張 靜，熊 鳴，李小娟，馬 偉，張達(dá)矜，喬媛媛

食管癌是常見的消化道腫瘤，全世界每年有30萬人死于食管癌。我國食管癌的發(fā)病率和死亡率也較高。由于早期食管癌缺乏臨床癥狀并且特異性診斷標(biāo)志也不明確，多數(shù)患者確診時(shí)已為中晚期，導(dǎo)致治療效果較差，5年生存率低于10%[1]。大量研究表明，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)可作為監(jiān)測腫瘤生物學(xué)改變及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)，實(shí)時(shí)監(jiān)測指導(dǎo)腫瘤的進(jìn)展、治療及其預(yù)后評(píng)估[2,3]。噬菌體抗體庫的篩選是獲得人源單鏈抗體的重要策略[4]。利用噬菌體技術(shù)篩選純蛋白、完整細(xì)胞的特異性抗體都有相關(guān)報(bào)道[5]。本課題前期應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)，針對(duì)完整腫瘤細(xì)胞高通量篩選富集，獲得與腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合的單鏈?zhǔn)删w抗體，這些抗原可能成為腫瘤的靶點(diǎn)，以期為食管癌的診斷和預(yù)后提供更多的生物標(biāo)志[6]。斑馬魚是基因和發(fā)育等方面研究的熱門模式動(dòng)物，可用來進(jìn)行腫瘤監(jiān)測和藥物代謝等方面的研究。具有實(shí)驗(yàn)費(fèi)用相對(duì)低、周期短、通量高等優(yōu)勢(shì)，因此本研究應(yīng)用斑馬魚模型進(jìn)行體內(nèi)抗體與移植瘤聚集的示蹤觀察鑒定[7]，根據(jù)小分子抗體在動(dòng)物體內(nèi)與食管癌移植瘤的結(jié)合情況，從而確定篩選的腫瘤細(xì)胞抗體能否用于食管癌患者外周血CTCs的檢測。同時(shí)課題組采用高通量蛋白質(zhì)組芯片HuProtTM對(duì)小分子抗體可能結(jié)合的抗原蛋白表達(dá)譜進(jìn)行篩選和探討，以期得到更準(zhǔn)確的抗原種類，篩選出更多的標(biāo)志物用于腫瘤的早期診斷。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑 基于HuProtTM人類蛋白質(zhì)組芯片(廣州博翀生物科技有限公司提供)；磁場磁性細(xì)胞分離架/器MACS MultiStand(Miltenyi Biotec產(chǎn)品，Bergisch Gladbach,Germany)；抗CD45抗原磁珠，F(xiàn)ITC-抗CK8/18/19、PE-抗CD45購自Miltenyi Biotec公司(Bergisch Gladbach, Germany)，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2抗體(4A Biotech)，16%多聚甲醛，甲基纖維素，Triton-100購自Amersco Inc(Solon，OH，USA)； Tris，6孔板(Fisher Scientific，China)；1640培養(yǎng)液，胎牛血清，玻片購自Thermo Fisher Scientific公司(Troy，MI, USA)； DAPI、BSA(St Louis，MI, USA)；枸櫞酸抗凝血采血管(ACD)購自BD公司(NJ, USA)。

1.2 斑馬魚移植瘤模型建立 野生型AB品系斑馬魚，以自然成對(duì)交配繁殖方式進(jìn)行。受精后2 d齡，飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚用水中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(浙)2012-0171。飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認(rèn)證。紅色熒光染料(CM-DiI)標(biāo)記人食管癌細(xì)胞KYSE-170或KYSE-180，以顯微注射的方式移植到斑馬魚卵黃囊內(nèi)，建立斑馬魚人食管癌移植瘤模型。

1.3 熒光標(biāo)記的小分子抗體與斑馬魚移植瘤聚集示蹤 實(shí)驗(yàn)組30尾斑馬魚，設(shè)置空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組，分別靜脈注射不同濃度抗體、陰性對(duì)照抗體等。標(biāo)記綠色熒光Alexa 488的抗體“488-NFC-20b”和“488-NFC-70a”稀釋不同濃度0.11C、0.33C和1.00C，分別注射到斑馬魚靜脈中，陰性對(duì)照組同時(shí)注射不同濃度的“iF488-OA”，每尾注射量為10 nl；注射后利用熒光顯微鏡觀察小分子抗體在斑馬魚體內(nèi)的示蹤。通過熒光強(qiáng)度、融合情況等評(píng)價(jià)抗體與斑馬魚體內(nèi)食管癌細(xì)胞的聚集效應(yīng)。

1.4 外周血采集 采集5例食管癌患者的外周血，每例7.5 ml，備用。

1.5 基于HuProtTM人類蛋白芯片的蛋白-蛋白互作鑒定抗體 采用HuProtTM蛋白質(zhì)芯片對(duì)NFC20b和NFC70a兩個(gè)抗體所結(jié)合的抗原種類進(jìn)行鑒定。將標(biāo)記熒光小分子抗體滴加在蛋白芯片上，使其與固定于芯片上的蛋白充分結(jié)合，清洗去除未結(jié)合的抗體。加入熒光標(biāo)記的二抗(Cy3-anti-mouse IgG)37 ℃孵育，對(duì)熒光信號(hào)的掃描，根據(jù)熒光信號(hào)的親和力強(qiáng)弱、數(shù)量判讀陽性結(jié)果。

1.6 采用ELISA方法對(duì)抗原進(jìn)行驗(yàn)證 分析蛋白芯片的結(jié)果，匹配NFC20b和NFC70a相關(guān)的抗原蛋白表達(dá)譜，用細(xì)胞ELISA法進(jìn)行驗(yàn)證。培養(yǎng)KYSE-170、KYSE-180細(xì)胞，傳代后接種培養(yǎng)板， 1h后離心棄上清，室溫放置至細(xì)胞干燥；加入4%多聚甲醛固定40 min后， Triton-100細(xì)胞打孔備用。將抗細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)抗體1∶200稀釋，加入細(xì)胞板中，孵育洗滌后，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶1000稀釋)，再次孵育洗滌，加入OPD底物液顯色，1mol/L H2SO4終止，讀取A490值。陰性對(duì)照為抗OA抗體，空白對(duì)照為PBS。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)斑馬魚體內(nèi)食管癌KYSE-170細(xì)胞移植瘤聚集效應(yīng)評(píng)價(jià) 標(biāo)記了紅色熒光的食管癌KYSE170細(xì)胞注射到斑馬魚卵黃囊中，形成移植瘤見圖1A， “488-NFC-20b”和“488-NFC-70a”在1 g/L濃度時(shí)，從4 h起至24 h，背主動(dòng)脈、尾動(dòng)脈和尾靜脈中均能觀察到抗體的分布；同時(shí)，“488-NFC-20b”和“488-NFC-70a”在0.11 g/L、0.33 g/L和1.00 g/L濃度，從注射后4 h起，均能觀察到卵黃囊中抗體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，其中488-NFC-70a抗體在9 h結(jié)合活性最高。表明兩個(gè)小分子抗體可以通過血液循環(huán)分布到卵黃囊，對(duì)卵黃囊中的食管癌細(xì)胞有明顯的結(jié)合聚集效應(yīng)。而陰性對(duì)照品“iF488-OA”在各時(shí)間點(diǎn)與腫瘤細(xì)胞結(jié)合均不明顯。圖1顯示的是兩個(gè)小分子抗體在1g/L濃度下與食管癌KYSE-170移植瘤的不同時(shí)間點(diǎn)的聚集效應(yīng)。

圖1 488標(biāo)記抗體對(duì)KYSE-170腫瘤細(xì)胞聚集效應(yīng)

2.2 對(duì)斑馬魚體內(nèi)食管癌KYSE-180細(xì)胞移植瘤聚集效應(yīng)評(píng)價(jià) 標(biāo)記了紅色熒光的食管癌KYSE-180細(xì)胞注射到斑馬魚卵黃囊中，形成移植瘤。同2.1結(jié)果，圖2顯示 “488-NFC-20b”和“488-NFC-70a”小分子抗體在1 g/L濃度下與食管癌KYSE-180移植瘤的不同時(shí)間點(diǎn)的結(jié)合聚集效應(yīng)。

圖2 488標(biāo)記抗體對(duì)KYSE-180腫瘤細(xì)胞聚集效應(yīng)

2.3 抗體檢測食管癌患者外周血CTCs 采用Miltenyi免疫磁珠對(duì)5例食管癌患者的外周血進(jìn)行負(fù)性富集分離，用Alexa 488標(biāo)記的NFC20b抗體鑒定CTCs。檢測出3例患者外周血有CTCs，檢測率為60%。本研究所用抗體能夠與食管癌患者CTCs結(jié)合，呈現(xiàn)綠色熒光，而白細(xì)胞表面抗原CD45染色陰性，核染色DAPI陽性(圖3)。

圖3 食管癌患者外周血CTCs的檢測(×400)

2.4 基于HuProtTM蛋白芯片利用蛋白-蛋白相互作用鑒定單鏈抗體 利用高通量蛋白芯片實(shí)驗(yàn)篩選小分子抗體的抗原表達(dá)譜，根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況，通過設(shè)置cutoff閾值來確定陽性蛋白，定義cutoff=2，即SNR>2為陽性蛋白。本次共篩選出與NFC20b抗體所結(jié)合陽性蛋白23個(gè)、NFC70a所結(jié)合的陽性蛋白28個(gè)。

2.5 初步驗(yàn)證蛋白芯片結(jié)果 采用ELISA法結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KYSE-170、KYSE-180細(xì)胞能夠與CDK2(0.89±0.06；0.68±0.04)抗體有效結(jié)合，而與卵清蛋白結(jié)合很低(0.06±0.00；0.04±0.01)，兩者與食管癌細(xì)胞結(jié)合活性對(duì)比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

斑馬魚與人類基因同源性較高，具有繁殖能力強(qiáng)、體外受精發(fā)育、胚胎透明、成熟周期較短、個(gè)體小、能在顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察等諸多優(yōu)勢(shì)，廣泛用于人類疾病模型的建立、新藥研發(fā)和藥物的篩選等方面。近年來，斑馬魚腫瘤移植模型已應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)基因功能的研究與抗腫瘤藥物的篩選，可在短時(shí)間為患者提供精準(zhǔn)的個(gè)體化治療信息。有學(xué)者在胃癌等細(xì)胞株構(gòu)建模型用于腫瘤藥物開發(fā)及臨床前藥物篩選的研究中發(fā)現(xiàn)，通過斑馬魚可直接觀察抗癌藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，作為臨床實(shí)驗(yàn)的初始篩選藥物并制定個(gè)體化治療方案的依據(jù)，為精準(zhǔn)腫瘤學(xué)的發(fā)展提供有效平臺(tái)[8,9]。

本研究基于人源噬菌體抗體庫篩選得到食管癌細(xì)胞相關(guān)抗原的噬菌體抗體技術(shù)，改造其中2株抗體NFC20b和NFC70a，進(jìn)行載體構(gòu)建，進(jìn)行原核細(xì)胞內(nèi)抗體重組蛋白的表達(dá)。綜合包涵體變性、復(fù)性、純化等步驟，得到有生物活性的小分子抗體。小分子抗體標(biāo)記熒光后，在斑馬魚體內(nèi)進(jìn)行抗體與移植瘤聚集的示蹤[7,10]，觀察此前篩選的小分子抗體在斑馬魚體內(nèi)與食管癌移植瘤結(jié)合情況，確定本研究篩選的腫瘤細(xì)胞抗體在食管癌患者外周血CTCs的應(yīng)用基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)組芯片具有高通量、并行、快速分析的優(yōu)勢(shì)，在系統(tǒng)生物學(xué)研究中發(fā)揮著越來越重要的作用，適用于以蛋白質(zhì)相互作用為基礎(chǔ)的各種研究領(lǐng)域，在小分子藥物靶向鑒定、單克隆抗體特異性篩選及自身抗體類標(biāo)志物的篩選等方面應(yīng)用廣泛[11]。本研究為了更好地開發(fā)抗體應(yīng)用，采用HuProtTM人類蛋白質(zhì)組芯片對(duì)小分子抗體所作用的靶蛋白進(jìn)行系統(tǒng)性篩選[12]。HuProtTM人類蛋白質(zhì)組芯片包含20,000個(gè)人源重組蛋白質(zhì)[13]，是目前世界上通量最高的蛋白質(zhì)芯片，適用于全局性地進(jìn)行蛋白-蛋白互作、蛋白-核酸互作、蛋白-小分子互作及蛋白翻譯后修飾研究，借助此蛋白質(zhì)組芯片技術(shù)，深入探討這兩個(gè)分子的作用。

經(jīng)過對(duì)蛋白功能作用的分析，初步錨定細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)為其中一個(gè)抗體NFC20b所結(jié)合的抗原，為其應(yīng)用到食管癌檢出和治療中提供依據(jù)。CDK2是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)的異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，CDKs的異常表達(dá)使細(xì)胞周期紊亂、細(xì)胞增殖失控，最終發(fā)生癌變。很多腫瘤細(xì)胞系及胃癌、乳腺癌等腫瘤組織中都有CDK基因的擴(kuò)增、突變和高表達(dá)[14,15]。以CDK為中心的細(xì)胞周期調(diào)控這一領(lǐng)域已成為細(xì)胞生物學(xué)和腫瘤生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。通過比較分析確定篩選得到的蛋白的可信性。

綜上所述，本研究探索了一套尋找腫瘤標(biāo)志物的方法，從大容量抗體庫中篩選抗體，應(yīng)用斑馬魚移植瘤模型對(duì)小分子抗體進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)結(jié)合活性的驗(yàn)證，并用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對(duì)其抗原篩選鑒定，得到與抗體直接相互作用的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，旨在從高通量篩選的新技術(shù)中尋找食管癌的標(biāo)志物和藥物作用靶點(diǎn)，為食管癌的臨床診斷、預(yù)后監(jiān)測及相關(guān)靶向藥物開發(fā)提供了一定的思路[16，17]。下一步，將為其他小分子靶蛋白的發(fā)現(xiàn)提供更多的研究路線，為食管癌及其他實(shí)體瘤的檢測及治療方面的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。