薛棟　宋德坤　王平安　宋相孔　夏修良

【摘要】 目的：探討甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）中3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）、E盒結(jié)合鋅指蛋白1 （ZEB1）和P-鈣黏蛋白（P-cadherin）的表達情況和臨床意義。方法：選取206例PTC和45例癌旁甲狀腺標(biāo)本，采用免疫組化檢測PDK1、ZEB1和P-cadherin蛋白表達，并分析三個指標(biāo)蛋白表達水平和臨床病理各參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果：PTC組織中PDK1、ZEB1陽性表達率分別為76.7%、72.3%，高于癌旁甲狀腺組織的26.7%、28.9%（P<0.05）。P-cadherin在PTC組織中和癌旁甲狀腺中的陽性表達率分別為22.3%、88.9%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。PDK1、ZEB1及P-cadherin表達與TNM分期、腺體外侵及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）;Spearman等級檢驗分析，PTC組織中PDK1和ZEB1蛋白表達呈正相關(guān)（rs=0.476，P=0.031），PDK1和P-cadherin蛋白表達呈負相關(guān)（rs=-0.419，P=0.029），ZEB1和P-cadherin蛋白表達呈顯著負相關(guān)（rs=-0.586，P=0.019）。結(jié)論：PTC中PDK1、ZEB1及P-cadherin蛋白的異常表達與PTC侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，PDK1、ZEB1可能對PTC的診斷和治療具有重要作用。

【關(guān)鍵詞】 甲狀腺乳頭狀癌 3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1 E盒結(jié)合鋅指蛋白1 P-鈣黏蛋白 免疫組織化學(xué)

[Abstract] Objective： To explore the expression and clinical significance of 3-phosphoinositide dependent protein kinase 1 （PDK1），zinc finger E-box-binding protein 1 （ZEB1） and P-cadherin protein in papillary thyroid carcinoma. Method： A total of 206 cases of PTC and 45 cases of adjacent thyroid specimens were selected， the expressions of PDK1， ZEB1 and P-cadherin were detected by immunohistochemistry， the relationship between three? indicaters protein expression and clinicopathological parameters was analyzed. Result： The positive expression rates of PDK1 and ZEB1 protein in PTC were 76.7% and 72.3%， they were significantly higher than 26.7% and 28.9% in paracancerous normal thyroid tissues （P<0.05）. The positive expression rates of P-cadherin in PTC and paracancerous normal thyroid tissues were 22.3%， 88.9%， the difference was statistically significant （P<0.05）. The differences of the expression of PDK1， ZEB1 and P-cadherin protein in PTC of TNM stage， extrathyroidal invasion and lymph node metastasis were all significant （P<0.05）. Spearman rank test showed significantly positive correlation was found between PDK1 and ZEB1 （rs=0.476， P=0.031）， there was negative correlation between PDK1 and P-cadherin （rs=-0.419， P=0.029）， the similar negative correlation was between ZEB1 and P-cadherin （rs=-0.586， P=0.019）. Conclusion： The abnormal expression of PDK1， ZEB1 and P-cadherin protein in PTC is closely related to the invasion and metastasis of PTC， PDK1 and ZEB1 may have an important role in the diagnosis and theraphy of PTC.

[Key words] Papillary thyroid carcinoma PDK1 ZEB1 P-cadherin Immunohistochemistry

First-authors address： The Peoples Hospital of Binzhou City， Binzhou 256610， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.03.003

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是普外科工作實踐過程中經(jīng)常會接觸到的一種甲狀腺癌病理類型，占80%～85%[1]。最近幾年P(guān)TC發(fā)病率呈明顯上升態(tài)勢，甚至有一部分微小乳頭狀癌病例早期就發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[2]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）是細胞分子網(wǎng)絡(luò)中一個重要信號通路，它參與細胞的過度增殖、轉(zhuǎn)分化和衰亡等過程。3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（3-phosphoinositide dependent protein kinase 1，PDK1）是一種重要的調(diào)節(jié)因子，激活PI3K/Akt信號，在轉(zhuǎn)導(dǎo)信號過程中起著重要的作用[3]。PDK1主要包含兩個分子結(jié)構(gòu)域，分別為PH結(jié)構(gòu)域（C端）和激酶結(jié)構(gòu)域（N端），PDK1磷酸化Akt的蘇氨酸（308位點）并激活PI3K/Akt信號，因此，PDK1與腫瘤細胞異常增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移都有關(guān)[4]。研究表明，急性髓細胞性白血病和乳腺癌中PDK1高表達，且與腫瘤不良預(yù)后有關(guān)[5-6]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中的重要事件。P-鈣黏蛋白（P-cadherin）最初在1986年被發(fā)現(xiàn)，是EMT發(fā)生過程中的一個經(jīng)典標(biāo)志蛋白[7]。P-cadherin是一種細胞之間鈣粘合蛋白，在維持正常細胞結(jié)構(gòu)完整性、細胞形態(tài)、細胞增殖和轉(zhuǎn)分化等過程中一直發(fā)揮重要生物學(xué)作用[8]。E盒結(jié)合鋅指蛋白1（zinc finger E-box-binding protein 1，ZEB1）是一個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[9]。有研究表明，ZEB1在肺癌組織中高表達，且與病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯有關(guān)，ZEB1還是一個不良預(yù)后因素[10]。目前關(guān)于PDK1、ZEB1和P-cadherin在PTC中研究報道較少。本文重點探討PDK1、ZEB1和P-cadherin與PTC臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，為探索PTC侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制提供一個新的思路?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月-2019年6月

濱州市人民醫(yī)院206例PTC患者，男70例，女136例;年齡16～72歲，平均（44.1±6.4）歲;98例出現(xiàn)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，108例未出現(xiàn)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合甲狀腺乳頭狀癌病理診斷標(biāo)準(zhǔn);術(shù)中留取腫瘤組織或者癌旁組織。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會與國際抗癌聯(lián)盟（AJCC）第八版進行TNM分期。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料不完整;術(shù)前接受過放射治療、化學(xué)藥物治療及免疫治療等輔助治療;合并其他組織器官癌變。選擇同一時期45例癌旁正常甲狀腺患者，男14例，女31例;年齡18～70歲，平均（42.2±5.2）歲。該研究已經(jīng)濱州市人民醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法 應(yīng)用免疫組化方法（EnVision）檢測PDK1、ZEB1及P-cadherin蛋白表達。鼠抗人PDK1單抗、鼠抗人ZEB1單抗和鼠抗人P-cadherin單抗采購于Santa Cruz公司，工作濃度為1∶200。EnVision試劑盒來源于Dako公司。陽性對照為已知陽性切片，陰性對照用PBS。

1.3 觀察指標(biāo)與判定標(biāo)準(zhǔn) （1）比較PTC和癌旁甲狀腺組織中PDK1、ZEB1和P-cadherin蛋白的表達情況;（2）分析PDK1、ZEB1和P-cadherin蛋白表達與PTC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系;（3）分析PDK1、ZEB1和P-cadherin蛋白三者之間的相關(guān)性。陽性結(jié)果的判定：細胞出現(xiàn)黃色顆粒為陽性染色。PDK1蛋白定位在細胞質(zhì)，ZEB1蛋白定位在細胞核，P-cadherin定位在細胞膜。先判定染色的強度：0、1、2、3分分別對應(yīng)無色、淡黃、棕黃、棕褐色。然后計算陽性細胞百分?jǐn)?shù)：0、1、2、3、4分分別對應(yīng)≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%和>75%以上。最后將前兩者乘積≥4分為免疫反應(yīng)陽性，而<4分為免疫反應(yīng)陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。Spearman用于相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTC和癌旁甲狀腺中PDK1、ZEB1和P-cadherin蛋白的表達 細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃或棕褐色為PDK1，見圖1;細胞核出現(xiàn)棕黃色為ZEB1蛋白，見圖2;細胞膜出現(xiàn)黃染為P-cadherin，見圖3。PTC組織中PDK1、ZEB1蛋白的陽性率分別為76.7%、72.3%，而癌旁正常甲狀腺組織PDK1、ZEB1蛋白陽性率分別為26.7%、28.9%，PTC中PDK1、ZEB1的表達率均高于癌旁甲狀腺組織（P<0.05）。PTC組織中P-cadherin陽性率為22.3%，而在癌旁甲狀腺中為88.9%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 PDK1、ZEB1和P-cadherin表達與PTC患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 患者臨床病理特征，如性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位和多灶性與PDK1、ZEB1和P-cadherin陽性表達均無明顯相關(guān)性（P>0.05）;而PDK1、ZEB1和P-cadherin表達均與TNM分期、腺體外侵和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。見表2。

2.3 PDK1、ZEB1和P-cadherin蛋白表達相關(guān)性 通過Spearman等級檢驗分析，PTC組織中PDK1與ZEB1蛋白表達呈正相關(guān)（rs=0.476，P=0.031），PDK1和P-cadherin蛋白表達呈負相關(guān)（rs=-0.419，P=0.029），ZEB1和P-cadherin蛋白表達水平呈顯著負相關(guān)（rs=-0.586，P=0.019）。

3 討論

甲狀腺癌在全球范圍內(nèi)均呈明顯上升態(tài)勢，目前居于我國女性惡性腫瘤的第四位[11]。近幾年P(guān)TC病例越來越年輕化，且易發(fā)生引流區(qū)域的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，大約有70%的患者確診時已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此關(guān)于侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制亟待解決。

PDK1可以通過多條途徑調(diào)節(jié)蛋白激酶C的活性來激活A(yù)kt信號通路[12]。PDK1在喉癌組織中高表達，且其還與臨床腫瘤分期、病理學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，PDK1是喉癌患者生存預(yù)后的一個不良因素[13]。本研究結(jié)果顯示，PTC組織中PDK1表達率高于癌旁組織（P<0.05），提示PDK1可能促進了PTC的發(fā)生發(fā)展。進一步還研究PDK1與PTC臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PTC組織中PDK1蛋白陽性表達與患者年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤部位和多灶性沒有密切關(guān)系，而與腫瘤的TNM分期、腺體外侵和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05），表明PDK1在PTC細胞侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。

ZEB1作為一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[14-15]。ZEB1在肺鱗癌中高表達，且和縱隔內(nèi)淋巴結(jié)、遠處器官轉(zhuǎn)移均有關(guān)，干擾ZEB1基因表達后，腫瘤細胞的增殖和侵襲力均較前明顯下降[16]。新近的研究表明，膀胱癌和食管癌組織中均發(fā)現(xiàn)了ZEB1蛋白表達，且與臨床預(yù)后明顯相關(guān)[17]。乳腺癌中ZEB1高表達的患者容易出現(xiàn)化療耐受，且還與Bcl-xL、cyclin D1呈正相關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示，ZEB1在PTC中有高表達，且ZEB1表達率與TNM分期、腺體外侵和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05）。另外，PTC組織中PDK1與ZEB1存在正相關(guān)，推測PDK1可能通過調(diào)控ZEB1表達促進PTC侵襲轉(zhuǎn)移。

實體惡性腫瘤在侵襲轉(zhuǎn)移過程中經(jīng)常發(fā)生著上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）現(xiàn)象。P-cadherin通過本身的鈣黏附作用來保持細胞間的緊密連接，一旦表達減少后導(dǎo)致黏附力下降，腫瘤細胞就會容易侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。EMT在PTC細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用[20]。有研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中出現(xiàn)P-cadherin低表達，并且35例肝癌完全沒有表達，P-cadherin還與腫瘤分期明顯有關(guān)，體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)抑制P-cadherin表達，促進了肝細胞癌細胞增殖[21]。本研究結(jié)果顯示，PTC中P-cadherin表達明顯低于癌旁甲狀腺組織（P<0.05）。P-cadherin陽性表達與患者TNM分期、腺體外侵及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及有關(guān)（P<0.05）。進一步研究還發(fā)現(xiàn)，PDK1和P-cadherin存在負相關(guān)，P-cadherin和ZEB1存在負相關(guān)。PDK1、ZEB1和P-cadherin在PTC中有異常表達的現(xiàn)象，且三者有相關(guān)性，提示三者參與了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程。

綜上所述，PTC中PDK1、ZEB1高表達伴有P-cadherin低表達，且三個指標(biāo)均與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腺體外侵明顯相關(guān)。但是關(guān)于PDK1促進PTC侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制尚不明確，仍需要深入研究。

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（收稿日期：2020-10-12） （本文編輯：程旭然）