崔晶晶，朱曉煊，黃展鵬，趙 琰

(河北科技師范學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，河北 秦皇島，066600)

蘆筍(Asparagus)口感爽滑[1]，且含有豐富的礦物質(zhì)、氨基酸[2]、多糖[3]、甾體皂苷類[4]以及黃酮類等營養(yǎng)成分，近年來在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域受到較大關(guān)注。例如：朱興磊等[5]以類似1型糖尿病的大鼠為研究對(duì)象，通過注射蘆筍老莖皂苷來研究其對(duì)血糖的影響，結(jié)果表明該皂苷能夠有效降低大鼠餐后血糖；何云山等[6]通過對(duì)比蘆筍與降脂理肝湯對(duì)高脂飲食小鼠腸道消化產(chǎn)生的影響，其結(jié)果顯示蘆筍汁的攝入能夠顯著降低腸道酶的活性。隨著蘆筍中越來越多的營養(yǎng)成分的發(fā)現(xiàn)，科研工作者們對(duì)于蘆筍提取的研究也取得了一定進(jìn)展。崔守富等[7]通過超聲波-微波法從綠蘆筍莖中提取多糖，其中粗多糖提純率為4.23%；孟曉萌等[8]采用微波超聲協(xié)同萃取方法成功提取蘆筍廢棄物中的黃酮類物質(zhì)，結(jié)果表明，其提取率可達(dá)0.4%。綜上，雖然目前提純分離方法有很多種，但由于天然產(chǎn)物成分的復(fù)雜性，通過傳統(tǒng)超聲萃取的方法，已經(jīng)很難制備出純度較高的有效成分。因此探討蘆筍的高效分離方法變得尤為重要。

目前，結(jié)晶是常用的低能耗和高效的分離提純方法，由于其三維周期性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在成核及生長過程中，雜質(zhì)分子一般較難嵌入到晶格結(jié)構(gòu)當(dāng)中，因此產(chǎn)物多具有高純度的特點(diǎn)，常應(yīng)用在藥品、精細(xì)化工、食品添加劑和化肥等各個(gè)化工領(lǐng)域[9～12]。陸貽超等[13]采用重結(jié)晶法對(duì)2,5-呋喃二甲酸進(jìn)行提純，通過調(diào)整不同比例的溶劑組成，培養(yǎng)相應(yīng)單晶并解析其結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明采用N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺混合溶劑可使其純度提升為99.98%；李改真等[14]采用熔融結(jié)晶法對(duì)通過化學(xué)反應(yīng)而制得的對(duì)苯二甲酰氯進(jìn)行提純，其產(chǎn)物純度高達(dá)99.9%以上。綜上可知，結(jié)晶技術(shù)對(duì)于分離復(fù)雜的有機(jī)混合物，制取高純度的化合物具有重大作用。為此，筆者擬采用結(jié)晶法對(duì)蘆筍原液進(jìn)行初分離。首先將蘆筍原液經(jīng)過脫蛋白、醇沉、抽濾、再取濾渣經(jīng)真空冷凍干燥得到高純度蘆筍多糖粉末，并在不同溶劑中配置成飽和溶液。然后采用單晶培養(yǎng)法培養(yǎng)出單晶晶體，并使用PXRD，SXRD和SEM對(duì)其進(jìn)行表征，最后根據(jù)其空間結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行晶習(xí)模擬。

1 試驗(yàn)部分

1.1 藥品與儀器

試驗(yàn)中使用的藥品及儀器詳情見表1和表2。

表1 從蘆筍原液中提取蘋果酸單晶的試驗(yàn)用藥品

表2 從蘆筍原液中提取蘋果酸單晶的試驗(yàn)用儀器

表3 從蘆筍原液中提取蘋果酸單晶的試驗(yàn)條件

1.2 試驗(yàn)方法

本次實(shí)驗(yàn)采用溶劑揮發(fā)法和冷卻法進(jìn)行單晶培養(yǎng)。首先將蘆筍原液預(yù)處理，獲得的蘆筍粗產(chǎn)品的多糖保留率為56%[15]。然后稱取過量的蘆筍多糖粉末，分別與不同溶劑進(jìn)行混合(表3)，溫度控制在25～30 ℃，持續(xù)攪拌2～3 h，直至其達(dá)到平衡。之后取上層飽和清液，放置于樣品瓶中，一部分緩慢降溫至室溫后恒溫培養(yǎng)1～15 d，使其自發(fā)成核結(jié)晶，另一部分迅速移至4 ℃冰箱冷藏降溫培養(yǎng)1～15 d，使其冷卻結(jié)晶。每天進(jìn)行1次觀察，直至樣品瓶底部有晶體出現(xiàn)，并對(duì)其進(jìn)行單晶衍射分析和晶體結(jié)構(gòu)解析。

1.3 表征方法

1.3.1PXRD分析采用日本理學(xué)D/Max-2500pc型X-射線衍射儀對(duì)樣品進(jìn)行物相分析，以CuKα靶輻射為光源，管壓為40 KV，管流為200 mA，波長0.154 056 nm，2θ掃描范圍為10°～80°，掃描速度為8°/min，掃描步長為0.02°。

1.3.2SEM分析采用日立SU8010對(duì)晶體進(jìn)行形貌分析，其操作電壓為15 kV和1 kV，并在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下間歇噴金。

1.3.3SXRD分析采用日本理學(xué)株式會(huì)社的X射線全面探測(cè)衍射儀Rapid-Rigaku II對(duì)樣品進(jìn)行衍射分析，以MoKα靶射線進(jìn)行掃描，掃描波長為7.103×10-8m，利用Rapid auto (Rigaku, 2004)收集衍射數(shù)據(jù)，并通過SHELXS-97和SHELXL-97程序進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析和修正。

2 結(jié)果與討論

2.1 單晶培養(yǎng)結(jié)果

通過觀察記錄1～15號(hào)樣品保留1～15 d后發(fā)現(xiàn)，在以丙酮，氯仿，乙醇，丙酮-水(乙醇、氯仿)體系，氯仿-水體系，乙醇-氯仿體系為溶劑配制的飽和溶液中，由于溶液揮發(fā)過于迅速而且多糖溶解量較少等原因，未發(fā)現(xiàn)有晶體存在現(xiàn)象；在以乙醇-水體系為溶劑配制的混合溶液中，通過冷卻法出現(xiàn)少量細(xì)小晶體，而采用緩慢揮發(fā)法卻未出現(xiàn)明顯晶體(表3)。未產(chǎn)生單晶是由于多糖本身為混合物，其結(jié)晶反應(yīng)與聚合物結(jié)晶類似，所以多糖分子未能通過分子有序運(yùn)動(dòng)達(dá)到大量出晶的條件；在純水配制的飽和溶液中，經(jīng)過冷卻結(jié)晶后出現(xiàn)了形狀規(guī)則，大小適中的大顆粒晶體，但由于多糖粉末中含有較多雜質(zhì)，因此無法判斷該單晶的分子式，需通過后續(xù)檢測(cè)與表征才能進(jìn)一步確認(rèn)其分子結(jié)構(gòu)及晶體結(jié)構(gòu)。

2.1 PXRD結(jié)果與分析

首先對(duì)多糖原料及所獲單晶進(jìn)行衍射分析，結(jié)果表明，該衍射峰中存在生長較好的晶體，其衍射峰較為明顯(圖1)。除此之外，圖中的衍射基準(zhǔn)線略有上升，因此可預(yù)測(cè)經(jīng)過脫蛋白處理后的多糖粉末當(dāng)中同時(shí)存在無定型粉末與晶體產(chǎn)品。為進(jìn)一步確定該晶體產(chǎn)品的成分及其晶體結(jié)構(gòu)，采用單晶培養(yǎng)的方法對(duì)該晶體進(jìn)行成分及結(jié)構(gòu)分析。單晶晶體的粉末衍射結(jié)果見圖2：其中(a)～(c)分別代表溶劑為純水，乙醇與水體積比為1∶1和1∶2。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，從水溶液(圖2 (a))和乙醇水混合溶液(圖2 (b)和圖2 (c))中所得晶體的衍射峰位置和衍射峰強(qiáng)度基本一致，即它們的晶體結(jié)構(gòu)相同，為同一種物質(zhì)。但粉末衍射圖譜推導(dǎo)晶體結(jié)構(gòu)存在一定的局限性，其無法準(zhǔn)確判斷該晶體的空間構(gòu)型及分子排布，因此需進(jìn)一步分析其晶習(xí)晶型。

圖1 蘆筍多糖粉末的X-射線粉末衍射圖

圖2 單晶的X-射線粉末衍射圖：a-水, b-V(乙醇)∶V(水) =1∶1, c-V(乙醇)∶V(水) =1∶2

2.2 SEM形貌研究

圖3(a)為單晶的SEM圖，圖3(b)為單晶的局部放大圖。SEM結(jié)果表明，該單晶為塊狀結(jié)構(gòu)，長徑比相對(duì)較大，晶面完整且各晶面相對(duì)平整；局部放大圖顯示，晶面存在部分缺陷，但未發(fā)現(xiàn)明顯的晶體錯(cuò)位生長現(xiàn)象[16](圖3(b))。

圖3 待測(cè)晶體的SEM圖: (a)為單晶圖片, (b)為單晶的局部放大圖

2.3 單晶結(jié)構(gòu)解析

通過分析SXRD所測(cè)定的單晶數(shù)據(jù)，并利用SHELXS-97和SHELXL-97程序進(jìn)行該單晶晶胞結(jié)構(gòu)解析及修正(表4)。結(jié)果表明，該物質(zhì)的分子式是C4H8O6，為L-蘋果酸一水合物，屬于正交晶系，P212121空間群，相對(duì)分子量為152.10。其詳細(xì)晶胞參數(shù)為：a=0.558 13 (11)nm，b=0.981 9 (2)nm，c=1.179 4 (2)nm，α=90°，β=90°，γ=90°，晶胞體積V=0.646 3 (2) nm3，晶胞內(nèi)分子數(shù)Z=4，即每個(gè)晶胞當(dāng)中含有4個(gè)蘋果酸一水合物分子(圖4(b))。其中，2號(hào)位碳為手性碳，因此該晶體屬于由左旋蘋果酸分子結(jié)合形成的空間群(圖4(a))。

表4 單晶的晶體學(xué)數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)精修結(jié)果

依據(jù)單晶解析結(jié)果，可以獲得該單晶內(nèi)部的分子連接形式(圖5)。單晶解析結(jié)果表明，蘋果酸一水合物單晶中的分子間通過O6—H6A…O1形成的氫鍵連接在一起或者通過弱H-H作用力(H1…H6A)和弱的相互作用力連接在一起(圖5(a))；另一個(gè)水分子與蘋果酸分子通過氫鍵O6—H6B…O3或者通過水分子中的氫鍵和弱H—H作用力(H3…H6B)連接成片(圖5(b))。片與片之間通過蘋果酸分子間氫鍵O5—H5…O2或者水和1個(gè)蘋果酸分子通過(O3—H3…H6B)連接在一起(圖5(c)，圖5(d))。蘋果酸分子同時(shí)作為溶劑分子的氫的供體和氫的受體，由此可見，在晶體結(jié)構(gòu)形成過程中蘋果酸分子和水分子都發(fā)揮著重要的作用。

圖4 蘋果酸的分子結(jié)構(gòu)圖(a)和晶胞結(jié)構(gòu)圖(b)

圖5 蘋果酸單晶的晶體結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)中的氫鍵

圖6 利用MS軟件模擬的單晶的晶體結(jié)構(gòu)(a) BFDH模型, (b) AE模型

2.4 晶習(xí)預(yù)測(cè)

利用Materials Studio(MS)軟件中的Morphology模塊當(dāng)中的AE模型和BFDH模型模擬晶體形貌，并與SEM圖進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，通過BFDH模型模擬得到的晶習(xí)的晶面較多，與實(shí)際晶體形貌差異較大，其原因可歸結(jié)于BFDH模型忽略了分子間作用力和外部環(huán)境對(duì)于晶習(xí)的影響(圖6)。而AE模型充分考慮了晶體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)單元以及其相互作用對(duì)晶習(xí)的影響，因此所獲得的結(jié)果與晶體SEM圖較為接近，其微小差異來源于未考慮溶劑分子對(duì)于晶習(xí)所產(chǎn)生的的影響。綜上，AE模型可以較好的預(yù)測(cè)L-蘋果酸—水合物的晶體形貌。

3 結(jié) 論

本次研究采用結(jié)晶技術(shù)和單晶培養(yǎng)方法從蘆筍原液中提取單晶并對(duì)其進(jìn)行表征，得出以下結(jié)論：

(1)通過單晶培養(yǎng)法成功地從水及乙醇-水混合溶劑中獲得單晶，并經(jīng)XRD證實(shí)所有單晶具有相同的衍射峰，為同一種物質(zhì)；經(jīng)SEM分析確定該晶體呈塊狀結(jié)構(gòu)，晶面完整，無錯(cuò)位生長現(xiàn)象。

(2)通過對(duì)該晶體進(jìn)行單晶解析，確定其分子式為C4H8O6，為蘋果酸一水合物，屬于正交晶系，P212121空間群。該單晶的晶胞參數(shù)為：a=0.558 13(11) nm，b=0.981 9(2) nm，c=1.179 4(2) nm，α=90°，β=90°，γ=90°。每個(gè)晶胞中含有4個(gè)蘋果酸分子和4個(gè)水分子，分子之間通過氫鍵、弱H—H作用力和弱的相互作用力連接成片，片與片之間主要通過分子間氫鍵進(jìn)行連接。因此，氫鍵在晶體結(jié)構(gòu)形成的過程中發(fā)揮著重要的作用。

(3)通過AE模型和BFDH模型對(duì)晶習(xí)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，AE模型模擬的結(jié)果與掃描電鏡的結(jié)果吻合的較好。

本次試驗(yàn)成功地從蘆筍原液中提取出L-蘋果酸單晶，其純度為100%。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，結(jié)晶方法在提純高純天然產(chǎn)物活性分子方面的具有應(yīng)用價(jià)值。