耿 姝，熊修琦，李芳果，邵 穎，殷冬冬，涂 健，宋祥軍，祁克宗

(安徽農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036)

當前，抗生素濫用導致耐藥菌的產(chǎn)生及抗生素殘留等問題，通過食物鏈關(guān)系間接危害人類健康，因此，尋找理想的替抗物質(zhì)成為當今科研界的焦點之一。陽離子抗菌肽是機體廣泛分布的一種廣譜抑菌多肽，是宿主免疫系統(tǒng)發(fā)揮防御作用的重要物質(zhì)，其中包括細菌素、防御素等。其中，由β-防御素(AvBDs)構(gòu)成的非氧化機制在家禽體內(nèi)占據(jù)主要地位[1]，能有效殺滅細菌、真菌、病毒等病原體，具有廣譜抗微生物活性，在啟動機體天然免疫系統(tǒng)抵御外來病原入侵起到重要作用[2-3]，有望作為新一類替抗物質(zhì)發(fā)揮重大價值。

AvBDs在雞體內(nèi)共編碼14種類型，依次被命名為AvBD1～AvBD14[4-5]，其中關(guān)于AvBD2的相關(guān)資料表明，該防御素在雞骨髓與脾臟器官中表達量略高，推測AvBD2在機體天然免疫與被動免疫方面發(fā)揮重要作用[6]。有文獻表明，AvBD2能夠有效抑制大腸桿菌和李氏桿菌的增殖[7]。防御素以其獨特的殺菌機制優(yōu)于傳統(tǒng)抗生素。傳統(tǒng)抗生素通常是通過干擾細菌體內(nèi)各種代謝反應達到殺滅細菌的目的，因而易造成細菌產(chǎn)生耐藥性[8]。而AvBD2主要靶向病原體的細胞膜，產(chǎn)生破壞效果造成膜穿孔，使胞內(nèi)容物溢出胞外引起細胞死亡，達到抑菌效果[9-11]。因此，AvBD2有望作為新型替抗產(chǎn)品在綠色養(yǎng)殖與提高畜產(chǎn)品質(zhì)量方面發(fā)揮重要功能。

本研究應用慢病毒表達系統(tǒng)，構(gòu)建重組真核質(zhì)粒pLOV-eGFP-AvBD2，篩選得到穩(wěn)定表達AvBD2蛋白的細胞系，用其細胞分泌產(chǎn)物培養(yǎng)耐藥菌株，檢測抑菌活性。該細胞系的建立為抗生素替代品的開發(fā)提供了新思路，同時也為后續(xù)探討AvBD2相關(guān)生物學作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細胞、質(zhì)粒和菌株

感受態(tài)細胞DH5α購于擎科生物科技公司；pET-32a-AvBD2質(zhì)粒、293T細胞、DF-1細胞、AvBD2抗體均由獸醫(yī)病理生物學與疫病防控安徽省重點實驗室保存；慢病毒載體系統(tǒng)pLOV-CMV-eGFP-EF1a-PuroR、包裝質(zhì)粒pSPAX2、外膜質(zhì)粒pMD2.G由上海獸醫(yī)研究所劉光清老師惠贈；禽致病性大腸桿菌AH-25由本實驗室分離鑒定并保存，該菌株對氨芐西林、頭孢噻肟、氯霉素、強力霉素、卡那霉素和氟苯尼考耐藥。

1.2 主要試劑與抗體

Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑、ECL發(fā)光試劑盒、RNA抽提試劑盒及嘌呤霉素均購自碧云天公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購于天根生化科技公司；膠回收試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Thermo Fisher公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記兔抗鼠IgG購于武漢博士德公司；M-MLV、ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit購自諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 重組真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 參考GenBank中禽類AvBD2基因序列(登錄號XM_015285091.2)，應用同源重組酶設計方法設計引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequence of primer

以本實驗室保存的pET-32a-AvBD2質(zhì)粒為模板，AvBD2-F/R為引物，擴增AvBD2基因；以pLOV-CMV-eGFP-EF1a-PuroR載體為模板，pLOV-eGFP-F/R為引物，將載體線性化，按照同源重組方法將帶有同源臂的AvBD2基因與線性化載體進行同源重組，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α細胞，將PCR鑒定陽性菌液進行DNA序列測定，獲得正確的重組表達質(zhì)粒pLOV-eGFP-AvBD2。

1.3.2 重組慢病毒的包裝 慢病毒包裝步驟參照文獻[12]。

1.3.3 嘌呤霉素工作濃度的確定 嘌呤霉素工作濃度的篩選參照文獻[13]。

1.3.4 慢病毒介導DF-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的篩選 待DF-1細胞培養(yǎng)密度約80%左右，使用1.3.2獲得的重組慢病毒進行感染，感染24 h后，重復感染1次。在細胞培養(yǎng)液中加入1 μg/mL嘌呤霉素進行篩選；間隔1 d更換培養(yǎng)液，對陽性細胞加壓篩選3代后，即可得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AvBD2的細胞系，命名為DF-1-AvBD2。

1.3.5AvBD2基因組mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測 收取第20代DF-1-AvBD2細胞，抽提細胞RNA并合成cDNA。以cDNA為模板，以AvBD2-F1/R1為引物進行PCR驗證，添加空白對照與陰性對照，檢測mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

1.3.6 DF-1-AvBD2細胞系傳代穩(wěn)定性檢測 收集第20代DF-1-AvBD2細胞上清液，將蛋白樣品及對照組樣品處理進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗以1∶500比例稀釋，37 ℃孵育1 h，TBST清洗后，二抗選擇HRP標記的IgG，室溫孵育后利用ECL顯色。

1.3.7 DF-1細胞中AvBD2蛋白抑菌效果檢測 收集穩(wěn)定表達AvBD2蛋白細胞系的培養(yǎng)上清液為試驗組，測定其蛋白濃度為32.37 mg/L。藥物組為左氧氟沙星(濃度為5 mg/mL)，對照組為轉(zhuǎn)染空載體的細胞培養(yǎng)上清液，調(diào)整耐藥大腸桿菌菌數(shù)為1×104cfu/mL組，取10 μL菌液分別加入試驗組和對照組的培養(yǎng)液中，于600 nm波長下，讀取37 ℃培養(yǎng)不同時間的吸光數(shù)值。計算耐藥大腸桿菌的存活率，設置重復試驗，進行數(shù)據(jù)分析。

培養(yǎng)AH-25菌株至對數(shù)期，調(diào)整其菌數(shù)為1×104cfu/mL，參照文獻[14]，制備掃描電鏡樣品，觀察細菌狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pLOV-eGFP-AvBD2的構(gòu)建

以pET-32a-AvBD2質(zhì)粒為擴增模板，AvBD2-F/R為上下游引物，經(jīng)PCR擴增AvBD2基因，結(jié)果顯示，在約100 bp處出現(xiàn)與預計相符的條帶。對載體進行反向PCR擴增，結(jié)果顯示，在約8 000 bp處存在目的條帶，符合預期片段大小(圖1)。同時公司測定序列正確，即AvBD2基因片段已正確插入表達載體pLOV-CMV-eGFP-EF1a-PuroR中。

2.2 嘌呤霉素最適濃度篩選

細胞培養(yǎng)液中添加不同濃度嘌呤霉素24 h后，DF-1-AvBD2細胞出現(xiàn)明顯的生長停滯。第3 天時細胞開始大量死亡。當?shù)?0天時，1 μg/mL組中僅有極少量細胞存活，而2，3，4，5 μg/mL組中細胞均死亡。因此，本試驗中，嘌呤霉素對DF-1-AvBD2細胞的最低致死濃度為2 μg/mL，因此，選擇1 μg/mL的嘌呤霉素濃度作為DF-1-AvBD2細胞的最適篩選濃度。

2.3 慢病毒介導DF-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的篩選結(jié)果

重組質(zhì)粒pLOV-eGFP-AvBD2與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞后，獲得重組慢病毒。慢病毒感染DF-1細胞并經(jīng)嘌呤霉素抗性連續(xù)篩選eGFP表達陽性的DF-1細胞3次，熒光顯微鏡觀察成功轉(zhuǎn)染的細胞呈現(xiàn)綠色熒光，將穩(wěn)定表達 AvBD2蛋白的單細胞克隆擴大培養(yǎng)，獲得DF-1-AvBD2細胞系(圖2)。

2.4 細胞基因組中AvBD2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測

提取第20代DF-1-AvBD2細胞中的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后以AvBD2-F1/R1為引物，經(jīng)RT-PCR鑒定AvBD2基因。結(jié)果表明，細胞系能檢測出AvBD2基因，而DF-1細胞中未檢測出(圖3)。從而表明，AvBD2基因能在DF-1-AvBD2細胞中轉(zhuǎn)錄成mRNA。

2.5 AvBD2蛋白在DF-1-AvBD2細胞系的表達

將DF-1-AvBD2細胞傳代至第20代，選取第20代的DF-1-AvBD2細胞系上清，Western Blot分析表達情況。結(jié)果顯示，空白組和陰性對照組細胞上清中未檢測到目的蛋白，而DF-1-AvBD2中可見條帶清晰的目的蛋白(圖4)。從而表明，AvBD2基因在DF-1-AvBD2細胞中傳遞20代依然能表達蛋白。

2.6 DF-1細胞中AvBD2蛋白抑菌效果的檢測

將細胞培養(yǎng)上清液添加至供試菌中培養(yǎng)，酶標儀讀取不同時間段吸光值，結(jié)果顯示，耐藥菌的存活率隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸降低，在第5 小時供試菌的存活率明顯低于50%，但作用6 h后，細菌存活率開始上升(圖5)，而藥物組在6 h，供試菌存活率未出現(xiàn)上升，即在一定時間范圍內(nèi)，AvBD2蛋白的抑菌效果與時間呈正比關(guān)系。掃描電鏡下觀察空白組菌體成短桿狀，較完整飽滿。而經(jīng)AvBD2蛋白作用6 h后的菌體出現(xiàn)明顯的損傷，細胞皺縮變形，表面凹凸不平(圖6)。抑菌曲線及電鏡結(jié)果共同證實，AvBD2蛋白能破壞AH-25菌株的細胞膜，推測AvBD2蛋白在抑制病原微生物的增殖方面能發(fā)揮獨特作用。

3 討論

近年來，我國主要采取集中養(yǎng)殖的家禽飼養(yǎng)模式，容易使家禽大范圍地感染疾病。為了降低養(yǎng)殖風險，抗生素被廣泛使用，造成了一系列生物安全問題。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2018年明確提出了減抗、限抗的時間安排表。因此，關(guān)于替抗、無殘留添加劑的研究成為當前畜牧養(yǎng)殖業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展的首要任務。防御素以廣譜殺菌活性、特殊的作用機理及調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)方面的優(yōu)勢，給人們展現(xiàn)了一條開發(fā)理想替抗產(chǎn)品的途徑。

然而防御素天然產(chǎn)量低，體外合成或從體內(nèi)提取步驟復雜、成本較高[15-16]。原核表達系統(tǒng)操作簡單，易于大量生產(chǎn)。石水琴等[17]構(gòu)建出AvBD2大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，其純化蛋白對多種病原菌具有較好的抗菌活性。但原核細胞不具備真核細胞特有的一些稀有密碼子，并且原核細胞的蛋白折疊系統(tǒng)缺少相應的分子伴侶、輔酶、輔基等，導致某些蛋白不能正常折疊，失去部分或全部該蛋白應有的功能[18]。王海霞[19]構(gòu)建出AvBD2畢赤酵母分泌表達系統(tǒng)，其表達上清對預防雛雞感染常見大腸桿菌病有良好的效果[20]。但真核酵母表達系統(tǒng)存在分泌產(chǎn)物不一致，表達的蛋白易降解及成本高昂等問題，極大地限制了畢赤酵母表達系統(tǒng)的應用。鑒于此，本研究采用慢病毒表達方式，有效解決了上述防御素獲取方式的弊端，使目的蛋白高效表達的同時，保證其天然活性。

慢病毒系統(tǒng)以其高效、穩(wěn)定、精準等特點成為目前細胞分子生物學研究常用的工具之一[21]。慢病毒可將其重組的目的基因插入宿主染色體中持續(xù)表達目的蛋白[22]。此外，慢病毒載體含有嘌呤霉素抗性便于細胞系的快速篩選[23]。已有研究表明，多種動物β-防御素基因均通過真核表達載體成功表達，且產(chǎn)物具有較好的天然活性。

本研究利用慢病毒構(gòu)建重組pLOV-eGFP-AvBD2穿梭載體，熒光觀察到細胞顆粒呈現(xiàn)綠色熒光，表明已成功包裝出具有活性的慢病毒顆粒，隨后進一步利用嘌呤霉素抗性進行篩選，通過在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測到AvBD2的表達，最終得到了可持續(xù)表達AvBD2蛋白的細胞系。在重組AvBD2抗菌活性檢測中，AvBD2蛋白對AH-25菌株具有抑制作用。耐藥菌的存活率隨著時間的延長而逐漸下降，出現(xiàn)一個作用的最佳時間點，但隨著時間的延長，該菌株的存活率又開始上升，表明AvBD2的抗菌效果同時間具有一定的相關(guān)性。本研究建立了可穩(wěn)定持續(xù)表達AvBD2蛋白的DF-1細胞系，該細胞系表達的重組蛋白不僅具有與天然AvBD2蛋白相似的功能，還可以應用于抗生素替代品的制備分析，進而為探討防御素后續(xù)的功能研究奠定基礎(chǔ)。