洪琳鳳 李樺 郭晴虹 肖鴿飛 金豐梅 尹保民 張超敏 嚴(yán)津晶 蔡鵬飛 李兆生

【摘要】 目的：分析細(xì)胞周期激酶抑制因子4基因座中反義非編碼RNA（ANRIL）表達(dá)水平與妊娠期糖尿病（GDM）的相關(guān)性。方法：選擇2019年7月-2020年6月于本院產(chǎn)科進(jìn)行產(chǎn)檢并分娩的妊娠期婦女122例，根據(jù)孕24～28周口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）結(jié)果是否異常將其分為OGTT異常組（n=61）和OGTT正常組（n=61）。比較兩組血清激素[雌二醇（E2）、孕酮（P）]水平以及l(fā)ncRNA ANRIL表達(dá)水平，分析lncRNA ANRIL表達(dá)水平與GDM患者激素水平的相關(guān)性。結(jié)果：兩組孕期體重增加、FPG、餐后1 h血糖、餐后2 h血糖比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。OGTT異常組血清E2、P水平均顯著高于OGTT正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。OGTT異常組血清lncRNA ANRIL mRNA表達(dá)水平顯著高于OGTT正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Pearson相關(guān)分析顯示，血清lncRNA ANRIL mRNA表達(dá)與GDM患者E2、P水平均呈明顯正相關(guān)（P<0.05）。logistic回歸模型分析結(jié)果顯示，lncRNA ANRIL是影響GDM發(fā)生的危險(xiǎn)因素（P<0.001）。結(jié)論：GDM患者lncRNA ANRIL表達(dá)水平顯著升高，并與激素水平呈顯著正相關(guān)，lncRNA ANRIL表達(dá)升高可能是機(jī)體抵抗胰島功能的影響因素。

【關(guān)鍵詞】 妊娠期糖尿病 細(xì)胞周期激酶抑制因子4基因座中反義非編碼RNA 雌二醇 孕酮 相關(guān)性

Correlation between ANRIL expression level and gestational diabetes mellitus/HONG Linfeng， LI Hua， GUO Qinghong， XIAO Gefei， JIN Fengmei， YIN Baomin， ZHANG Chaomin， YAN Jinjing， CAI Pengfei， LI Zhaosheng. //Medical Innovation of China， 2021， 18（05）： -146

[Abstract] Objective： To analyze the correlation between expression level of antisense non-coding RNA in the INK4 locus （ANRIL） and gestational diabetes mellitus （GDM）. Method： A total of 122 pregnant women who underwent obstetric examination and delivery in our hospital from July 2019 to June 2020 were selected. According to the abnormal results of oral glucose tolerance test （OGTT） at 24 to 28 weeks of pregnancy， they were divided into abnormal OGTT group （n=61） and normal OGTT group （n=61）. The levels of serum hormones [estradiol （E2）， progesterone （P）]and expression level of lncRNA ANRIL were compared between the two groups. The correlation between expression level of lncRNA-ANRIL and hormones levels were analyzed among GDM patients. Result： There were statistically significant differences in weight gain， FPG， 1 h postprandial blood glucose and 2 h postprandial blood glucose during pregnancy （P<0.05）. Serum E2 and P levels in the abnormal OGTT group were significantly higher than those in the normal OGTT group， with statistical significance （P<0.05）. The expression level of lncRNA ANRIL mRNA in serum of OGTT abnormal group was significantly higher than that of OGTT normal group， with statistical significance （P<0.05）. Pearson correlation analysis showed that serum lncRNA ANRIL mRNA expression was significantly positively correlated with E2 and P levels in GDM patients （P<0.05）. Logistic regression model showed that lncRNA ANRIL was a risk factor for the occurrence of GDM （P<0.001）. Conclusion： The expression level of lncRNA ANRIL in patients with GDM is significantly increased， and is significantly positively correlated with the levels of hormones. The increase of lncRNA ANRIL expression may be an influencing factor for the bodys islet resistance function.

[Key words] Gestational diabetes mellitus Antisense non-coding RNA in the INK4 locus Estradiol Progesterone Correlation

First-authors address： Zhuhai Maternal and Child Health Care Hospital， Zhuhai 519000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.05.036

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus， GDM）是高危妊娠的重要原因之一[1]。早診斷、早治療對改善妊娠期糖尿病患者臨床結(jié)局有著極其重要的意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA， lncRNA）是指一類無開放閱讀框的含有200個核苷酸的RNA，lncRNA參與了包括糖尿病在內(nèi)的各種疾病的病理過程[2]。細(xì)胞周期激酶抑制因子4基因座中反義非編碼RNA（antisense non-coding RNA in the INK4 locus， ANRIL）又被稱為lncRNA ANRIL，是最早發(fā)現(xiàn)的lncRNA之一[3]。全基因組關(guān)聯(lián)研究表明，lncRNA ANRIL是2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus， T2DM）的遺傳易感位點(diǎn)[4]，染色體9p21區(qū)域糖尿病相關(guān)危險(xiǎn)變異子與ANRIL表達(dá)的下調(diào)相關(guān)。目前研究認(rèn)為，lncRNA ANRIL可能是通過調(diào)節(jié)INK4b-ARF-INK4a基因[5-6]，并通過多種機(jī)制參與2型糖尿病的發(fā)病過程。但其是否與GDM發(fā)病有關(guān)，目前未見相關(guān)報(bào)道。據(jù)此，本文通過研究ANRIL表達(dá)水平與妊娠期糖尿病的相關(guān)性，旨在為妊娠期糖尿病的早診斷、早治療提供新的參考根據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年7月-2020年6月于本院產(chǎn)科進(jìn)行產(chǎn)檢并分娩的妊娠期婦女122例，年齡22～42歲，年齡（31.35±4.32）歲。根據(jù)孕24～28周口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）結(jié)果是否異常將其分為OGTT異常組（n=61）和OGTT正常組（n=61）。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①OGTT異常組符合妊娠期糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];②均為單胎妊娠;③孕前均無糖尿病史。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并妊娠期高血壓;②其他內(nèi)分泌疾病或激素相關(guān)疾病;③存在其他可能影響血糖水平的基礎(chǔ)疾病;④唐氏篩查及三維超聲提示胎兒異常;⑤近期服用對血糖水平造成影響的藥物。患者及其家屬知情同意，并簽署知情同意書。本次研究得到珠海市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 入選對象在第1次產(chǎn)前檢查時（孕11～13+6周），于空腹?fàn)顟B(tài)下測量血壓、身高、體重、孕次、產(chǎn)次，同時檢測其糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c， HbA1c）、空腹血糖（fasting plasma glucose， FPG），結(jié)果均正常，排除糖尿病合并妊娠。至孕24～28周進(jìn)行OGTT及血清激素[雌二醇（estradiol， E2）、孕酮（progesterone， P）]檢測，并檢測外周血lncRNA ANRIL基因表達(dá)。

1.2.2 血清生化指標(biāo)檢測 孕24～28周，入選對象均于禁食12 h后，募集晨起空腹靜脈血4 mL，4 ℃靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，留上清，采用化學(xué)發(fā)光法檢測兩組E2、P水平。

1.2.3 血清lncRNA ANRIL表達(dá)檢測 采用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction， qRT-PCR）檢測孕婦血清lncRNA ANRIL相對表達(dá)量，具體步驟如下，（1）血清樣本收集：收集兩組孕婦空腹靜脈血4 mL，方法同上，-80 ℃超低溫凍存;（2）血清總RNA提?。翰捎眠^濾柱層析法RNA提取試劑（聚合美，北京）抽提淋巴細(xì)胞的總RNA，用First strand cDNA synthesis試劑盒（艾基生物，廣州）將總RNA反轉(zhuǎn)錄生成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA），使用Ipure SYBR Green qPCR Master Mix universal試劑盒（艾基生物，廣州）對cDNA進(jìn)行相對定量檢測;（3）qRT-PCR分析：實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增儀為ABI-7500 RT-PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國），選擇的程序?yàn)椤癛elative Quantification （ddCt） Plate”[相對定量（ddCt）反應(yīng)板]，上機(jī)前的實(shí)驗(yàn)操作均在冰板上進(jìn)行，所有實(shí)驗(yàn)耗材均已去RNA酶處理，PCR參數(shù)為：95 ℃15 min→95 ℃15 s、56 ℃30 s、72 ℃40 s，45個循環(huán)→95 ℃15 s、60 ℃60 s、95 ℃15 s，60 ℃15 s，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）作為內(nèi)參，所有qRT-PCR均做3復(fù)孔檢測，采用2-△△Ct進(jìn)行基因相對定量水平的計(jì)算。見表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。血清lncRNA ANRIL表達(dá)與GDM患者激素水平的相關(guān)性用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)分析，GDM發(fā)生的影響因素采用二元logistic回歸模型分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較 兩組孕婦年齡、體質(zhì)指數(shù)、身高、孕前體重、分娩時體重、孕次、產(chǎn)次、HbA1c比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。兩組孕期體重增加、FPG、餐后1 h血糖、餐后2 h血糖比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.2 兩組血清激素水平比較 OGTT異常組血清E2、P水平均顯著高于OGTT正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.3 兩組血清lncRNA ANRIL表達(dá)水平比較 OGTT異常組血清lncRNA ANRIL mRNA表達(dá)水平為（1.21±0.31），顯著高于OGTT正常組的（0.73±0.19），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.845，P<0.05）。

2.4 血清lncRNA ANRIL表達(dá)與GDM患者激素水平的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，血清lncRNA ANRIL mRNA表達(dá)與GDM患者E2、P水平均呈明顯正相關(guān)（r=0.379，P=0.003;r=0.507，P<0.001），見圖1。logistic回歸模型分析結(jié)果顯示，剔除血糖、激素水平等因素影響，lncRNA ANRIL是影響GDM發(fā)生的危險(xiǎn)因素[OR=5 055.075，95%CI（268.506，95 170.299），P<0.001]。

3 討論

GDM是指妊娠期出現(xiàn)或首次發(fā)現(xiàn)的葡萄糖不耐受，是妊娠期最常見的并發(fā)癥之一[8]。GDM患者可發(fā)生代謝和免疫變化，臨床上表現(xiàn)為胰島素抵抗和對胎兒及胎盤免疫耐受增加[9]。此外，GDM患者不良妊娠結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，進(jìn)而對母體和胎兒造成威脅[10]。GDM危險(xiǎn)因素包括孕前體重增加、肥胖、糖尿病家族史、高齡及飲食不良等，亦有研究指出，孕早期低甲狀腺激素水平與GDM風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，并可能影響妊娠結(jié)局和嬰兒智力水平[11]。然而GDM病因和發(fā)病機(jī)制并不完全明確。目前臨床診斷GDM的方法仍依賴于OGTT，血糖一項(xiàng)及以上達(dá)到或超過異常標(biāo)準(zhǔn)可診斷。但隨著孕周增加，孕婦體內(nèi)拮抗胰島素樣物質(zhì)增加，如雌激素、孕激素、HPL等使孕婦對胰島素的敏感性隨孕周增加而下降，故部分孕婦孕中期OGTT正常，但隨著孕周的增加，孕晚期可能出現(xiàn)OGTT，而該部分患者容易漏診或確診延遲，進(jìn)而引起嚴(yán)重后果。因此尋找新的生物標(biāo)志物，對于GDM的發(fā)現(xiàn)和治療具有重要意義。

lncRNA不編碼蛋白質(zhì)，廣泛存在于基因組中，lncRNA表達(dá)異常與多種疾病有關(guān)。lncRNA ANRIL主要定位于細(xì)胞核，又被稱為CDKN2B-AS，是人Chr9p21.3上INK4b（CDKN2B）-ARF-INK4a（CDKN2A）基因簇轉(zhuǎn)錄的長鏈非編碼RNA[12]。證據(jù)表明，lncRNA ANRIL異常表達(dá)以及單核苷酸多態(tài)性與包括糖尿病在內(nèi)的疾病有關(guān)[13]。Guo等[14]報(bào)道指出，lncRNA ANRIL通過介導(dǎo)NF-κB信號通路促進(jìn)人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞炎性細(xì)胞因子釋放，其表達(dá)與冠心病患者累積存活時間呈顯著負(fù)相關(guān)。亦有研究指出，CDKN2A/B基因異常甲基化可能與胰島β細(xì)胞功能障礙和糖尿病有關(guān)[15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CDKN2A/B位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性rs564398等位基因攜帶者降低了T2DM患者胰島β細(xì)胞增殖指數(shù)，其可能通過調(diào)節(jié)胰島基因表達(dá)和胰島β細(xì)胞增殖而影響T2DM發(fā)病[16]。故認(rèn)為lncRNA ANRIL可能是預(yù)測GDM的新型生物標(biāo)志物。本文研究結(jié)果顯示，OGTT異常組血清E2、P水平均顯著高于OGTT正常組（P<0.05），表明GDM患者激素水平顯著升高。具體而言，胰島素抵抗是糖尿病的主要生理特征，妊娠期間由于雌激素、P的合成以及胎盤的生成，E2、P水平逐漸升高，進(jìn)而影響胰島素功能，導(dǎo)致胰島功能降低，故激素水平可在一定程度上指示GDM患者病情嚴(yán)重程度。本文研究結(jié)果還顯示，OGTT異常組血清lncRNA ANRIL mRNA表達(dá)水平顯著高于OGTT正常組（P<0.05），表明GDM患者lncRNA ANRIL mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，并可能參與了GDM發(fā)病過程。分析原因，CDKN2A/B能夠調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，其單核苷酸多態(tài)性可能影響胰島β細(xì)胞增殖能力以及限制胰島β細(xì)胞數(shù)量代償性增加，來增加胰島β細(xì)胞敏感性，進(jìn)而參與GDM發(fā)病過程，此外，CDKN2A/B還具有調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖以及分化的效應(yīng)，而lncRNA ANRIL又具有調(diào)節(jié)CDKN2A/B基因座表達(dá)的作用，因此lncRNA ANRIL可能在GDM發(fā)病過程中發(fā)揮作用。進(jìn)一步相關(guān)檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，GDM患者E2、P水平升高時其血清lncRNA ANRIL表達(dá)也升高，血清lncRNA ANRIL表達(dá)與E2、P水平均呈明顯正相關(guān)，且lncRNA ANRIL是影響GDM發(fā)生的危險(xiǎn)因素，表明lncRNA ANRIL對GDM發(fā)生可能起促進(jìn)作用，其高表達(dá)可能促進(jìn)GDM發(fā)生。

綜上所述，GDM患者lncRNA ANRIL表達(dá)水平顯著升高，并與激素水平呈顯著正相關(guān)，lncRNA ANRIL表達(dá)升高可能是機(jī)體抵抗胰島功能的影響因素，從分子水平研究與GDM發(fā)病相關(guān)基因，為GDM早期診斷及未來基因治療預(yù)防有著重要的臨床意義。然而GDM發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，lncRNA ANRIL在GDM中發(fā)揮的具體作用機(jī)制仍然有待進(jìn)行更多體內(nèi)外研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Johns E C，Denison F C，Norman J E，et al.Gestational Diabetes Mellitus： Mechanisms， Treatment， and Complications[J].Trends Endocrinol Metab，2018，29（11）：743-754.

[2]李麗，劉素新，霍琰，等.lncRNA MALAT1在妊娠期糖尿病孕婦血清中的表達(dá)水平及臨床意義[J].中國婦幼保健，2019，34（6）：1264-1267.

[3] Qian X，Shi S，Zhang G.Long non-coding RNA antisense non-coding RNA in the INK4 locus expression correlates with increased disease risk， severity， and inflammation of allergic rhinitis[J].Medicine，2019，98（20）：15247-15255.

[4] Cugino D，Gianfagna F，Santimone I，et al.Type 2 diabetes and polymorphisms on chromosome 9p21： a meta-analysis[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis，2012，22（8）：619-625.

[5] Krishnamurthy J，Torrice C，Ramsey M R，et al.Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging[J].Journal of Clinical Investigation，2004，114（9）：1299-1307.

[6] Fajas L，Blanchet E，Jean-Sébastien A.CDK4， pRB and E2F1： connected to insulin[J].Cell Division，2010，5（1）：6-15.

[7]中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科分會產(chǎn)科學(xué)組，中華醫(yī)學(xué)會圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)分會妊娠合并糖尿病協(xié)作組.妊娠合并糖尿病臨床診斷與治療推薦指南（草案）[J].中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，10（6）：283-285.

[8] Zhang Y，Qu L，Ni H，et al.Expression and function of lncRNA MALAT1 in gestational diabetes mellitus[J].Advances in Clinical and Experimental Medicine，2020，29（8）：903-910.

[9] Leng L，Zhang C，Ren L，et al.Construction of a long non-coding RNA-mediated competitive endogenous RNA network reveals global patterns and regulatory markers in gestational diabetes[J].Int J Mol Med，2019，43（2）：927-935.

[10]王彬蘇，周秋明，盛望望，等.中國妊娠期糖尿病危險(xiǎn)因素及妊娠結(jié)局的調(diào)查分析[J].中國醫(yī)刊，2019，54（9）：1014-1019.

[11] Xu C，Zhang Z.Comparative study of thyroid hormone and antithyroid antibody levels in patients with gestational diabetes mellitus and pregnant patients with diabetes[J].Minerva Endocrinol，2018，43（2）：126-130.

[12] Alice T A，Biao F，Subrata C.ANRIL regulates production of extracellular matrix proteins and vasoactive factors in diabetic complications[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2018，314（3）：191-200.

[13]黃珊珊，魯一兵.長鏈非編碼RNA與糖尿病[J].國際內(nèi)分泌代謝雜志，2015，35（4）：271-274.

[14] Guo F，Tang C，Li Y，et al.The interplay of LncRNA ANRIL and miR-181b on the inflammation-relevant coronary artery disease through mediating NF-κB signalling pathway[J].J Cell Mol Med，2018，22（10）：5062-5075.

[15] Nazari Z，Shahryari A，Ghafari S，et al.In Utero Exposure to Gestational Diabetes Alters DNA Methylation and Gene Expression of CDKN2A/B in Langerhans Islets of Rat Offspring[J].Cell Journal，2020，22（2）：203-211.

[16] Kong Y，Sharma R B，Nwosu B U，et al.Islet biology， the CDKN2A/B locus and type 2 diabetes risk[J].Diabetologia，2016，59（8）：1579-1593.

（收稿日期：2020-11-18） （本文編輯：姬思雨）