陳劍雙，殷玥琪，成 浩，張 軒，袁德富，張曉軒，王曉敏，魏乾坤，王 蓓*

1東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)系，江蘇 南京 210009；2無錫市新吳區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江蘇 無錫 214028；3無錫市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 無錫 214000

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）-1基因具有高度變異性，在復(fù)制過程中不斷發(fā)生的突變和重組導(dǎo)致多種新亞型的產(chǎn)生，給疾病防控帶來極大挑戰(zhàn)［1］。目前HIV基因數(shù)據(jù)庫（HIV sequence database）中已收集102種循環(huán)重組型（circulating recombinant form，CRF）毒株序列，而且仍在不斷地更新［2］。此外還存在大量難以確定基因型的獨特重組型（unique recombinant form，URF）病毒［3］。相關(guān)研究表明［4］，HIV-1基因型在全球范圍分布相對穩(wěn)定，但重組毒株的流行在不斷上升，亞型多樣性持續(xù)增加。HIV耐藥可分為原發(fā)性耐藥（transmitted drug resistance，TDR）和獲得性耐藥（acquired drug resistance，ADR）。近年來，對于未接受過高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（highly active antiretroviral therapy，HAART）的HIV感染者TDR的關(guān)注日益增加。TDR的高流行率會限制治療方式的選擇，損害當(dāng)前治療方案的效果并增加治療失敗的風(fēng)險。ADR在抗病毒治療失敗患者中更為普遍，主要表現(xiàn)為對核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NRTI）和非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NNRTI）耐藥，這兩類藥也是目前我國免費抗病毒治療的首選藥物［5］。耐藥病毒株是HIV抗病毒治療廣泛開展后不可避免的產(chǎn)物，會影響一線抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療的效果，如耐藥位點進一步積累，會導(dǎo)致更廣泛、更復(fù)雜的耐藥［6］。因此本研究通過對2014年江蘇省無錫市新發(fā)現(xiàn)HIV-1感染者進行病毒亞型分型及耐藥檢測，并于2016年隨訪，對比其亞型及耐藥的變化情況，為抗病毒治療策略提供建議。

1 對象和方法

1.1 對象

以江蘇省無錫市疾病預(yù)防控制中心2014年1月1日—12月31日確認和管理的HIV感染者/艾滋病患者（HIV/AIDS）為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①感染者于2014年被診斷感染HIV，未進行過抗病毒治療，采集血樣1次；②感染者在無錫市治療滿2年，且于2016年采集血樣1次。本研究經(jīng)中國疾病預(yù)防控制中心艾滋病預(yù)防控制中心倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象對其個人基本人口學(xué)信息及血樣用于開展后續(xù)分子流行病學(xué)研究知情同意。

1.2 方法

1.2.1 基因擴增與測序

①樣本采集：由無錫市疾病預(yù)防控制中心技術(shù)人員于2014年及2016年分別采集感染者血樣10 mL，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。②HIV-1前病毒DNA提?。翰捎肨IANamp Blood DNA Kit（北京天根生化科技有限公司），根據(jù)說明書標(biāo)準(zhǔn)操作流程，從200 μL外周血淋巴細胞中提取前病毒DNA。③目的基因擴增：使用TaKaRa Ex TaqTMHot Start Version（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）對pol區(qū)、env區(qū)和gag區(qū)HIV-1基因片段進行巢式PCR擴增。所需引物及反應(yīng)條件參照文獻［7］。④擴增產(chǎn)物鑒定及測序：擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳確認后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.2 亞型及耐藥分析

以pol、env和gag 3個片段基因分型結(jié)果綜合判斷感染者的基因型，2個及以上片段分型結(jié)果一致則確定為該型別，將無法確認型別的序列標(biāo)記為URF。將完成比對及人工校正的pol序列提交至美國斯坦福大學(xué)HIV耐藥數(shù)據(jù)庫（https：//hivdb.stanford.edu/）進行耐藥分析。對NRTI、NNRTI、蛋白酶抑制劑（PI）任意一類抗病毒藥物出現(xiàn)耐藥突變（高度、中度、低度）判定為耐藥。耐藥程度根據(jù)耐藥分數(shù)分級：高度耐藥為≥60分，中度耐藥為30～59分，低度耐藥為15～29分。

1.2.3 質(zhì)量控制

為排除實驗過程對亞型及耐藥變異的影響，本實驗全程進行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。①在核酸提取過程中，每24個血樣設(shè)置1個陰性血清對照；②陰性對照隨樣本一同進行擴增及測序，當(dāng)此陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果時，對應(yīng)批次實驗結(jié)果廢棄重做；③所有測序結(jié)果拼接及校對完成后，上傳至HIV序列數(shù)據(jù)庫中采用ElimDupes功能（https：//www.hiv.lanl.gov/content/sequence/elimdupesv2/elimdupes.html）進行重復(fù)序列比對，排除潛在實驗室污染。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用Excel 2016軟件整理數(shù)據(jù)，運用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。定性資料采用率或構(gòu)成比（%）描述，用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行組間比較；定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，t檢驗用于兩組間比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象基本特征

研究對象為2014年納入調(diào)查并在2016年完成隨訪且采集血樣的117例HIV感染者，以男性為主，占85.47%（100/117）；年齡15～72歲，平均（39.41±13.81）歲；文化程度以初中及以上為主（87.18%，102/117）；絕大部分感染者經(jīng)性途徑感染（99.15%，116/117），其中男男同性性傳播比例略高于異性傳播（52.14%vs.47.01%）。基線CD4+T細胞≥200個/μL占81.20%（95/117）。2016年CD4+T細胞水平上升的占80.34%（94/117），具體情況見表1。

2.2 HIV-1亞型分析

對117例研究對象的血液樣本進行基因擴增，2014年未接受抗病毒治療樣本共有108例成功擴增并獲得病毒序列，擴增成功率為92.31%，分別成功擴增101條pol、63條env和81條gag基因序列。2016年接受抗病毒治療樣本共有87例成功擴增并獲得病毒序列，擴增成功率為74.36%，分別成功擴增58條pol、54條env和56條gag基因序列。2014年未治療樣本的擴增成功率總體高于2016年已治療樣本（92.31%vs.74.36%，χ2=13.569，P＜0.001）。

表1 無錫市117例HIV/AIDS感染者的基本人口學(xué)特征Table 1 Demographic characteristics of 117 HIV/AIDS patients in Wuxi

根據(jù)3個HIV基因片段綜合判斷，共檢測出7種不同的亞型以及6種URF。2014年未治療樣本以CRF01_AE（31.48%，34/108）為主要流行亞型，CRF07_BC（25.93%，28/108）、B（11.11%，12/108）次之。2016年治療樣本亞型排名前3位的是CRF01_AE（29.89%，26/87）、CRF07_BC（26.44%，23/87）和B（10.34%，9/87）。6種URF包括：CRF01_AE/07_BC、CRF01_AE/08_BC、CRF01_AE/C、CRF01_AE/B、CRF55_01B/07_BC和CRF BC。亞型構(gòu)成情況詳見圖1。2014年和2016年亞型構(gòu)成基本一致（χ2=1.298，P=0.988），2016年CRF67_01B比例增加較明顯（7.41%增加至10.34%）。

圖1 無錫市2014年和2016年HIV/AIDS中HIV-1亞型構(gòu)成Figure 1 HIV-1 subtype composition of HIV/AIDS in Wuxi in 2014 and 2016

2.3 HIV-1耐藥突變情況

2014年未接受抗病毒治療樣本共獲得101條pol序列，原發(fā)性耐藥率為4.95%（5/101），對NNRTI、NRTI和PI的耐藥率分別為3.96%（4/101）、1.98%（2/101）和0.99%（1/101）。其中同時對NNRTI和NRTI藥物耐藥的患者有2例（1.98%）。4例NNRTI耐藥中，有3例發(fā)生單一位點突變，1例發(fā)生多位點突變。2例NRTI耐藥分別為M184V和T215N位點突變。1例PI耐藥突變位點為I50L。

2016年接受抗病毒治療樣本共獲得87條pol序列，獲得性耐藥率為5.75%（5/87），對NNRTI、NRTI的耐藥率分別為5.75%（5/87）、2.30%（2/87）。其中同時對NNRTI和NRTI藥物耐藥的患者有2例（2.30%）。5例NNRTI耐藥中，有3例發(fā)生單一位點突變，其余2例出現(xiàn)2個及以上突變位點，其中K103N位點突變發(fā)生頻率最高（80.00%，4/5）。2例NRTI耐藥均發(fā)生M184I位點突變。具體的耐藥情況見表2。

共有52例（44.44%，52/117）感染者2014年及2016年樣本均得到pol序列。5例患者在隨訪期間耐藥結(jié)果發(fā)生變化，其中1例2014年檢測存在V179F突變，而2016年未檢測出耐藥突變。其余4例均為2014年時無耐藥突變位點檢出，而2年后檢測出1個及以上耐藥突變位點且耐藥程度較高。在這5例耐藥結(jié)果發(fā)生變化的患者中，有1例患者亞型發(fā)生變異（無錫5），從CRF01_AE變異為CRF67_01B。該患者為男性，年齡35歲，初中文化水平，未婚，通過異性傳播感染艾滋病，2014年CD4+T細胞計數(shù)僅為8個/μL，2016年僅為163個/μL。2例艾滋病患者（無錫3、無錫5）經(jīng)過抗病毒治療CD4+T水平仍較低。具體耐藥變化情況見表3。

表2 無錫市2014年和2016年HIV/AIDS感染者的耐藥情況Table 2 Drug resistance of HIV/AIDS in Wuxi in 2014 and 2016

表3 2014—2016年HIV/AIDS感染者耐藥變化情況Table 3 Changes in drug resistance of HIV/AIDS from 2014 to 2016

3 討論

研究結(jié)果顯示，無錫市2014年和2016年HIV-1感染者以男性居多，同性傳播所占比例高于異性傳播，與江蘇省HIV-1主要傳播方式相一致［8-9］?；€CD4+T細胞≥200個/μL占81.20%，提示2014年無錫市晚發(fā)現(xiàn)感染者所占比例較高，仍然需要擴大檢測，早日實現(xiàn)90%檢出率的目標(biāo)。2016年CD4+T細胞水平改善的HIV患者占80.34%，仍有19.66%的患者抗病毒治療免疫學(xué)效果不佳，可能與治療依從性及耐藥的產(chǎn)生有關(guān)。

分型分析結(jié)果顯示，無錫市HIV-1亞型復(fù)雜多樣，以CRF01_AE、CRF07_BC和B亞型為主要流行亞型，與全國流行亞型一致［10］，也與江蘇省早期研究一致［11］。2014年與2016年亞型構(gòu)成基本一致，其中2016年CRF67_01B增加明顯。CRF67_01B是由CRF01_AE與B亞型重組而成，殷玥琪等［12］進化分析研究發(fā)現(xiàn)CRF67_01B在江蘇省與安徽省等地區(qū)形成，經(jīng)過10多年傳播逐漸在無錫市以穩(wěn)定的速率流行，隨著時間的推移，可能出現(xiàn)更多該亞型感染者，與本研究發(fā)現(xiàn)吻合。

本研究發(fā)現(xiàn)，2014年原發(fā)性耐藥率為4.95%，2016年獲得性耐藥率為5.75%。當(dāng)前全球HIV的TDR流行率約為10.1%，西方經(jīng)濟較發(fā)達國家有著相對較高的TDR流行率［13］。我國多地開展了有關(guān)TDR流行率調(diào)查并顯示出較大的地區(qū)差異。例如，北京市TDR流行率為6.1%（57/932）［14］；上海市為17.4%（55/317）［15］；四川省為9.9%（46/464）［16］。地區(qū)間原發(fā)性耐藥率的差異可能與研究樣本選擇、樣本大小等有關(guān)。3類抗病毒藥物中，NNRTI耐藥率最高，其次是NRTI，PI類藥物耐藥率最低，與李梅等［17］研究一致。NNRTI類耐藥突變位點中K103N突變發(fā)生頻率最高，NRTI類耐藥突變位點中M184V/I突變發(fā)生頻率最高，均是WHO監(jiān)測的傳播耐藥位點，可引起NNRTI、NRTI藥物中、高度耐藥［18］。

5例隨訪期間耐藥結(jié)果發(fā)生變化的患者中有1例2014年存在V179F突變，而2016年未檢測出耐藥突變。V179F位點突變通常是使用依曲韋林（ETR）治療后發(fā)生的非多態(tài)突變，單獨V179F耐藥位點突變對NNRTI藥物敏感性影響不大［19］，而ETR未列入我國免費一線抗病毒治療藥物名單，因而對治療效果沒有影響。其余4例在隨訪2年后出現(xiàn)中、高程度的耐藥，以K103N突變最為頻繁。HIV-1耐藥是由于抗病毒治療藥物壓力的作用，使得藥物作用靶點的生化或結(jié)構(gòu)特征發(fā)生改變即HIV-1耐藥相關(guān)位點發(fā)生突變，導(dǎo)致病毒對藥物不敏感或敏感性下降［20］。K103N可引起依非韋倫（EFV）和奈韋拉平（NVP）的高水平耐藥，而我國成人一線抗病毒治療方案為TDF或AZT+3TC+EFV或NVP，因此K103N是一線抗病毒治療獲得性耐藥者中最常見的耐藥突變。應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)測用藥人群耐藥情況，及時調(diào)整正在接受抗病毒治療人群的治療方案以抑制耐藥毒株的傳播。

1例耐藥突變發(fā)生變化患者的亞型也發(fā)生變異，為CRF01_AE變異為CRF67_01B，可能是通過性傳播途徑引入B亞型病毒毒株，使其在體內(nèi)發(fā)生重組，或者是由于外源性CRF67_01B進入而使體內(nèi)優(yōu)勢準(zhǔn)種發(fā)生變化［21］。該艾滋病患者CD4+T細胞水平低，治療效果不明顯，應(yīng)及時監(jiān)測患者CD4+T細胞及病毒載量，對治療效果不佳的感染者及時監(jiān)測耐藥情況，為患者更換治療方案提供依據(jù)。

本研究存在局限性。因隨訪時間間隔較短，且部分樣本未能獲得序列，對感染者體內(nèi)HIV亞型及耐藥變化分析存在一定偏倚，需要長期隨訪、監(jiān)測，以獲取長期的病毒亞型及耐藥變化信息，才能為艾滋病疫情的防控提供更加準(zhǔn)確可靠的參考依據(jù)。此外，樣本未進行病毒全長基因測序，尚不能判斷部分URF的具體重組情況，還需要后續(xù)進一步實驗來驗證。

綜上所述，無錫市2014年和2016年HIV-1亞型復(fù)雜多樣，感染者耐藥情況較為嚴(yán)重，應(yīng)持續(xù)監(jiān)測HIV-1亞型及耐藥變化，從分子角度為疫情防控提供參考依據(jù)。