程偉能，南麗紅，張玉琴，賴文芳，陳亞萍，黃 枚

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）

腦卒中是一種由腦血管破裂或阻塞所引起的腦部血液循環(huán)障礙性疾病，據(jù)其發(fā)病機(jī)制不同可分為缺血性腦卒中及出血性腦卒中［1］，其中缺血性腦卒中是臨床最常見(jiàn)的腦卒中類型，約占腦卒中發(fā)生的70%～80%［2］。栝樓桂枝湯（GLGZD）出自《金匱要略》有補(bǔ)陰陽(yáng)，調(diào)氣血，養(yǎng)營(yíng)生津，柔潤(rùn)筋脈之功效，主治痙證［3］。現(xiàn)代臨床將該方用于腦卒中后肢體痙攣的康復(fù)治療，療效確切［4］。研究表明，腦卒中后肢體痙攣是由于上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷所致，而腦缺血后的持續(xù)炎癥反應(yīng)，可引起神經(jīng)元死亡，是導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙的關(guān)鍵因素［5］。小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦常駐免疫細(xì)胞，在神經(jīng)炎癥中扮演重要角色［6］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)GLGZD可通過(guò)多途徑抑制大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的缺血性凋亡，改善缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的病理狀態(tài)，減少腦梗死體積，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［7-9］，但作用機(jī)制尚未完全闡明。故本研究以小膠質(zhì)細(xì)胞極化為切入點(diǎn)，進(jìn)一步探索GLGZD緩解腦卒中后肢體痙攣的可能機(jī)制，為GLGZD的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量為（260±10）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司，許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0005，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為SYXK（閩）2019-0007。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 栝樓（北京本草方源藥業(yè)科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：190101）；白芍（廈門燕來(lái)福制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：180803）；桂枝（安徽孚眾藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：191101）；甘草（渭源衡順堂藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：006191217）；大棗（麻城九州中藥發(fā)展有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：E1910311206）；生姜購(gòu)買于福建承創(chuàng)堂藥店。

1.3 主要試劑 特超敏化學(xué)發(fā)光液（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；抗熒光淬滅劑（美國(guó)Vecta公司）；DAPI染液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；牛血清白蛋白（德國(guó)Biofroxx公司）；離子鈣結(jié)合銜接分子1（Iba1）一抗（美國(guó)Thermo Fisher公司）；精氨酸酶-1（Arg1）一抗（美國(guó)Affinity公司）；白細(xì)胞介素-4（IL-4）一抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；白細(xì)胞分化抗原86（CD86）一抗、白細(xì)胞介素-6（IL-6）一抗（武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司）；β-actin一抗、HRP二抗、核轉(zhuǎn)錄因子κBp65（NF-κBp65）一抗、兔熒光二抗、鼠熒光二抗（英國(guó)Abcam公司）；DAB顯色試劑盒、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷液、免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.4 主要儀器 PVDF膜（美國(guó)Millipore公司）；尼龍線栓（廣州佳靈生物技術(shù)有限公司）；石蠟切片機(jī)（美國(guó)ThermoFisher公司）；DM IL LED型倒置相差顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；SZ760型體視顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）；生物組織自動(dòng)脫水機(jī)、生物組織石蠟包埋機(jī)、生物組織攤烤機(jī)（湖北孝感宏業(yè)醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）。

2 方 法

2.1 GLGZD的制備 稱取栝樓30 g，桂枝9 g，白芍9 g，大棗9 g，生姜9 g，甘草6 g，置于2 000 mL圓底燒瓶中，加入10倍量飲用水，室溫浸泡30 min后加熱回流提取1.5 h。提取結(jié)束后用紗布過(guò)濾藥渣，再次加入8倍量的水并重復(fù)上述步驟。合并兩次濾液并濃縮至50 mL（藥物濃度為1.44 g／mL）。

2.2 造模、分組與給藥 將36只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組12只及造模組24只。造模組大鼠采用線栓法制備MCAO模型，術(shù)前禁食不禁水12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉（60 mg／kg）麻醉大鼠；將大鼠頸部中線開(kāi)一切口，鈍性分離直至暴露出頸總動(dòng)脈（CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）及頸外動(dòng)脈（ECA）；線栓從CCA插入直至栓塞大腦中動(dòng)脈，栓塞2 h后拔出部分線栓進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組除不栓塞大腦中動(dòng)脈，其余操作與上述一致。待大鼠完全清醒，參照改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（mNSS）［10］對(duì)大鼠的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、平衡及反射進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，mNSS評(píng)分在7～15分的大鼠為造模成功大鼠。將造模成功的大鼠按分層隨機(jī)原則分為模型組及GLGZD組，每組12只。各組大鼠均按1 mL／100 g體質(zhì)量灌服給藥，GLGZD組灌服1.44 g／mL的GLGZD（即14.4 g／kg，相當(dāng)于臨床人日用量的12倍），模型組及假手術(shù)組灌服蒸餾水，每天1次，連續(xù)7 d。

2.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分采用mNSS評(píng)分法，分別在給藥前及給藥后第3、5、7天對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能缺損情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.4 組織石蠟切片的制備 大鼠末次給藥2 h后，麻醉大鼠，用生理鹽水和4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注，以此除去組織內(nèi)的血液并對(duì)組織進(jìn)行初步固定。取腦并置于4%多聚甲醛固定24 h，用大鼠腦模具將大腦制成2 mm切片，并進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片。

2.5 免疫熒光法檢測(cè)缺血側(cè)大腦皮層分化抗原86／離子鈣結(jié)合銜接分子1（CD86／Iba1）及精氨酸酶-1／離子鈣結(jié)合銜接分子1（Arg1／Iba1）陽(yáng)性細(xì)胞率 石蠟切片常規(guī)脫蠟復(fù)水、抗原修復(fù)及封閉。滴加相應(yīng)的一抗（Iba1、CD86、Arg1稀釋比均為1∶300），4℃條件下孵育12 h。滴加二抗（兔熒光二抗、鼠熒光二抗稀釋比均為1∶500），孵育2 h。滴加DAPI孵育15 min。吸棄切片上殘留的液體并用抗熒光淬滅劑封片。各樣本于倒置熒光顯微鏡400倍鏡下隨機(jī)攝取5個(gè)視野，并采用Image J圖像分析軟件計(jì)算同一視野下各指標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞率（即紅色熒光、綠色熒光與藍(lán)色熒光重疊的細(xì)胞占綠色熒光與藍(lán)色熒光重疊的細(xì)胞的百分率）。

2.6 免疫組化法檢測(cè)缺血側(cè)大腦皮層白細(xì)胞介素-6（IL-6）及白細(xì)胞介素-4（IL-4）蛋白的表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟復(fù)水、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性、抗原修復(fù)及封閉。滴加相應(yīng)的一抗（IL-6、IL-4稀釋比均為1∶200），4℃條件下孵育12 h。滴加二抗，孵育2 h。滴加SABC，孵育1 h。DAB顯色，并用蘇木素復(fù)染，封片。各樣本于倒置熒光顯微鏡400倍鏡下隨機(jī)攝取5個(gè)視野，并采用Image J圖像分析軟件計(jì)算同一視野下各指標(biāo)蛋白表達(dá)（即棕黃色區(qū)域面積占圖片總面積的百分率）。

2.7 Western blot檢測(cè)缺血側(cè)大腦皮層核因子κBp65（NF-κBp65）蛋白的表達(dá) 大鼠末次給藥2 h后，立即處死大鼠并取缺血側(cè)大腦皮層組織。用裂解液提取組織中總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，加入上樣緩沖液制成蛋白樣品。制備SDS-PAGE凝膠，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，于4℃條件下孵育一抗（β-actin、NF-κBp65稀釋比均為1∶1 000）過(guò)夜。孵育HRP二抗（稀釋比均為1∶3 000）2 h，以特超敏ECL顯影液進(jìn)行顯影拍照。結(jié)果使用Image Lab 4.1軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析。本實(shí)驗(yàn)以β-actin為內(nèi)參，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量＝目的蛋白灰度值／β-actin灰度值，并參照假手術(shù)組對(duì)所得目的蛋白相對(duì)表達(dá)量的值進(jìn)行歸一化處理。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料屬正態(tài)分布的以表示，采用單因素方差分析，非正態(tài)分布的采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 3組大鼠mNSS評(píng)分比較 見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠mNSS評(píng)分比較（±s） 分

表1 3組大鼠mNSS評(píng)分比較（±s） 分

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

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3.2 3組大鼠缺血側(cè)大腦皮層CD86／Iba1及Arg1／Iba1陽(yáng)性細(xì)胞率比較 見(jiàn)圖1及圖2。

3.3 3組大鼠缺血側(cè)大腦皮層IL-6及IL-4蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)圖3及圖4。

3.4 3組大鼠缺血側(cè)大腦皮層NF-κBp65蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)圖5。

4 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用線栓法制備MCAO模型大鼠并用mNSS評(píng)分法對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠mNSS評(píng)分明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），提示造模成功。經(jīng)GLGZD干預(yù)后，GLGZD組大鼠mNSS評(píng)分在給藥后第3天、5天、7天與模型組比較均明顯降低（P＜0.05或0.01），提示GLGZD可顯著改善MCAO模型大鼠神經(jīng)功能缺損，對(duì)缺血性腦損傷具有較好的保護(hù)作用。

目前研究認(rèn)為，腦缺血后的急性炎性反應(yīng)是導(dǎo)致腦組織缺血損傷加劇的重要因素。而小膠質(zhì)細(xì)胞在腦卒中發(fā)生后，會(huì)迅速活化并被募集至病變部位，是啟動(dòng)腦缺血炎性反應(yīng)的關(guān)鍵［11］。研究表明，活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞有兩種極化表型，分別為M1表型（促炎型）及M2表型（抗炎型）。而M1型小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)炎癥反應(yīng)的核心，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞具有抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)組織修復(fù)等功能，在腦卒中后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能［12］。

圖1 3組大鼠缺血側(cè)大腦皮層CD86／Iba1陽(yáng)性細(xì)胞率比較（×400）

圖2 3組大鼠缺血側(cè)大腦皮層Arg1／Iba1陽(yáng)性細(xì)胞率比較（×400）

圖3 3組大鼠缺血側(cè)大腦皮層IL-6蛋白表達(dá)比較（×400）

圖4 3組大鼠缺血側(cè)大腦皮層IL-4蛋白表達(dá)比較（n＝6）

圖5 3組大鼠缺血側(cè)大腦皮層NF-κBp65蛋白表達(dá)比較

CD86是M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物，常被用來(lái)評(píng)估小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化情況。在缺血性腦損傷中，IL-6作為M1型小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的神經(jīng)炎癥因子之一，可導(dǎo)致神經(jīng)元進(jìn)一步受損［13］，通過(guò)檢測(cè)IL-6的表達(dá)，可反映M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的極化情況，評(píng)估大腦中的炎癥進(jìn)程。Arg1作為M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物［14］，在組織修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。IL-4是M2型小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的抗炎因子之一，能減輕腦缺血／再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)［15］，可用來(lái)評(píng)估M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的極化水平。本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光法將CD86、Arg1分別與小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba1共染，通過(guò)CD86、Arg1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與Iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比值來(lái)觀察活化小膠質(zhì)細(xì)胞的極化狀態(tài)；采用免疫組化法觀察大鼠缺血側(cè)大腦皮層IL-4、IL-6蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：模型組較假手術(shù)組M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)和IL-6的蛋白表達(dá)明顯增加，而M2型細(xì)胞數(shù)和IL-4的蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.01），提示腦缺血／再灌注損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨⑾騇1型轉(zhuǎn)化，介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)；GLGZD干預(yù)后能明顯減少M(fèi)1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)和IL-6的蛋白表達(dá)，增加M2型細(xì)胞數(shù)和IL-4的蛋白表達(dá)（P＜0.01），提示GLGZD可促進(jìn)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，從而減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)缺血性腦卒中后的康復(fù)。

NF-κB是炎癥反應(yīng)中發(fā)揮中心調(diào)控作用的關(guān)鍵因子，由p50和p65亞基組成，其中p65亞基在蛋白的C末端含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，可與胞核DNA上的κB序列結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，從而啟動(dòng)一系列基因的轉(zhuǎn)錄［16］，NF-κBp65的表達(dá)上調(diào)可促使小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化［17］。本實(shí)驗(yàn)采用Western blot檢測(cè)NF-κBp65蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，GLGZD能明顯減少缺血側(cè)大腦皮層中NF-κBp65蛋白表達(dá)水平（P＜0.01）。提示GLGZD可通過(guò)下調(diào)NF-κBp65蛋白的表達(dá)，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的極化，從而減輕腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，發(fā)揮治療作用。