秦坤　金翔鳳　衣騰飛　李爍　孫昭赟　劉玉洪

[摘要]目的探討葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤細(xì)胞（FR+-CTCs）聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物外周血癌胚抗原（CEA）、細(xì)胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）檢測在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）診斷中的價值。方法對146例NSCLC病人（肺癌組）、25例肺良性疾病病人（肺良性疾病組）和20例健康體檢者（健康對照組）的CEA、CYFRA21-1和FR+-CTCs檢測結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，利用受試者工作特征（ROC）曲線分析各指標(biāo)診斷價值。結(jié)果肺癌組FR+-CTCs陽性率（75.3%）較健康對照組（5.0%）和肺良性病變組（8.0%）明顯升高（χ2=11.412，P<0.01）。腫瘤直徑和腫瘤分期是影響NSCLC病人FR+-CTCs表達(dá)的主要因素（Z=2.354，P<0.01;H=9.924，P<0.01），與病人的年齡、性別、有無吸煙史無關(guān)（P>0.05）。NSCLC組CEA、CYFRA21-1及FR+-CTCs聯(lián)合檢測的曲線下面積（AUC）為0.778（95%CI=0.720～0.816），診斷靈敏度為77.50%，特異度為78.08%，與CYFRA21-1、CEA聯(lián)合檢測（AUC=0.707，95%CI=0.660～0.756，診斷靈敏度為66.53%，特異度為71.95%）相比有更高的診斷價值。結(jié)論FR+-CTCs聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物CEA、CYFRA21-1檢測可提高NSCLC診斷的靈敏度及特異度。

[關(guān)鍵詞]腫瘤細(xì)胞，循環(huán);癌，非小細(xì)胞肺;癌胚抗原;角蛋白19

[中圖分類號]R734.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號]2096-5532（2021）01-0073-04

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the value of folate receptor-positive circulating tumor cells （FR+-CTCs） combined with the tumor markers carcinoembryonic antigen （CEA） and cytokeratin 19 fragment （CYFRA21-1） in the diagnosis of non-small lung-cancer （NSCLC）. MethodsA retrospective analysis was performed for the results of CEA， CYFRA21-1， and FR+-CTCs of 146 patients with NSCLC （NSCLC group）， 25 patients with benign lung diseases （benign lung disease group）， and 20 individuals who underwent physical examination （healthy control group）， and the receiver operating characteristic （ROC） curve was used to investigate the diagnostic value of each index. ResultsThe NSCLC group had a significantly higher positive rate of FR+-CTCs than the healthy control group and the benign lung disease group （75.3% vs 5.0%/8.0%， χ2=11.412，P<0.01）. Tumor diameter and tumor stage were the main factors affecting the expression of FR+-CTCs in the patients with NSCLC （Z=2.354，P<0.01;H=9.924，P<0.01）， which was not associated with age， sex， and smoking history （P>0.05）. In the NSCLC group， the combined measurement of CEA， CYFRA21-1， and FR+-CTCs had an area under the ROC curve （AUC） of 0.778 （95%CI=0.720-0.816）， a diagnostic sensitivity of 77.50%， and a specificity of 78.08%， while the combined measurement of CEA and CYFRA21-1 had an AUC of 0.707 （95%CI=0.660-0.756）， a diagnostic sensitivity of 66.53%， and a specificity of 71.95%， suggesting that the combined measurement of CEA， CYFRA21-1， and FR+-CTCs had a higher diagnostic value than the combined measurement of CEA and CYFRA21-1. ConclusionFR+-CTCs combined with the tumor markers CEA and CYFRA21-1 can improve the sensitivity and specificity of the diagnosis of NSCLC.

[KEY WORDS]neoplastic cells， circulating; carcinoma， non-small-cell lung; carcinoembryonic antigen; keratin-19

據(jù)統(tǒng)計，肺癌是所有癌癥類型中發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤[1]，其中占比最高的是非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）。有研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ期肺癌病人接受手術(shù)治療5年生存率為58%～73%，遠(yuǎn)高于肺癌總體5年生存率15%[2]。對肺癌高危人群進(jìn)行低劑量螺旋CT（LD-CT）篩查，對高度懷疑肺癌的病人進(jìn)行手術(shù)治療，術(shù)后組織病理學(xué)檢查顯示有21.4%為良性病變[3]。組織病理學(xué)和細(xì)胞病理學(xué)為肺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，雖然其準(zhǔn)確度高，但因?yàn)槠鋭?chuàng)傷性和花費(fèi)巨大，不適合作為門診篩查的常規(guī)手段。血清腫瘤標(biāo)志物可用于肺癌病人的診斷和預(yù)后監(jiān)測[4]，但不同腫瘤標(biāo)志物在不同病理類型肺癌病人中表達(dá)的靈敏度和特異度不同[5]，且在早期肺癌病人中呈低表達(dá)，因此在早期肺癌的診斷中陽性率低。已有研究結(jié)果表明，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）在肺癌的診斷中具有較高的靈敏度[6]，在肺癌早期就可檢測到，但特異度較低。本文探討葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤細(xì)胞（FR+-CTCs）聯(lián)合癌胚抗原 （CEA）、細(xì)胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）在早期NSCLC診斷中的作用。

1資料和方法

1.1一般資料

收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科2018年6月15日—2019年8月15日收治肺癌病人146例（肺癌組，C組）、肺良性疾病病人25例（肺良性病變組，B組）的臨床資料，肺癌組146例均為NSCLC;肺良性病變組病人中肺炎11例，肺結(jié)核7例，支氣管擴(kuò)張2例，錯構(gòu)瘤5例。肺癌、肺良性疾病病人術(shù)前經(jīng)胸部CT檢查證實(shí)肺部結(jié)節(jié)，術(shù)后經(jīng)組織病理學(xué)或者細(xì)胞病理學(xué)檢查確診。按照國際肺癌研究協(xié)會第8版TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行臨床疾病分期。排除標(biāo)準(zhǔn)：①重要臟器功能嚴(yán)重不全病人;②合并其他臟器惡性腫瘤病人;③合并嚴(yán)重感染性疾病病人;④合并造血系統(tǒng)疾病者;⑤精神異常、依從性較差者;⑥臨床資料不完善者。選取同期健康體檢者20例為健康對照組（A組），均接受了低劑量螺旋CT掃描，以排除潛在的胸部疾病。本文研究獲得青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均知情同意。

1.2FR+-CTCs及腫瘤標(biāo)志物的檢測

采集受檢者肘靜脈血3 mL，應(yīng)用配體靶向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LT-PCR）方法檢測FR+-CTCs，在3 mL血液中檢測到1個葉酸受體（FR）陽性細(xì)胞定義1個葉酸單位（FU）[7]，以FR+-CTCs≥8.70 FU作為FR+-CTCs陽性標(biāo)準(zhǔn)。采集肘靜脈血5 mL，以2 500 r/min離心10 min，使用羅氏免疫學(xué)分析儀（德國）檢測CEA及CYFRA21-1，CEA>3.4 μg/L定義為陽性，CYFRA21-1>3.3 μg/L定義為陽性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。非正態(tài)分布計量資料以M（P25，P75）形式表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。應(yīng)用GraphPad Prism 8軟件繪制受試者工作曲線（ROC曲線），計算曲線下面積（AUC）。應(yīng)用Logistic回歸分析比較聯(lián)合腫瘤標(biāo)記物檢測和單獨(dú)腫瘤標(biāo)記物檢測的靈敏度和特異度。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組 FR+-CTCs及腫瘤標(biāo)志物表達(dá)比較

肺癌組FR+-CTCs陽性病人占比高于肺良性病變組及健康對照組（χ2=11.412，P<0.01）;肺癌組CEA和CYFRA21-1陽性率與肺良性病變組及健康對照組比較差異無顯著性（P>0.05）。隨著肺癌分期的進(jìn)展，F(xiàn)R+-CTCs、CEA和CYFRA21-1表達(dá)明顯升高，差異有顯著性（χ2=11.345～13.632，P<0.01）。見表1～2。

2.2肺癌病人FR+-CTCs影響因素

不同年齡、性別以及有無吸煙史肺癌病人的FR+-CTCs檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;而最大腫瘤直徑<3 cm與≥3 cm、不同TNM分期肺癌病人FR+-CTCs檢測結(jié)果比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=2.354，P<0.01;H=9.924，P<0.01）。見表3。

2.3CEA、CYFRA21-1及FR+-CTCs單獨(dú)檢測及聯(lián)合檢測對NSCLC的診斷價值

Logistic回歸及ROC曲線分析顯示，血清腫瘤標(biāo)志物CEA和CYFRA21-1聯(lián)合檢測診斷NSCLC的AUC=0.707（95%CI=0.660～0.756），診斷靈敏度為66.53%，特異度為71.95%，均低于FR+-CTCs、CEA、CYFRA21-1聯(lián)合檢測組（AUC=0.778，95%CI=0.720～0.816，診斷靈敏度為77.50%，特異度為78.08%），但AUC值和診斷靈敏度及特異度均高于FR+-CTCs、CEA、CYFRA21-1單獨(dú)檢測。見圖1、表4。

3討論

ASHWORTH教授在19世紀(jì)60年代提出了CTCs概念[8]，CTCs常見于惡性腫瘤病人的血液中，在良性疾病病人和健康者的血液中較少表達(dá)或者不表達(dá)[9]。細(xì)胞搜索（Cell Search）系統(tǒng)是第一個也是唯一一個獲得美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)，用于除肺癌以外的乳癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌的CTCs檢測，但其應(yīng)用于NSCLC病人檢測陰性比例升高[10-11]，需要改進(jìn)檢測方法來提高檢測的準(zhǔn)確度和靈敏度。

近年來，出現(xiàn)了一種新的檢測方法，即FR+-CTCs方法。葉酸是人體必需的維生素，但人自身不能合成，需要由外界攝取。葉酸通過與細(xì)胞表面葉酸受體（FR）結(jié)合后被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，在正常人的血液中，除FR活化的巨噬細(xì)胞外幾乎檢測不到FR的表達(dá)[12]。相反，F(xiàn)R在各種腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)，NSCLC病人FR在CTCs表面的表達(dá)也明顯升高[13-14]。在NSCLC病人中有72%～83%檢測到FR陽性[15]。采用新型的LT-PCR方法檢測FR+-CTCs在NSCLC病人中表達(dá)具有良好的臨床應(yīng)用價值。

腫瘤標(biāo)志物是由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生、正常細(xì)胞缺乏或含量極微的抗原性物質(zhì)，可以用于臨床腫瘤篩查、預(yù)后監(jiān)測及治療效果監(jiān)測等。CEA和CYFRA21-1是最早應(yīng)用于NSCLC檢測的腫瘤標(biāo)志物[16-17]，常被用來輔助診斷NSCLC病人，但其靈敏度較低，僅為20%～70%[18-19]。與CEA和CYFRA21-1相比，基于LT-PCR方法檢測到的FR+-CTCs水平在診斷NSCLC時顯示出較高的靈敏度[20-21]，但特異度較低。因此，F(xiàn)R+-CTCs水平可以作為NSCLC有效的輔助診斷指標(biāo)。

本文研究探討FR+-CTCs聯(lián)合腫瘤標(biāo)記物檢測對NSCLC診斷的靈敏度和特異度。研究結(jié)果顯示，F(xiàn)R+-CTCs對NSCLC病人診斷的靈敏度和特異度均高于血清腫瘤標(biāo)志物CEA、CYFRA21-1，且FR+-CTCs聯(lián)合CEA、CYFRA21-1對NSCLC診斷的靈敏度和特異度高于CEA與CYFRA21-1聯(lián)合診斷及FR+-CTCs檢測單獨(dú)診斷。WANG等[19]的一項(xiàng)研究納入197例肺癌病人、119例肺良性疾病病人以及52例健康對照組，應(yīng)用ROC曲線對診斷的特異度以及靈敏度進(jìn)行分析，其研究結(jié)果顯示AUCCEA+CYFRA21-1+NSE（0.649 5）

綜上所述，F(xiàn)R+-CTCs聯(lián)合CEA、CYFRA21-1檢測對NSCLC診斷的特異度和靈敏度較單純FR+-CTCs檢測或CEA、CYFRA21-1聯(lián)合檢測均有明顯提高。但由于本次納入研究的肺癌病人絕大多數(shù)屬于早期肺癌，導(dǎo)致本文聯(lián)合檢測的靈敏度和特異度較低。FR+-CTCs與CEA、CYFRA21-1聯(lián)合檢測在NSCLC病人的早期診斷中的作用需要進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）