篩選[19-20]。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%或類藥性（drug-like，DL）≥0.18（TCMSP數(shù)據(jù)庫），氫鍵給體＜5，氫鍵受體＜10，油水分配系數(shù)（Mlog）＜4.15（Swiss ADME預(yù)測）為關(guān)鍵篩選指標(biāo)進行化合物篩選，得到11個化合物[21-22]。結(jié)果見表4。

2.3 體外抗氧化活性

2.3.1 樣品溶液的制備 稱取當(dāng)歸粉末（過三號篩）約0.2 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入20 mL 70%甲醇，稱定質(zhì)量，85 ℃水浴回流30 min，靜置放冷，稱定質(zhì)量，加入溶劑補足減少的質(zhì)量，搖晃均勻后靜置，取上清液濾過，取續(xù)濾液備用。

2.3.2 ABTS·+自由基抑制率測定 參照總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS快速法）檢測方法，分別制備70%甲醇當(dāng)歸樣本反應(yīng)溶液（樣本＋ABTS試劑）和70%甲醇陰性對照溶液（70%甲醇＋ABTS試劑）。按照說明分別配制工作液和反應(yīng)液，加樣在避光條件下進行，加樣后27 ℃孵育6 min，使用酶標(biāo)儀分別測定734 nm處吸光度（）值。每份樣品平行測定3次，取平均值，按公式4計算ABTS·+自由基抑制率。結(jié)果顯示，各批次樣品ABTS·+自由基抑制率范圍在81.42%～89.71%，大小分別為S14＞S7＞S4＞S8＞S3＞S10＞S12＞S2＞S15＞S9＞S5＞S11＞S6＞S13＞S1（圖2）。

ABTS·+自由基抑制率＝(0－A)/0（4）

0為陰性對照溶液的值，A為當(dāng)歸樣本反應(yīng)溶液的值

2.3.3 DPPH·自由基抑制率測定 向0.2 mmol/L的DPPH·甲醇溶液加入等體積當(dāng)歸樣本溶液（空白對照以70%甲醇溶液代替），加樣后混勻，室溫下避光靜置30 min，用酶標(biāo)儀測定517 nm處的值。每份樣品平行測定3次，取平均值，按公式5計算DPPH·自由基抑制率。結(jié)果顯示，各批次樣品DPPH·自由基抑制率范圍在42.89%～73.86%，大小分別為S14＞S13＞S2＞S9＞S5＞S3＞S1＞S4＞S7＞S6＞S8＞S11＞S15＞S12＞S10（圖2）。

DPPH·自由基抑制率＝(s－b)/c（5）

s為150 μL的DPPH·溶液＋150 μL的當(dāng)歸樣品值，b為150 μL的當(dāng)歸樣品＋150 μL的70%甲醇溶液值，c為150 μL的70%甲醇溶液＋150 μL的DPPH·溶液值

2.3.4 羥基自由基（·OH）抑制率檢測方法 將制備得到的當(dāng)歸樣品溶液，使用低溫離心濃縮儀揮干，蒸餾水溶解，備用。將·OH試劑盒中的試劑按照說明書方法分別配制測試溶液。經(jīng)最佳取樣濃度摸索后，優(yōu)化結(jié)果在20%～55%時的稀釋倍數(shù)為最佳稀釋倍數(shù)，按1∶7稀釋樣品為最佳取樣濃度，將各批次當(dāng)歸樣品按照1∶7稀釋后按操作表進行測試（稀釋倍數(shù)為8）。按照實驗操作表進行實驗，用酶標(biāo)儀測定550 nm處的值。每份樣品平行測定3次，取平均值，按公式6計算·OH抑制率。結(jié)果顯示，各批次樣品·OH抑制率范圍在61.36%～28.25%，大小分別為S6＞S4＞S3＞S5＞S1＞S2＞S14＞S7＞S8＞S9＞S12＞S11＞S15＞S13＞S10（圖2）。

1-綠原酸 2-傘形花內(nèi)酯 3-東莨菪內(nèi)酯 4-阿魏酸 5-對香豆酸 6-洋川芎內(nèi)酯I 7-濱蒿內(nèi)酯 8-香豆素 9-肉桂酸 10-補骨脂素 11-佛手苷內(nèi)酯 12-異茴芹內(nèi)酯 13-洋川芎內(nèi)酯A 14-蛇床子素 15--藁本內(nèi)酯 16-歐當(dāng)歸內(nèi)酯A 17-亞油酸 18-亞油酸甲酯

1-chlorogenic acid 2-umbelliferone 3-scopoletin 4-ferulic acid 5--coumaric acid 6-senkyunolide I 7-scoparone 8-coumarin 9-cinnamic acid 10-psoralen 11-bergapten 12-isopimpinellin 13-3--butyl-4,5-dihydrophthalide 14-osthole 15--ligustilide 16-levistilide A 17-linoleic acid 18-methyl linoleate

圖1 當(dāng)歸藥材UPLC/Q-TOF-MS離子流IDA提取譜圖(A)及15批(S1～S15)不同產(chǎn)地當(dāng)歸藥材UPLC指紋圖譜(B)

Fig. 1 UPLC/Q-TOF-MS ion flow IDA extraction spectrum of ASR (A) and UPLC fingerprint chromatograms for 15 batches (S1—S15) of ASR from different habitats (B)

·OH?抑制率＝(對照－樣本)/對照（6）

2.4 體內(nèi)抗氧化研究

2.4.1 當(dāng)歸水提物制備[23]分別取各批次當(dāng)歸藥材（S1～S15）2 kg，加10倍量蒸餾水浸泡4 h，然后以加熱回流方式提取2次，每次2 h，濾過。藥渣再以8倍量水進行加熱回流提取2 h，濾過。合并水提液，真空減壓濃縮干燥后得到當(dāng)歸水提物樣品。

2.4.2 當(dāng)歸水提物對血虛（疲勞）大鼠作用研究

表3 15批當(dāng)歸藥材共有峰鑒定

表4 當(dāng)歸化學(xué)成分篩選結(jié)果

（1）模型制備[24]：采用力竭跑步加負重游泳交替方法建立復(fù)合式疲勞大鼠模型。大鼠適應(yīng)1周后，隨機分為對照組、模型組和給藥組，每組6只。參考前期研究，給藥組于造模前1周開始給予當(dāng)歸水提物連續(xù)ig至實驗結(jié)束，給藥劑量為5 g/(kg·d)，模型組和對照組給予等體積生理鹽水[23]。

負重游泳模型：將模型組和給藥組大鼠置于底×高（0.5 m2×1.3 m）的圓形亞克力水缸中進行適應(yīng)性游泳，適應(yīng)期為1周，每次20 min，水溫（25±2）℃。適應(yīng)期后，按照每只大鼠體質(zhì)量的5%計算游泳負重量，制備裝有負重量鋼球的負重物并束于大鼠尾根部，以大鼠沉入水底3 s即視作力竭。

圖2 15批當(dāng)歸藥材提取物體外抗氧化活性比較

疲勞式跑步模型：將模型組和給藥組大鼠置于動物跑步機（六通道，通道末端加電刺激）進行適應(yīng)性跑步訓(xùn)練，適應(yīng)期為2 d，跑速為10 m/min，每次20 min，跑臺坡度為0°。適應(yīng)期后按坡度0°、10°、30°，跑速15、20、25 m/min程序，每15分鐘逐步升級的方式進行45 min的疲勞式跑步，每天2次。跑步同時中以通道末端電刺激鼠尾部，以使大鼠保持持續(xù)性運動。

結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠血清GSH-Px活性顯著降低（＜0.01）。與模型組相比，各給藥組大鼠血清GSH-Px活性均顯著升高（＜0.01）。除S1、S9、S11、S15批次藥物與對照組相比無顯著差異外，其他批次藥物給藥后血清GSH- Px活性均高于對照組（圖3）。

2.4.3 當(dāng)歸水提物對急性血瘀大鼠作用研究

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

（1）模型制備[25-26]：參考前期研究，給藥組于造模前1周給予當(dāng)歸水提物，ig劑量為5 g/(kg·d)，模型組和對照組給予等體積蒸餾水，共2周[23]。給藥結(jié)束后，模型組和各給藥組大鼠分別sc鹽酸腎上腺素0.8 mL/kg，2 h后將大鼠浸入0～2 ℃冰水內(nèi)游泳5 min，第1次給予鹽酸腎上腺素后3 h，再次注射同等劑量的鹽酸腎上腺素。對照組注射同等劑量的生理鹽水，不進行冰水游泳。處置后，禁食不禁水。治療結(jié)束后，大鼠眼眶采血0.5 mL，制備血清，檢測各組GSH-Px活性。

2.5 當(dāng)歸Q-Marker篩選

將采集到的15批次當(dāng)歸水提物的UPLC-TOF- MS/MS成分鑒定數(shù)據(jù)、體外抗氧化活性、體內(nèi)抗氧化活性數(shù)據(jù)導(dǎo)入Simca-p14.1軟件進行特征峰評估以及偏最小二乘回歸分析（partial least squares regression，PLS）計算。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化、對數(shù)轉(zhuǎn)換及標(biāo)度化預(yù)處理數(shù)據(jù)后，建立多元統(tǒng)計模型。選取前2個主成分?jǐn)M合PLS模型。為了找到造成各組差異的成分信息，根據(jù)生成的PLS結(jié)果，繪制各成分關(guān)系的載荷圖，提取組間差別較大的化合物信息進行鑒定（圖4-A）。

同時，以變量投影重要性指標(biāo)VIP（variable importance in projection）描述各化合物在系統(tǒng)分析的重要性，選定VIP大于1的化合物作為潛在的Q-Marker。結(jié)果得到具有較大載荷的化合物有3個，分別為歐當(dāng)歸內(nèi)酯A（VIP：2.752），-藁本內(nèi)酯（VIP：1.710）和阿魏酸（VIP：1.663）（圖4-B）。進一步將各化合物與體外抗氧化活性、抗血虛疲勞GSH- Px活性、抗血瘀GSH-PX活性進行PLS關(guān)聯(lián)性分析，其中阿魏酸、對香豆酸、蛇床子素、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A、-藁本內(nèi)酯和亞油酸甲酯與體內(nèi)外生物活性均呈正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)均大于0.6，說明上述化合物水平的高低對于當(dāng)歸的生物活性和療效有重要影響（表5）。

圖4 15批當(dāng)歸藥材成分差異PLS載荷圖(A)和VIP得分圖(B)

因此，根據(jù)《中國藥典》2020年版收載的藥材質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合上述成分篩選結(jié)果，將歐當(dāng)歸內(nèi)酯A、-藁本內(nèi)酯和阿魏酸這3種化合物初步選定作為當(dāng)歸藥材質(zhì)控的Q-Marker。

2.6 當(dāng)歸Q-Marker測定方法學(xué)驗證

2.6.1 供試品溶液的制備 見“2.1.4”項下方法。

2.6.2 混合對照品儲備溶液的制備 取阿魏酸、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A和-藁本內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為2.5、0.1、1.5 μg/mL的混合對照品儲備溶液，即得。

2.6.3 測定條件

（1）定量質(zhì)譜條件：定量質(zhì)譜分析于采用ESI正離子模式進行掃描，檢測模式為多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）。離子化參數(shù)為離子噴霧電壓，正離子模式5500 V；TEM 550 ℃，GS1和GS2為氮氣，皆為344.738 kPa（50 psi），CUR 241.316 kPa（35 psi）。化合物離子對優(yōu)化采集參數(shù)：DP、CE和碰撞池出口電壓（cell exit potential，CXP）等信息，如表6所示。

（2）液相條件：按“2.1.3（2）”液相色譜條件進行測定。

表5 當(dāng)歸藥效成分群與體外、體內(nèi)生物活性PLS關(guān)聯(lián)分析

表6 阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A多反應(yīng)檢測參數(shù)

2.6.4 線性關(guān)系考察、檢出限和定量限 精密吸取3種Q-Marker混合對照品儲備溶液，按照優(yōu)化的分析條件進行測定，按“2.1.3（2）”色譜條件進樣，以峰面積為縱坐標(biāo)（），進樣溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。得3種化合物線性范圍為0.176～36.000 μg/mL，且和線性關(guān)系良好。

以陰性樣品為檢測對象，添加不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按照信噪比（/）＞3計算檢出限，按照/＞10計算定量限。本方法檢出限在0.08～0.63 μg/mL，定量限在0.15～1.28 μg/mL。3種Q-Marker的線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限及定量限見表7。

表7 當(dāng)歸3個Q-Marker的線性方程、線性范圍、r、檢出限和定量限

2.6.5 專屬性試驗 按“2.1.3（2）”色譜條件，分別精密吸取空白對照溶液、混合對照品溶液、供試品溶液及空白對照樣品溶液進樣分析，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明3種活性成分之間互不干擾，理論塔板數(shù)以3種成分色譜峰計算均大于8000，符合定量要求，說明各成分專屬性良好。

圖5 混合對照品(A)、當(dāng)歸供試品(B)及陰性對照樣品(C)溶液的UPLC-MS/MS提取離子流圖

2.6.6 精密度試驗 取混合對照品溶液，按“2.1.3（2）”項下色譜條件連續(xù)測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示3個成分的保留時間RSD在0.01%～0.07%，峰面積RSD在0.78%～1.44%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6.7 重復(fù)性試驗 取同一批供試品，按“2.1.4”方法制備6份供試品溶液，精密吸取各供試品溶液，按“2.1.3（2）”色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示3個成分的保留時間RSD在0.07%～0.15%，峰面積RSD在0.19%～1.05%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.6.7”項下供試品溶液適量，分別于室溫放置0、3、6、12、18、24、36、48 h，按“2.1.3（2）”色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示3個成分保留時間RSD在0.86%～1.49%，峰面積RSD在1.16%～1.49%，結(jié)果表明供試品溶液在室溫放置48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6.9 加樣回收率試驗 精密稱取同一批已知含量的當(dāng)歸粉末0.2 g，平行稱取6份，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，以藥材中各成分與對照品含量1∶1比例加入已知質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按“2.1.3（2）”色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。阿魏酸、-藁本內(nèi)酯和歐當(dāng)歸內(nèi)酯A的平均加樣回收率分別為100.25%、99.18%、100.15%，RSD分別為0.32%、0.87%、1.23%。

2.6.10 各批樣品測定 取15批當(dāng)歸藥材樣品，分別制備3份供試品溶液，精密吸取對照品溶液2 μL，供試品溶液2 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計算各批樣品中各成分的含量，結(jié)果見表8。

表8 15批當(dāng)歸藥材中Z-藁本內(nèi)酯、阿魏酸和歐當(dāng)歸內(nèi)酯含量測定結(jié)果(, n = 3)

3 討論

當(dāng)歸具有補血活血的重要功效，其藥效與當(dāng)歸富含的酚酸類、香豆素類和多糖類成分有關(guān)。當(dāng)歸的活血功效主要表現(xiàn)在改善機體心血管能力如提高造血能力、抗血小板聚集、抗炎、抗氧化等方面；而其補血作用主要為能夠緩解過度傷津耗液導(dǎo)致的心血不足，以提高機體抗氧化、抗疲勞能力[27]。因此，本研究將當(dāng)過的體內(nèi)外抗氧化活性作為評價當(dāng)歸功效高低的主要指標(biāo)，建立體外和體內(nèi)抗氧化評價模型，通過構(gòu)建當(dāng)歸-體外/體內(nèi)抗氧化活性-藥效成分群的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，對關(guān)鍵化合物進行評價，找出與質(zhì)量、活性相關(guān)性最大的化合物，從而確定當(dāng)歸質(zhì)控的Q-Marker。

本研究結(jié)果不但可以從藥材源頭實現(xiàn)對當(dāng)歸藥材進行整體質(zhì)量控制，完成當(dāng)歸藥材的優(yōu)選；同時，通對當(dāng)歸的藥效基礎(chǔ)的初步探索和研究，也可以明確與當(dāng)歸藥效緊密的化學(xué)成分來源，為當(dāng)歸藥材質(zhì)量的穩(wěn)定和有效控制提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 劉昌孝, 陳士林, 肖小河, 等. 中藥質(zhì)量標(biāo)志物(Q-Marker): 中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制的新概念[J]. 中草藥, 2016, 47(9): 1443-1457.

[2] 劉昌孝. 中藥質(zhì)量標(biāo)志物(Q-marker)：提高中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量控制理論和促進中藥產(chǎn)業(yè)科學(xué)發(fā)展 [J]. 中草藥, 2019, 50(19): 4517-4518.

[3] 張鐵軍, 白鋼, 陳常青, 等. 基于“五原則”的復(fù)方中藥質(zhì)量標(biāo)志物(Q-marker)研究路徑 [J]. 中草藥, 2018, 49(1): 1-13.

[4] 嚴(yán)輝, 段金廒, 尚爾鑫, 等. 當(dāng)歸不同部位入藥功效取向差異的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)與藥性關(guān)聯(lián)性研究 [J]. 中草藥, 2014, 45(21): 3208-3212.

[5] 嚴(yán)輝, 段金廒, 宋秉生, 等. 我國當(dāng)歸藥材生產(chǎn)現(xiàn)狀與分析 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2009, 11(4): 12-17.

[6] 嚴(yán)輝, 張小波, 朱壽東, 等. 當(dāng)歸藥材生產(chǎn)區(qū)劃研究 [J]. 中國中藥雜志, 2016, 41(17): 3139-3147.

[7] 嚴(yán)輝, 段金廒, 錢大瑋, 等. 我國不同產(chǎn)地當(dāng)歸藥材質(zhì)量的分析與評價 [J]. 中草藥, 2009, 40(12): 1988-1992.

[8] 中國藥典 [S]. 一部. 2020.

[9] Ji Y B, Xu Q S, Hu Y Z,. Development, optimization and validation of a fingerprint ofextracts by high-performance liquid chromatography [J]., 2005, 1066(1/2): 97-104.

[10] Zhou G S, Yang N Y, Tang Y P,. Chemical constituents from the aerial parts ofand their bioactivities [J]., 2012, 10(4): 295-298.

[11] 李麗麗. 基于植物的化學(xué)分類研究當(dāng)歸屬植物的活性成分 [D].長沙:中南大學(xué), 2010.

[12] Ma J P, Guo Z B, Jin L,. Phytochemical progress made in investigations of(Oliv.) Diels [J]., 2015, 13(4): 241-249.

[13] 閆忠紅. 當(dāng)歸屬藥用植物的本草學(xué)、親緣關(guān)系、化學(xué)成分及藥理作用相關(guān)性研究[D].哈爾濱:黑龍江中醫(yī)藥大學(xué), 2003.

[14] 張玉華. 當(dāng)歸和喜樹CMCs體系對香豆素的生物轉(zhuǎn)化初步研究 [D]. 廣州: 廣東藥科大學(xué), 2017.

[15] Tsuchida T, Kobayashi M, Kaneko K,. Studies on the constituents of Umbelliferae plants. XVI. Isolation and structures of three new ligustilide derivatives from[J]., 1987, 35(11): 4460-4464.

[16] Zhang H, Zhou D D, Yang F Q,. Modulation of electroosmotic flow in capillary electrophoresis by plant polyphenol-inspired gallic acid/polyethyleneimine coatings: Analysis of small molecules [J]., 2019, 1124: 7-16.

[17] Tang Y, Zhu M, Yu S,. Identification and comparative quantification of bio-active phthalides in essential oils from Si-Wu-Tang, Fo-Shou-San,and[J]., 2010, 15(1): 341-351.

[18] 林茂, 朱朝德, 孫慶民, 等. 當(dāng)歸化學(xué)成分的研究 [J]. 藥學(xué)學(xué)報, 1979, 14(9): 529-534.

[19] Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules [J]., 2017, 7: 42717.

[20] Ru J, Li P, Wang J,. TCMSP: A database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines [J]., 2014, 6: 13.

[21] Lipinski C A, Lombardo F, Dominy B W,. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings [J]., 2001, 46(1/2/3): 3-26.

[22] Lipinski C A. Lead- and drug-like compounds: The rule-of-five revolution [J]., 2004, 1(4): 337-341.

[23] 李偉霞, 唐于平, 郭建明,等. 當(dāng)歸-川芎藥對及其組成藥味對3種血虛模型補血作用的比較研究 [J]. 中國中藥雜志, 2011, 36(13): 1808-1814.

[24] 陳進成, 劉建勛, 林成仁, 等. 基于“勞則氣耗”理論研究氣虛證動物模型的建立方法 [J]. 中國中藥雜志, 2018, 43(11): 2177-2183.

[25] 李偉霞, 王曉艷, 唐進法, 等. 基于PLS-DA和多指標(biāo)綜合指數(shù)法研究當(dāng)歸-川芎藥對對急性血瘀大鼠血清中血管活性物質(zhì)和黏附分子的影響 [J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2019, 54(11): 1909-1917.

[26] Shi X Q, Tang Y P, Zhu H X,. Pharmacokinetic comparison of seven major bio-active components in normal and blood deficiency rats after oral administration of Danggui Buxue decoction by UPLC-TQ/MS [J].,2014, 153(1): 169-177.

[27] Jin Y, Qu C, Tang Y P,Herb pairs containing(Danggui): A review of bio-active constituents and compatibility effects [J]., 2016, 181(1): 158-171.

Q-Marker screening method fordepending on effective components-bioactivity-efficacy network integration analysis

LIU Yan-ru1, TANG Zhi-shu1, SONG Zhong-xing1, LIU Feng2, DUAN Jin-ao3, CHEN Lin1, SHI Xin-bo1, YANG Ning-juan1, JIANG Da-hai1

1. Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, State Key Laboratory of Research and Development of Characteristic Resources of Qin Medicine, Shaanxi Institute of Traditional Chinese Medicine Industry, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712083, China 2. Shaanxi International Business College, Shaanxi Buchang Pharmaceutical Co., Ltd., Xianyang 712046, China 3. Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization of Jiangsu Province, Jiangsu Key Laboratory for Traditional Chinese Medical Formula Research, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

According to quality markers (Q-Marker) theory, to establish a whole set of quality control methods forDanggui (, ASR) on the basis of effective components-bioactivity-efficacy network correlation analysis and determine Q-marker affecting the quality of ASR.Combined ASR components characterization with principal component analysis (PCA), the differential active components among 15 various habitats materials were directly evaluated, regarding the initially-selected components as the bio-efficacy components for quality control of ASR. Based on correlation analysis principle, the screening and evaluation models of active ingredientsandwere established by digging inter-relationship of components to determine the Q-marker of ASR. Meanwhile, the simultaneous determination methodology for the Q-Marker was established.With UPLC-TOF/MS technique and pharmacokinetic parameter prediction, 11 bio-efficacy components with potential drug effect activity were found. After being analyzed by the bio-efficacy components-bioactivity network integration analysis, ferulic acid,-ligustilide, and levistilide A were chosen as the Q-Marker for quality control of ASR. By using the established quantification method, the linearity coefficients of three Q-Marker were over 0.99. With a highly precision, repeatability and stability results, the average recoveries of three Q-Marker in the samples were ranged from 99.18% to 100.25%.Based on the concept of bio-efficacy components-bioactivity network correlation, UPLC-TOF/MS was used to discriminate the Q-Marker of ASR, in order to preliminarily identify the source of chemical constituents closely related to the efficacy of ASR, which can provide relevant statistics for the overall quality control of ASR.

; quality marker; bio-efficacy components; activity; efficacy; ferulic acid;-ligustilide; levistilide A; associated network; UPLC-TOF/MS

R283.6

A

0253 - 2670(2021)09 - 2626 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.09.014

2021-02-04

國家重大科技專項“重大新藥創(chuàng)制”項目（2019ZX09301-133）；陜西省科技廳重點產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新鏈（群）項目（2020ZDLSF05-08）；陜西省“特支計劃”青年拔尖人才項目（陜組通字【2018】33號）

劉妍如（1985—），女，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為中藥質(zhì)量控制研究。Tel: (029)38182201 Email: yanzi_2203@aliyun.com

唐志書（1972—），教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥制劑制備技術(shù)的研究。Tel: (029)38185060 Email: tzs6565@163.com

段金廒（1956—），教授，博士生導(dǎo)師，中國自然資源學(xué)會中藥及天然藥物資源專業(yè)委員會主任委員，國家“973”計劃首席科學(xué)家。Tel/Fax: (025)85811116 E-mail: dja@njutcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]