丁喜艷，王成虎，曹?chē)?guó)凡，蔣 沁，姚 進(jìn)

南京醫(yī)科大學(xué)附屬眼科醫(yī)院青光眼科，江蘇 南京 210029

青光眼是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致失明的主要原因，原發(fā)性開(kāi)角型青光眼（primary open angle glaucoma，POAG）是最常見(jiàn)的開(kāi)角型青光眼［1-2］，占全部病例的一半以上。遺傳因素在POAG的發(fā)病中起主要作用［3］，目前已明確小梁網(wǎng)誘導(dǎo)性糖皮質(zhì)激素反應(yīng)蛋白（myocilin，MYOC）基因主要與青少年開(kāi)角型青光眼（juvenile-onset open-angle glaucoma，JOAG）相關(guān)，在JOAG家系中占36%，而在散發(fā)性POAG患者中只有2%～4%［4］。近十年來(lái)國(guó)內(nèi)外共報(bào)道MYOC基因突變30余種，在西班牙、南非、日本和高加索地區(qū)均有報(bào)道［5-8］。為探索江蘇南京地區(qū)MYOC突變，我們對(duì)江蘇南京地區(qū)1個(gè)6代POAG家系進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)及系譜分析，探討此家系中MYOC基因突變與POAG發(fā)病的關(guān)系，確定該家系的致病基因，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

來(lái)自南京醫(yī)科大學(xué)附屬眼科醫(yī)院確診的南京市1個(gè)6代原發(fā)性開(kāi)角型青光眼家系，共55人，參加本研究的共3代27人（圖1）。POAG診斷標(biāo)準(zhǔn)（參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼科學(xué)分會(huì)青光眼學(xué)組推薦標(biāo)準(zhǔn)）：①青光眼的特征性損害，視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層缺損或視盤(pán)形態(tài)改變和/或視野出現(xiàn)青光眼性損害；②病理性高眼壓，眼壓＞21 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；③前房角開(kāi)放；④排除引起眼壓升高的其他因素，如眼外傷、葡萄膜炎、激素性青光眼、虹膜新生血管性青光眼等繼發(fā)性青光眼。如果雙眼眼壓＞22 mmHg，但無(wú)特征性視盤(pán)損害或視野損害的受試者被診斷為高眼壓癥（ocular hypertension，OHT）。正常對(duì)照組為100例健康人，均排除青光眼及其他相關(guān)性遺傳性疾病。對(duì)所有參與研究的家系成員均行全面的眼科檢查，包括視力、眼壓、裂隙燈顯微鏡、房角、眼底、視野、視神經(jīng)纖維層厚度分析。該研究方案經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬眼科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2019006號(hào)），根據(jù)“赫爾辛基宣言”的原則，在解釋了研究的性質(zhì)和可能的后果后，從研究對(duì)象那里獲得了知情同意，所有滿(mǎn)18周歲參與研究人員及未成年人監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 家系病歷采集

采用橫斷面研究方法，收集江蘇南京地區(qū)一POAG家系，從先證者出發(fā)，追溯親緣關(guān)系，繪制家系圖譜，對(duì)發(fā)病者和未發(fā)病者進(jìn)行詳細(xì)的病史采集，包括既往史、治療史，對(duì)參與研究的家系成員進(jìn)行全面的眼科檢查，包括視力、眼壓、裂隙燈、裂隙燈下眼底檢查、視野、視神經(jīng)光學(xué)相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）等檢查。

1.2.2 基因組提取

對(duì)參與研究的家系成員及正常對(duì)照組100例健康人采集外周靜脈血2～5 mL（EDTA抗凝）。使用血液基因組DNA提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）提取樣本DNA，使用Nanodrop 2000對(duì)DNA進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 高通量測(cè)序

使用標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)構(gòu)建試劑盒（北京邁基諾自主研發(fā)）進(jìn)行基因組文庫(kù)構(gòu)建。用Covaris-S220超聲波打斷儀將基因組DNA隨機(jī)打斷成100～700 bp的片段，末端修復(fù)加堿基A，與Illumina PE接頭寡核苷酸混合物連接，用磁珠法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化。對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增純化后得到DNA文庫(kù)，使用Nanodrop 2000和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

本研究采用目標(biāo)序列捕獲探針GenCap（北京邁基諾）對(duì)先證者已知的遺傳性青光眼疾病相關(guān)候選基因外顯子區(qū)域進(jìn)行捕獲。將構(gòu)建好的基因組文庫(kù)與經(jīng)過(guò)生物素標(biāo)記的目標(biāo)區(qū)域捕獲探針進(jìn)行雜交，用鏈霉親和素修飾的磁珠共價(jià)結(jié)合生物素標(biāo)記的探針，從而抓取目的基因，最后用磁力架吸附攜帶目的基因的磁珠，洗脫純化，富集目標(biāo)區(qū)域DNA片段。借助Illumina HiSeq X Ten測(cè)序儀對(duì)捕獲的外顯子區(qū)域進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

將原始測(cè)序數(shù)據(jù)去除污染和接頭序列，然后利用BWA軟件將過(guò)濾后的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)人類(lèi)基因組參考序列比對(duì)。利用GATK軟件分析得出單核苷酸變異（SNP）和插入缺失突變（INDEL）的相關(guān)信息。通過(guò)ANNOVAR軟件對(duì)所有的SNP和INDEL進(jìn)行注釋。篩選正常人數(shù)據(jù)庫(kù)中頻率小于0.05的突變位點(diǎn)，正常人數(shù)據(jù)庫(kù)包括千人基因組計(jì)劃和EXAC等。錯(cuò)義突變使用REVEL、SIFT、PolyPhen-2、Mutation Taster和GERP++等軟件進(jìn)行致病性預(yù)測(cè)和保守性預(yù)測(cè)，剪切位點(diǎn)的改變用SPIDEX等軟件分析其致病性。結(jié)合疾病遺傳模式和患者臨床表征進(jìn)行綜合分析，篩選出可疑候選變異。

1.2.5 Sanger測(cè)序驗(yàn)證候選致病基因

在除先證者以外參與研究的家系成員及對(duì)照組100例健康人中，利用PCR和Sanger測(cè)序驗(yàn)證經(jīng)分析篩選后，得到候選變異位點(diǎn)。利用Primer 3.0在線軟件設(shè)計(jì)PCR引物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用3130XL測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序并在ABI 3130 Genetic Analyzer上進(jìn)行分析。再將測(cè)序結(jié)果在家系成員中進(jìn)行共分離驗(yàn)證，觀察是否有與突變位點(diǎn)相一致的基因與表型共分離現(xiàn)象。

2 結(jié)果

2.1 POAG家系系譜結(jié)構(gòu)

該P(yáng)OAG家系共6代55例成員（圖1），其中男27例，女28例。參加本研究的家系成員共3代27例，其中男15例，女12例（表1）。參與研究的家系成員中12例為POAG患者，3例為無(wú)癥狀攜帶者，12例為無(wú)明顯體征者，不存在性別差異，且疾病以垂直方式逐代遺傳，遺傳方式符合常染色體顯性遺傳。

2.2 家系成員的臨床表現(xiàn)

2.2.1 Ⅱ2分支家系調(diào)查

Ⅱ2分支家系中，因Ⅲ1、Ⅲ2分支現(xiàn)定居于蘇州地區(qū)，未能對(duì)其進(jìn)行臨床和實(shí)驗(yàn)室相關(guān)檢查，但電話聯(lián)系并結(jié)合其他近親屬提供的病史，此分支中Ⅲ1分支無(wú)青光眼患者，Ⅲ2、Ⅳ2系青光眼患者，Ⅴ2具體病史不詳。Ⅲ3分支中，已行手術(shù)治療3例（Ⅲ3、Ⅳ4、Ⅳ5），已行選擇性激光小梁成形術(shù)（selective laser trabeculoplasty，SLT）治療2例（Ⅳ6、Ⅴ4），所有手術(shù)及SLT治療患者術(shù)后眼壓均平穩(wěn)，未行藥物控制眼壓。Ⅴ5未檢測(cè)到基因變異，Ⅴ6檢測(cè)出p.C245Y變異基因，由于其年齡較小，我們推測(cè)其將來(lái)有發(fā)展為開(kāi)角型青光眼的可能，需定期隨訪視力、眼壓、視野、視神經(jīng)纖維層厚度。Ⅲ4未行抗青光眼及任何激光治療，32歲確診為POAG時(shí)已雙眼失明，視力僅存眼前數(shù)指，后未采取手術(shù)治療，現(xiàn)長(zhǎng)期局部藥物控制眼壓，我們推測(cè)該患者發(fā)病年齡更早。Ⅳ831歲時(shí)已先后行雙眼抗青光眼手術(shù)，現(xiàn)術(shù)后未用藥物，監(jiān)測(cè)眼壓穩(wěn)定。此分支家系中所有青光眼患者均檢測(cè)出p.C245Y變異基因，Ⅴ8檢測(cè)到變異，但因年幼，暫無(wú)明顯體征，仍需密切觀察。

2.2.2 Ⅱ3分支家系調(diào)查

此分支家系中POAG患者共8例（Ⅱ3、Ⅲ5、7、8、9、Ⅳ10、16、17）。先證者Ⅳ1721歲發(fā)病，手術(shù)時(shí)右眼視力喪失明顯，視野檢測(cè)不出，雙眼視神經(jīng)萎縮，杯盤(pán)比接近1.0，左眼視野缺損，雙眼視盤(pán)血管OCT，提示雙眼視盤(pán)神經(jīng)纖維層厚度較正常變薄，雙眼視盤(pán)周邊血流密度較正常降低（圖2）。其母Ⅲ8雙眼手術(shù)后16年，確診年齡為38歲。Ⅲ5雙眼手術(shù)后25年，具體發(fā)病年齡無(wú)法提供。Ⅳ10雙眼術(shù)后23年，可見(jiàn)結(jié)膜下功能性濾過(guò)泡（圖3）。Ⅲ6家系分支中無(wú)1例患者。Ⅲ7現(xiàn)年58歲，雙眼術(shù)后20年，其子Ⅳ16現(xiàn)年35歲，31歲時(shí)確診雙眼POAG，現(xiàn)藥物控制眼壓平穩(wěn)。Ⅲ930歲確診雙眼POAG，多藥聯(lián)合藥物控制眼壓不佳，2年前行雙眼抗青光眼手術(shù)治療，現(xiàn)術(shù)后單藥控制眼壓，隨訪眼壓穩(wěn)定。

圖1 POAG家系圖譜

表1 家系成員的基因型和臨床資料

2.3 家系成員MYOC基因DNA序列結(jié)果

2.3.1 MYOC基因突變C245Y

圖2 先證者視神經(jīng)血管OCT檢查

在先證者的DNA樣本中發(fā)現(xiàn)1個(gè)位于MYOC基因的第3外顯子雜合突變：734號(hào)核苷酸由鳥(niǎo)嘌呤G變?yōu)橄汆堰蔄（c.734G＞A）的雜合突變，導(dǎo)致第245號(hào)氨基酸由半胱氨酸變?yōu)槔野彼幔╬.C245Y），見(jiàn)圖4。Sanger法對(duì)27例家系成員的DNA樣本測(cè)序，結(jié)果顯示該家系除先證者以外的11個(gè)家系成員患者中（Ⅲ3、4、5、8、9、Ⅳ4、5、6、8、10、Ⅴ4、6、8），MYOC基因第3外顯子均存在雜合突變c.734G＞A（p.C245Y），而家系中表型正常者無(wú)此突變，符合家系共分離，故MYOC基因c.734G＞A（p.C245Y）突變是該家系致病突變位點(diǎn)，家系成員中所有突變攜帶者均為雜合子。

2.3.2 MYOC基因突變C245Y與臨床表型的關(guān)系

在15位攜帶該突變的家系成員中（表1），12例為POAG患者，男性6例，女性6例，年齡22～73歲（平均47.8歲）。確診年齡22～36歲，平均29.1歲，目前9例已行濾過(guò)手術(shù)，2例已行SLT治療，1例藥物控制眼壓。無(wú)MYOC基因C245Y突變的家系成員臨床檢查均正常。

2.3.3 對(duì)照組人群MYOC基因突變C245Y篩選結(jié)果

在100例對(duì)照人群及家系成員中，未發(fā)現(xiàn)該突變攜帶者。

圖3 球結(jié)膜濾過(guò)泡

3 討論

MYOC是位于染色體1q23～24上的一個(gè)編碼myoclin的第3外顯子基因，它在眼球的部分結(jié)構(gòu)中高度表達(dá)，特別是小梁網(wǎng)結(jié)構(gòu)，myoclin包含幾個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，其中已有研究證實(shí)myoclin嗅素結(jié)構(gòu)域的突變會(huì)導(dǎo)致小梁網(wǎng)細(xì)胞損傷和功能障礙，從而導(dǎo)致房水流出受損和眼壓升高［5，7，9-10］。迄今發(fā)現(xiàn)至少有70多個(gè)MYOC基因突變位點(diǎn)與POAG發(fā)病有關(guān)，且第3外顯子為突變熱點(diǎn)區(qū)域，約有80%以上突變位于第3外顯子［11-12］。

本研究采用目標(biāo)序列捕獲測(cè)序及一代測(cè)序家系驗(yàn)證的方法，對(duì)1個(gè)POAG家系進(jìn)行了分子遺傳學(xué)的研究，從圖1可以看出Ⅱ2、Ⅱ3分支中POAG的遺傳方式符合常染色體顯性遺傳，這與既往報(bào)道的MYOC基因突變所致青光眼的遺傳規(guī)律相同。除此之外此家系還有以下特點(diǎn)：①此家系中MYOC基因C245Y突變與臨床表型有極強(qiáng)的相關(guān)性，參與本研究的受檢成員中，所有的青光眼患者都帶有此突變，而在無(wú)突變的家系成員中未發(fā)現(xiàn)青光眼患者及可疑者，說(shuō)明此突變與此家系中POAG的發(fā)生有非常緊密的聯(lián)系。②MYOC基因C245Y突變有很高的外顯率，在攜帶該突變的家系成員中年齡＞22歲者全部患有青光眼，外顯率為100%，該家系中年幼的基因突變攜帶者極有可能隨著年齡的增長(zhǎng)在今后發(fā)病，應(yīng)當(dāng)定期隨訪。③正常對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)MYOC基因C245Y突變。

本研究中C245Y基因突變的臨床表型表現(xiàn)為混合年齡發(fā)病型POAG。myoclin基因突變可能導(dǎo)致JOAG或POAG［13］，兩者除發(fā)病年齡不同外其余臨床表現(xiàn)相似。已有研究認(rèn)為發(fā)病年齡＜35歲者為JOAG，發(fā)病年齡＞35歲者為成年人型POAG［14］，本研究參與研究的家系成員中POAG患者的發(fā)病年齡22～39歲不等，35歲以上3例，此3例（Ⅲ3、Ⅲ5、Ⅲ8）均為雙眼抗青光眼術(shù)后，均無(wú)法提供具體發(fā)病年齡，由于手術(shù)時(shí)視力均已損傷嚴(yán)重并已出現(xiàn)明顯的視神經(jīng)萎縮和視野缺損，我們推斷，此3例家系成員的發(fā)病年齡更早，其余9例發(fā)病年齡均在35歲以下，提示此家系MYOC基因突變所致的POAG大部分為青少年型，且已有研究證明第3外顯子的MYOC基因突變與青少年起病的POAG有相關(guān)性［4，15］，本文研究結(jié)果與既往研究結(jié)果表現(xiàn)一致。

截至目前，被人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（HGMD）收錄的MYOC基因的致病突變位點(diǎn)已達(dá)146個(gè)（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=PAX6），此前Fan等［4］曾報(bào)道此突變?yōu)镻OAG的致病突變，但由于報(bào)道中的家系小，患者相對(duì)較少，本研究中的家系分支廣，參與研究的患者較多，基因突變與POAG的致病關(guān)聯(lián)性明確，且為中國(guó)江蘇地區(qū)首次報(bào)道，本研究結(jié)果擴(kuò)大了中國(guó)江蘇地區(qū)MYOC基因的突變譜，為更好地診斷和治療POAG提供了理論依據(jù)。

基因突變導(dǎo)致的POAG需用分子生物學(xué)方法進(jìn)行確診，且POAG發(fā)病隱匿，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療、降低致盲率仍然是個(gè)難題，且已有文獻(xiàn)證明，基因型和表型信息可能是預(yù)測(cè)疾病風(fēng)險(xiǎn)的有效價(jià)值來(lái)源［16］，MYOC突變的基因篩查應(yīng)該集中在家族性而不是散發(fā)的POAG患者［17］。因此，通過(guò)家族史的詢(xún)問(wèn)可幫助我們確立高危人群以便進(jìn)行高效的突變篩查，對(duì)于突變陽(yáng)性的無(wú)癥狀人群應(yīng)持續(xù)追蹤觀察，以便早發(fā)現(xiàn)、早治療，降低致青光眼的致盲率，并為將來(lái)的基因分子治療等提供重要依據(jù)。