吳 磊，劉雅琳，黃 熙

基于生物方劑分析藥理策略的柴胡疏肝散抗抑郁療效質(zhì)量標(biāo)志物研究

吳 磊1, 2，劉雅琳3*，黃 熙2*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029 3. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

在生物方劑分析藥理（bioanalytical pharmacology，BAP）策略的指導(dǎo)下，檢測柴胡疏肝散水提物中具有抗抑郁作用的可吸收生物活性物質(zhì)，為柴胡疏肝散抗抑郁療效的質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）評(píng)價(jià)提供依據(jù)。運(yùn)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測定柴胡疏肝散水提取物中的28種成分；大鼠ig柴胡疏肝散水提取物，定性分析大鼠血漿中的化合物，篩選生物活性物質(zhì)，探索具有抗抑郁作用的Q-Marker。從柴胡疏肝散水提物中的28種成分中確定了吸收入血的22個(gè)成分，篩選出的10個(gè)生物活性物質(zhì)具有與柴胡疏肝散類似的抗抑郁療效。芍藥內(nèi)酯苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、甘草酸、柴胡皂苷A、川陳皮素、橘皮素、甘草次酸為柴胡疏肝散抗抑郁作用的Q-Marker。

柴胡疏肝散；質(zhì)量標(biāo)志物；生物方劑分析藥理策略；抑郁癥；生物活性物質(zhì)

中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）是由劉昌孝院士[1]提出的有利于中藥標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)的創(chuàng)新評(píng)價(jià)模式，是建立中藥全程質(zhì)量控制及質(zhì)量溯源體系的核心要素。中藥質(zhì)量控制是保證中藥及復(fù)方預(yù)期效果和臨床安全性的前提[2-5]，其方法主要包括標(biāo)記化合物測定和指紋圖譜分析。然而，這2種方法未建立被吸收化合物與其生物活性之間的聯(lián)系，不能很好地控制中藥的質(zhì)量。由于沒有吸收性相關(guān)數(shù)據(jù)，標(biāo)記化合物檢測出的與效應(yīng)相關(guān)的成分可能并不準(zhǔn)確[6-10]。此外，目前無法通過指紋圖譜分析來區(qū)分活性成分?！吨袊幍洹?020年版對(duì)中藥質(zhì)量控制的思路是對(duì)1種或者幾種成分進(jìn)行含量控制，其中有些成分往往并不是該中藥的特有成分或活性成分，以此作為中藥材或中藥制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以確保質(zhì)量的可控性和穩(wěn)定性。在十年方劑證治藥動(dòng)學(xué)的研究基礎(chǔ)發(fā)展上，黃熙教授于2009年首次提出了生物方劑分析藥理（bioanalytical pharmacology，BAP）策略[11-12]，認(rèn)為在方劑吸收入體內(nèi)成分的分析指導(dǎo)下進(jìn)行藥理學(xué)研究，比較體內(nèi)吸收成分與母方的整體藥效，揭示代表中藥或復(fù)方藥效的吸收生物活性成分，主要包含以下步驟：血中可吸收的生物活性物質(zhì)（ABCs）的測定、ABCs劑量等于在母方中的含量、ABCs與母方療效的比較。

柴胡疏肝散源自《景岳全書》，為《傷寒論》中四逆散去枳實(shí)，加陳皮、枳殼、川芎、香附而成，是疏肝解郁的代表方，課題組前期已經(jīng)證實(shí)了柴胡疏肝散的抗抑郁作用[13-14]。本研究一方面希望在BAP策略的指導(dǎo)下闡明柴胡疏肝散抗抑郁作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，另一方面希望BAP策略能為中藥質(zhì)量標(biāo)志物的研究提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，7周齡，體質(zhì)量（215±3）g，購自江蘇省南京市青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖基地，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（蘇）2014-0001。動(dòng)物于溫度（20±2）℃、濕度為50%、12 h白天/12 h黑夜的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)201906A012）。

1.2 藥材

柴胡（產(chǎn)地為河北，批號(hào)17071901）、陳皮（產(chǎn)地為湖南，批號(hào)17052506）、川芎（產(chǎn)地為四川，批號(hào)17092606）購自昌都振興中藥飲片實(shí)業(yè)有限公司；枳殼（產(chǎn)地為江西，批號(hào)170801）、香附（產(chǎn)地為湖南，批號(hào)170801）購自湖南新匯制藥股份有限公司；甘草（產(chǎn)地為甘肅，批號(hào)170302）、白芍（產(chǎn)地為安徽，批號(hào)170801）購自長沙市浩昇中藥飲片有限公司。上述藥材經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)黃熙教授鑒定分別為傘形科植物柴胡DC.的干燥根、蕓香科植物橘Blanco的干燥成熟果皮、傘形科植物川芎Hort.的干燥根莖、蕓香科植物酸橙L.的干燥未成熟果實(shí)、莎草科植物莎草L.的干燥根莖、豆科植物甘草Fisch.的干燥根和根莖、毛茛科植物芍藥Pall.的干燥根。

1.3 藥品與試劑

28個(gè)對(duì)照品的詳細(xì)信息見表1；乙腈、甲醇（色譜級(jí)）購自德國Merck公司；氟西?。ㄅ?hào)D1823052）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；5-羥色胺（5-hydroxyptrytamine，5-HT）試劑盒（批號(hào)ANG-E11019R）購自南京奧青生物技術(shù)有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)AB-P-R001）購自杭州賢至生物科技有限公司；腦源性神經(jīng)生長因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗體（批號(hào)256999-1-AP）、IgG二抗（批號(hào)SA00001-2-AP）購自美國Proteintech公司。

1.4 儀器

Xevo G2-XS QTof質(zhì)譜聯(lián)用儀、Acquity UPLC I-Class超高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters公司）；BP-211D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；AR2140型萬分之一天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；Milli-Q GradientA10超純水器（美國Millipore公司）；WH-2微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠）；多功能渦旋混合器（美國Scientific Industeies公司）；5430R冷凍高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；高速冷凍離心濃縮儀（美國Labconco公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 柴胡疏肝散水提物的制備

柴胡、陳皮、枳殼、川芎、白芍、香附、甘草按照4∶4∶3∶3∶3∶3∶1比例配比，稱取組方藥材672 g，加入12倍量水浸泡30 min，武火煮沸，再用文火煎煮30 min，濾過；再加入12倍量水，武火煮沸后用文火煎煮20 min，濾過；合并2次濾液，冷卻至室溫，60 ℃于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，采用冷凍干燥機(jī)凍干至粉末，密封于4 ℃保存，得率為10.08%。

2.2 柴胡疏肝散水提物口服主要吸收成分的測定

2.2.1 給藥及血漿樣品采集 取SD大鼠4只，隨機(jī)分為對(duì)照組和柴胡疏肝散（3 g/kg）組，每組2只。大鼠給藥前禁食12 h，自由飲水。柴胡疏肝散凍干粉溶于純水中，經(jīng)充分渦旋、超聲至溶解，柴胡疏肝散組ig藥物（10 mL/kg），對(duì)照組ig等體積生理鹽水，30 min后大鼠眼眶后靜脈叢取血0.5 mL，置于肝素化離心管中，12 000 r/min離心10 min，取上層血漿，于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 28個(gè)對(duì)照品信息

2.2.2 樣品前處理 取80 μL血漿樣品，加入500 μL甲醇，渦旋混勻5 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液，于45 ℃揮干，殘留物用80 μL 50%乙腈復(fù)溶，渦旋5 min使其充分溶解，4 ℃、20 000 r/min離心10 min，取2 μL上清液注入U(xiǎn)PLC-qTOF-MS系統(tǒng)進(jìn)樣分析。

2.2.3 大鼠血漿中活性成分的測定

（1）色譜條件：BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈，梯度洗脫：0～0.5 min，10% B；0.5～5.0 min，10%～95% B；5.0～7.0 min，95% B；7.0～7.1 min，95%～10% B；7.1～10.0 min，10% B；柱溫為35 ℃；體積流量為0.25 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL。

（2）質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源（ESI）；檢測方式為正離子多重反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）；離子源溫度為120 ℃；脫溶劑氣體為高純度氮?dú)?，溫度?50 ℃，體積流量為800 L/h，毛細(xì)管電壓為1000 V；離子化模式為正離子，錐孔氣體積流量為50 L/h；Q1和Q3質(zhì)量選擇器均設(shè)定在unit分辨率；所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Masslynx質(zhì)譜工作站采集并處理，28個(gè)化學(xué)成分的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)見表2。

（3）對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制：精密稱取對(duì)照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容至刻度，渦旋3 min，40 ℃超聲溶解30 min，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液，其質(zhì)量濃度見表1。

（4）大鼠血漿中各成分的測定結(jié)果：如圖1所示，利用信噪比＞3為標(biāo)準(zhǔn)的定性，確定了大鼠ig柴胡疏肝散水提物后吸收入血的22個(gè)化學(xué)成分。

表2 28個(gè)化學(xué)成分的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)

2.3 柴胡疏肝散中吸收入血成分的含量測定

2.3.1 色譜條件 BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～1.0 min，90% A；1.0～3.5 min，90%～80% A；3.5～5.5 min，80%～74% A；5.5～21.0 min，74%～5% A；21.0～25.0 min，5% A；25.0～25.1 min，5%～90% A；柱溫為35 ℃；體積流量為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 見“2.2.3”項(xiàng)下質(zhì)譜條件。

2.3.3 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密吸取“2.2.3”項(xiàng)下22個(gè)化學(xué)成分的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，搖勻混合，渦旋3 min，并加甲醇定容，得到混合對(duì)照品母液。分別精密吸取1 mL上述混合對(duì)照品母液，以甲醇稀釋成7個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液（HB1～7），見表3。

2.3.4 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 以甲醇分別配制質(zhì)量濃度為11.25、2.50 mg/mL的磺胺甲噁唑和五味子醇甲內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3.5 供試品溶液的制備 精密稱取柴胡疏肝散水提物凍干粉5 mg，以50%甲醇溶解稀釋，并定容至25 mL，超聲30 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過；精密吸取1 mL續(xù)濾液，于40 ℃揮干，殘?jiān)尤?00 μL甲醇復(fù)溶，渦旋混勻5 min，10 ℃、12 000 r/min離心3 min，吸取上清液，得到供試品儲(chǔ)備液；加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，混勻，即得供試品溶液。

2.3.6 方法學(xué)考察

（1）線性關(guān)系與定量限考察：精密吸取“2.3.3”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），各化合物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。結(jié)果表明，各化合物在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，為0.999 0～0.999 5。

（2）精密度試驗(yàn)：取HB2、HB4、HB6混合對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為20 μL，記錄峰面積。各成分色譜峰峰面積的RSD見表4。

（3）重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取柴胡疏肝散水提物凍干粉，平行制備供試品溶液6份，進(jìn)樣測定，并記錄峰面積。各成分色譜峰峰面積的RSD見表4。

1-芍藥內(nèi)酯苷 2-阿魏酸 3-柚皮苷 4-橙皮苷 5-水合橙皮內(nèi)酯 6-甘草酸 7-川陳皮素 8-橘皮素 9-柴胡皂苷A 10-甘草次酸11-蘆丁 12-芍藥苷 13-苯甲酰芍藥苷 14-異甘草素 15-蕓香柚皮苷 16-新橙皮苷 17-槲皮素 18-木犀草素 19-橙皮油素 20-柚皮素 21-橙皮素 22-甘草苷

表3 混合對(duì)照品溶液的配制信息

（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量為20 μL，記錄峰面積。各成分色譜峰峰面積的RSD見表4。

（5）加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取柴胡疏肝散湯劑水提物凍干粉6份，分別加入混合對(duì)照品溶液，混勻，制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。各成分色譜峰峰面積的RSD見表4。

（6）柴胡疏肝散水提物中22個(gè)成分的含量測定：精密稱取柴胡疏肝散水提物凍干粉適量，平行制備3份供試品溶液，進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為2 μL，記錄峰面積，22個(gè)化學(xué)成分的質(zhì)量濃度見表5。

2.4 柴胡疏肝散水提物及其吸收入血成分的抗抑郁作用對(duì)比

2.4.1 分組、造模與給藥 根據(jù)Q-Marker前期研究[14-15]，從以上22個(gè)成分中選擇10個(gè)與抑郁關(guān)系最密切的成分，分別為芍藥內(nèi)酯苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、甘草酸、柴胡皂苷A、川陳皮素、橘皮素、甘草次酸。將以上10個(gè)單體混合后即為代表性吸收成分（10ABCS）組。SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、柴胡疏肝散（3 g/kg）組、10ABCS（劑量等同于柴胡疏肝散水提物中含量）組、氟西?。? mg/kg）組，每組6只。除對(duì)照組外，其余各組大鼠隨機(jī)給予以下刺激：禁水24 h、晝夜光照12 h、禁食24 h、束縛6 h、潮濕的墊料20 h、45°斜籠、搖床（200 r/min）40 min，持續(xù)3周。第3周，各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），1次/d，連續(xù)1周。

2.4.2 強(qiáng)迫游泳測試 將大鼠放入高50 cm、直徑25 cm、水深30 cm、水溫25 ℃的水缸中，記錄4 min內(nèi)小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著降低（＜0.01、0.001）。

表4 方法學(xué)考察結(jié)果

表5 柴胡疏肝散水提物中22個(gè)成分的含量

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

2.4.3 曠場試驗(yàn) 用動(dòng)物軌跡與Topscan行為智能分析系統(tǒng)測量大鼠在50 cm×50 cm×40 cm場地中5 min內(nèi)的自發(fā)活動(dòng)，以小鼠運(yùn)動(dòng)距離為評(píng)價(jià)參數(shù)。結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠運(yùn)動(dòng)距離明顯減少（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠運(yùn)動(dòng)距離顯著增加（＜0.001）。

圖3 柴胡疏肝散水提物對(duì)抑郁大鼠曠場運(yùn)動(dòng)距離的影響()

2.4.4 ELISA法檢測大鼠海馬中5-HT水平 大鼠脫頸椎處死，取海馬組織，按照ELISA試劑盒說明書測定各組大鼠海馬中5-HT水平。結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬中5-TH水平明顯降低（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠海馬中5-HT水平顯著升高（＜0.01、0.001）。

圖4 柴胡疏肝散水提物對(duì)抑郁大鼠海馬中5-HT水平的影響()

2.4.5 Western blotting法檢測大鼠海馬中BDNF蛋白表達(dá)情況 各組大鼠海馬組織加入裂解液，于4 ℃勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入BDNF、GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜，洗滌后加入IgG二抗，室溫孵育1.5 h，洗滌后顯影，計(jì)算條帶灰度值。結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬中BDNF蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠海馬中BDNF蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.001）。

3 討論

目前對(duì)于藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡述，主流思想多仿照化學(xué)藥物“活性導(dǎo)向分離/高通量篩選”的中藥活性成分發(fā)現(xiàn)模式，將中藥整體逐漸分解為單一成分，但中藥療效是通過化學(xué)成分“君臣佐使”的相互協(xié)作得以實(shí)現(xiàn)的，并不是單一的化合物。黃熙教授提出的“BAP策略”是以體內(nèi)血漿或靶器官吸收證據(jù)為前提，在ig劑量等于含量的模式中，比較ABCs與母方療效差異，精準(zhǔn)揭示代表中藥或復(fù)方藥效的生物活性成分。

圖5 柴胡疏肝散水提物對(duì)抑郁大鼠海馬中BDNF蛋白表達(dá)的影響()

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠在曠場實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)動(dòng)距離減少，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間增加，海馬中5-HT水平和BDNF蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，與抑郁癥狀符合，表明造模成功；柴胡疏肝散組和代表性吸收成分組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著降低，曠場實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)動(dòng)距離顯著增加，海馬中5-HT水平和BDNF蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，且代表性吸收成分發(fā)揮了與母方類似療效，表明代表性吸收成分即為柴胡疏肝散發(fā)揮抗抑郁作用的質(zhì)量標(biāo)志物[14-15]，控制10ABCs含量即可保證柴胡疏肝散抗抑郁安全有效。

本研究選擇的10ABCs[16-17]中柴胡皂苷A來自柴胡，柚皮苷、橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、川陳皮素、橘皮素來自枳殼和陳皮，甘草次酸和甘草酸來自甘草，阿魏酸來自川芎，芍藥內(nèi)酯苷來自白芍。10ABCs與母方抗抑郁的療效對(duì)比實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了以上10個(gè)成分可以代表柴胡疏肝散發(fā)揮抗抑郁作用[18]，為柴胡疏肝散治療抑郁的質(zhì)量控制提供了可能性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality markers of Chaihu Shugan Powder anti-depression effect based on bioethnopharmaceutical analytical pharmacology strategy

WU Lei1, 2, LIU Ya-lin3, HUANG Xi2

1. Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, China 2. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, China 3. Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China

To detect the antidepressant absorption active compounds in water extract of Chaihu Shugan Powder, and provide a basis for evaluation of quality marker (Q-Marker) of Chaihu Shugan Powder antidepressant effect under the guidance of bioethnopharmaceutical analytical pharmacology (BAP) strategy.LC-MS/MS was used to determine the 28 compounds in water extract of Chaihu Shugan Powder. Rats were ig given Chaihu Shugan Powder, compounds in rat plasma were analyzed and biological activity substances were screened to explore Q-Marker with antidepressant effects.Among 28 components in water extract of Chaihu Shugan Powder, 22 components were determined to be absorbed into blood. A total of 10 biological activity substances had antidepressant effects similar to Chaihu Shugan Powder.Paeoniflorin, ferulic acid, naringin, hesperidin, hydrated hesperidin, glycyrrhizic acid, saikosaponin A, lichenpin, hesperetin, and glycyrrhetinic acid are Q-Markers for antidepressant effect of Chaihu Shugan Powder.

Chaihu Shugan Powder; quality marker; bioanalytical pharmacology strategy; depression; biologically active substance

R285.5

A

0253 - 2670(2021)09 - 2617 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.09.013

2021-02-19

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81573797）

吳 磊（1983—），男，副主任中藥師，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿╅_發(fā)。E-mail: xiaoleiyaoshi @163.com

黃 熙，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)橐钟粝嚓P(guān)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: tcmhuangx59@163.com

劉雅琳，博士，研究方向?yàn)橐钟粝嚓P(guān)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: liuyalin_1984@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]