馬倩穎，楊鳳，2，霍忠明，2，趙雯，閆喜武，2*

(1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023； 2.遼寧省貝類(lèi)良種繁育工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116023)

菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum是典型的埋棲貝類(lèi)，同時(shí)也是中國(guó)單種產(chǎn)量最高的埋棲型海水經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)[1]。目前，北方的蛤仔養(yǎng)殖苗種來(lái)自南方，由于南方苗種不耐低溫，在北方灘涂不能安全越冬，導(dǎo)致北方冬季大量灘涂閑置。菲律賓蛤仔“斑馬蛤2號(hào)”(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“Zebra 2”)是繼閆喜武等[2]培育出的第一個(gè)蛤仔新品種“斑馬蛤”后，從遼寧大連石河群體中選育的蛤仔新品系,其具有斑馬蛤的美觀花紋，同時(shí)還具有耐低鹽、低溫、高溫，抗逆性強(qiáng)，養(yǎng)殖存活率高的特點(diǎn)。目前，該研究團(tuán)隊(duì)已與中國(guó)南、北方企業(yè)合作，繁育新品系苗種73.39億粒，并在遼寧、山東、江蘇開(kāi)展了灘涂、池塘、淺海、浮筏4種模式的養(yǎng)殖應(yīng)用，合計(jì)148.37 hm2。 由于“Zebra 2”品系耐低溫，有望培育成適合在北方灘涂養(yǎng)殖的蛤仔新品種，因此，對(duì)其生態(tài)學(xué)進(jìn)行研究，對(duì)于蛤仔新品種的培育與推廣，以及充分利用北方灘涂，提高蛤仔生產(chǎn)效益具有重要的意義。

埋棲型貝類(lèi)養(yǎng)殖中，使苗種順利潛沙是該生態(tài)類(lèi)型貝類(lèi)養(yǎng)殖的關(guān)鍵技術(shù)之一。蛤仔苗種投放到海水中后，能否順利潛沙及潛沙速度的快慢是放養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。潛沙快的蛤仔就能快速轉(zhuǎn)入埋棲生活，潛沙慢則有可能被水流帶走或被敵害生物所捕食[3]。影響貝類(lèi)潛沙的因素眾多，目前有關(guān)埋棲貝類(lèi)潛沙的研究多集中在重金屬[4]、有毒有機(jī)污染物[5]、潛沙生理[6-7]及底質(zhì)[8-11]等方面。楊鳳等[3]研究了幾種環(huán)境因子和蛤仔規(guī)格對(duì)普通蛤仔潛沙的影響。養(yǎng)殖水體中pH和總氨態(tài)氮(TAN)是影響貝類(lèi)生長(zhǎng)存活的重要水質(zhì)指標(biāo)。無(wú)論在池塘養(yǎng)殖還是灘涂養(yǎng)殖中，TAN均為最易積累的有毒物質(zhì)，pH不僅直接影響貝類(lèi)的生存，還決定著TAN毒性的大小[12-13]。目前，關(guān)于pH和TAN 對(duì)蛤仔 “Zebra 2”品系潛沙的影響研究尚未見(jiàn)報(bào)道，為此，本研究中以極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的“Zebra 2”蛤仔幼貝為研究對(duì)象，探討了pH、TAN對(duì)“Zebra 2”蛤仔幼貝潛沙的影響，旨在為完善蛤仔“Zebra 2”潛沙行為學(xué)和健康養(yǎng)殖技術(shù)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

分別于2019年6月和8月進(jìn)行TAN和pH對(duì)“Zebra 2”幼貝潛沙的影響試驗(yàn)。試驗(yàn)用“Zebra 2”幼貝源自遼寧省貝類(lèi)良種繁育工程技術(shù)研究中心，殼長(zhǎng)為(4.78±0.60)mm，試驗(yàn)前在未鋪沙的水槽中以充分曝氣的新鮮海水暫養(yǎng)2 d。

試驗(yàn)用水為充氣曝氣的沙濾海水。試驗(yàn)用底質(zhì)泥沙取自大連莊河貝類(lèi)養(yǎng)殖場(chǎng)育苗場(chǎng)，經(jīng)0.35 mm篩絹網(wǎng)過(guò)濾后用于試驗(yàn)，泥沙中粒徑為0.106～0.420 mm的沙占96%，屬沙質(zhì)底質(zhì)，總有機(jī)碳的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.069%。

1.2 方法

試驗(yàn)均在3 L聚乙烯桶中進(jìn)行，桶底鋪5 cm 泥沙，試驗(yàn)用水為2 L，水深約15 cm。試驗(yàn)時(shí)隨機(jī)選取20個(gè)幼貝用于試驗(yàn)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。試驗(yàn)持續(xù)24 h，為防止底質(zhì)發(fā)生懸浮，影響潛沙的觀察，試驗(yàn)期間不充氣、不換水、不投餌。

1.2.1 TAN對(duì)幼貝潛沙的影響試驗(yàn) 以添加分析純氯化銨的方式，按等對(duì)數(shù)間距[14]設(shè)置8個(gè)TAN濃度組，實(shí)測(cè)TAN質(zhì)量濃度分別為(0.51±0.01)、(1.03±0.06)、(1.64±0.42)、(2.93±0.15)、(5.93± 0.40)、(12.30±1.26)、(28.00±8.07)、(54.90±13.30)mg/L，以不添加氯化銨的天然海水(TAN為0.12 mg/L±0.05 mg/L)為對(duì)照。試驗(yàn)期間，水溫為20.7 ℃，鹽度為29.0，pH為8.12，DO大于5.2 mg/L，亞硝酸鹽氮為(0.017±0.002)mg/L。試驗(yàn)從放入蛤仔后開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別記錄蛤仔潛沙的豎殼ET5(5% 的受試個(gè)體從幼貝落到泥沙表面至豎殼所用時(shí)間，又稱(chēng)潛沙準(zhǔn)備時(shí)間)、豎殼ET50(50% 的受試個(gè)體豎殼所用時(shí)間)、潛沙ET50(50%的受試個(gè)體完全潛入底質(zhì)中所用時(shí)間)和潛沙ET100(100% 的受試個(gè)體完全潛沙所用時(shí)間)，潛沙ET100的測(cè)定于試驗(yàn)開(kāi)始后4 h內(nèi)完成，其后在24 h記錄潛沙數(shù)量，計(jì)算24 h時(shí)的潛沙率(%)。

潛沙率=(試驗(yàn)結(jié)束時(shí)完全潛沙的蛤仔數(shù)量/受試蛤仔數(shù)量)×100%，

校正潛沙率=(各試驗(yàn)組潛沙率/對(duì)照組潛沙率)×100%。

1.2.2 pH對(duì)幼貝潛沙的影響試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)置9個(gè)pH組，用40 g/L NaCl溶液與體積分?jǐn)?shù)為10%的濃鹽酸調(diào)節(jié)pH。實(shí)測(cè)pH值分別為7.00±0.21、7.31±0.23、7.55±0.17、7.77±0.09、8.15±0.06(不調(diào)pH的天然海水對(duì)照)、8.27±0.03、8.54±0.07、8.81±0.09、9.09±0.12。試驗(yàn)期間，水溫為27.1 ℃，鹽度為22.8，TAN為(0.11±0.05)mg/L，亞硝酸鹽氮為(0.05±0.00)mg/L，DO大于8.2 mg/L，其他試驗(yàn)過(guò)程及測(cè)定指標(biāo)同“1.2.1節(jié)”。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，采用TUKEY法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。通過(guò)多重比較確定最大允許毒物濃度(MATC)的范圍，定義為在對(duì)受試生物無(wú)統(tǒng)計(jì)顯著性有害效應(yīng)的毒物最高濃度與鄰近的對(duì)受試生物有統(tǒng)計(jì)顯著性有害效應(yīng)的毒物最低濃度之間，即在最大無(wú)效應(yīng)濃度和最小有效應(yīng)濃度之間[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同TAN質(zhì)量濃度下幼貝的潛沙情況

2.1.1 潛沙速度 從表1可見(jiàn)：在設(shè)定的TAN質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(0.51～54.90 mg/L)，幼貝的豎殼ET5無(wú)明顯的變化規(guī)律，各濃度組及對(duì)照組豎殼ET5間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；豎殼ET50和潛沙ET50具有相同的變化趨勢(shì)，均以最高TAN質(zhì)量濃度組(54.90 mg/L)數(shù)值最大，分別為10.33、13.33 min。多重比較結(jié)果表明， 54.90 mg/L組豎殼ET50和潛沙ET50與對(duì)照組及其余各濃度組間有顯著性差異(P<0.05)，其余各TAN質(zhì)量濃度組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，最大毒物允許濃度(MATC)為28.00～54.90 mg/L。ρ(TAN)≤12.30 mg/L的各試驗(yàn)組均能100%潛沙；潛沙ET100以對(duì)照組用時(shí)最短(33.33 min)，其后隨TAN質(zhì)量濃度增加，潛沙ET100呈增大趨勢(shì)；TAN對(duì)潛沙ET100的MATC為0.51～1.03 mg/L。在試驗(yàn)開(kāi)始后4 h內(nèi)，可觀察到28.00、54.90 mg/L兩處理組中部分幼貝進(jìn)出水管和足伸出，不能100%潛沙，潛沙率分別為41.7%和11.7%(圖1)。

表1 4 h內(nèi)不同TAN質(zhì)量濃度對(duì)“Zebra 2”蛤仔幼貝潛沙時(shí)間的影響

標(biāo)有不同字母者表示同一時(shí)間不同質(zhì)量濃度組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；*表明同一濃度下，不同時(shí)間點(diǎn)存在顯著性差異(P<0.05)。The means with different letters within the same time are significantly different in the mass concentration groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences；*indicates that there are significant differences at different time points at the same concentration(P<0.05).圖1 不同TAN質(zhì)量濃度下“Zebra 2”的校正潛沙率Fig.1 Corrected burrowing rate of“Zebra 2” under different TAN concentrations

2.1.2 4、24 h的潛沙率 從圖1可見(jiàn)：ρ(TAN)≤5.93 mg/L時(shí)，各處理組24 h的潛沙率均與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)；ρ(TAN)≥12.30 mg/L時(shí)各組潛沙率與對(duì)照組(0.12 mg/L)存在顯著性差異(P<0.05)，且隨著TAN質(zhì)量濃度的增加潛沙率下降，而TAN質(zhì)量濃度為12.30、28.00、54.90 mg/L組的潛沙率依次為對(duì)照組的73.6%、37.7%、32.1%；24 h潛沙率的MATC為5.93～12.30 mg/L。

回歸分析表明，24 h校正潛沙率(y)與TAN濃度對(duì)數(shù)(x)符合多項(xiàng)式關(guān)系，且呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)(圖2)，由回歸方程y=-14.446x2-12.358x+95.947(R2=0.936 7)求得，使24 h潛沙率下降5%的TAN有效質(zhì)量濃度24 h EC5為0.373 mg/L(非離子氨質(zhì)量濃度為0.016 mg/L)，使24 h潛沙率下降50%的TAN有效質(zhì)量濃度24 h EC50為25.50 mg/L(非離子氨質(zhì)量濃度為1.09 mg/L)。除54.90 mg/L組外，其他試驗(yàn)組24 h的潛沙率均低于4 h的潛沙率，統(tǒng)計(jì)分析表明，ρ(TAN)≤12.3 mg/L時(shí)，4 h與24 h潛沙率間有顯著性差異(P<0.05)，ρ(TAN)≥28.00 mg/L時(shí)，4 h與24 h潛沙率間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，這說(shuō)明隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，TAN對(duì)潛沙率的負(fù)面影響逐漸增大。

圖2 TAN質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)與“Zebra 2”24 h潛沙率的關(guān)系Fig.2 Relationship between logarithm of TAN concentration and 24 h burrowing rate of “Zebra 2”

2.2 不同pH條件下幼貝的潛沙情況

2.2.1 潛沙速度 從表2可見(jiàn)：在pH 7.00～9.09條件下，蛤仔“Zebra 2”幼貝在試驗(yàn)開(kāi)始后4 h內(nèi)均能100%潛沙，其中幼貝的豎殼ET5隨pH的變化無(wú)明顯的變化規(guī)律，各試驗(yàn)組豎殼ET5與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，對(duì)豎殼ET5無(wú)影響的pH 范圍為7.00～9.09；當(dāng)pH由對(duì)照組pH(天然水，8.15)向偏酸方向突變時(shí)，豎殼ET50隨pH的降低而增大，當(dāng)pH由對(duì)照組pH向偏堿方向突變時(shí)，豎殼ET50無(wú)明顯的變化規(guī)律，以pH 8.81組用時(shí)最短(1.67 min)，其次為pH 8.15對(duì)照組(2.00 min)，pH 7.00組用時(shí)最長(zhǎng)(9.67 min)，pH 7.00、pH 7.31組ET50顯著慢于對(duì)照組及pH 8.81組(P<0.05)，其余各組與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，對(duì)豎殼ET50無(wú)影響的pH范圍為7.55～9.09；潛沙ET50的變化規(guī)律與豎殼ET50相同，其中，對(duì)照組(pH 8.15)用時(shí)最短(2.67 min)，pH 7.00組用時(shí)最長(zhǎng)(10.67 min)，且兩者有顯著性差異(P<0.05)，其余各組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，對(duì)潛沙ET50無(wú)影響的pH范圍為7.31～9.09；潛沙ET100以對(duì)照組(pH 8.15)用時(shí)最短(9.00 min)，且以對(duì)照組為中心，隨著pH向兩側(cè)遞變，ET100呈逐漸增大的趨勢(shì)，其中，pH 7.00、8.54、8.81、9.09組與對(duì)照組比較用時(shí)明顯延長(zhǎng)，且均有顯著性差異(P<0.05)，其余各組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，對(duì)潛沙ET100無(wú)影響的pH范圍為7.31～8.27。

表2 4 h內(nèi)不同pH對(duì)“Zebra 2”幼貝潛沙時(shí)間的影響

2.2.2 24 h幼貝的潛沙率 從圖3可見(jiàn),各試驗(yàn)組潛沙率與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖3 不同pH條件下“Zebra 2”幼貝的24 h潛沙率Fig.3 24 h burrowing rate of “Zebra 2” juveniles at different pH values

3 討論

3.1 “Zebra 2”幼貝的潛沙能力

“Zebra 2”是從普通蛤仔北方群體中選育出的新品系，具有抗逆性強(qiáng)、耐低溫、適合在北方沿海養(yǎng)殖等特點(diǎn)。潛沙能力是蛤仔生存的一個(gè)基本特征，本研究中分析TAN和pH兩個(gè)試驗(yàn)中對(duì)照組“Zebra 2”幼貝的潛沙情況(表1、表2)，在水溫為20.7～27.1 ℃，pH為8.12～8.15，鹽度為22.8～29.0條件下(表3)，幼貝潛沙準(zhǔn)備時(shí)間(ET5)一般為1.00～1.67 min，半數(shù)豎殼時(shí)間(豎殼ET50)為2.0～3.5 min，半數(shù)潛沙時(shí)間(潛沙ET50)為2.67～5.50 min，完全潛沙時(shí)間(ET100)為9.00～33.33 min。

表3 “Zebra 2”幼貝與普通蛤仔幼貝4 h內(nèi)的潛沙狀況比較Tab.3 Comparison of burrowing performance between “Zebra 2” juveniles and common Manila clam juveniles in 4 h

受試驗(yàn)條件的限制，本研究中未進(jìn)行普通蛤仔與“Zebra 2”的潛沙比較試驗(yàn)，有研究表明，普通蛤仔幼貝(6～12 mm)的潛沙受水溫、鹽度、pH、規(guī)格、水流速度等的影響[3]。溫度升高，潛沙速度加快，規(guī)格增大潛沙速度加快。溫度為15 ℃、pH為8.0條件下，6 mm的蛤仔幼貝2～3 min開(kāi)始潛沙，5～6 min有半數(shù)潛沙，12～13 min全部潛沙[3]。考慮到溫度和規(guī)格的影響，與相近規(guī)格普通蛤仔(6 mm)比較，4.78 mm的“Zebra 2”幼貝的潛沙速度并未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。

一些學(xué)者就魁蚶[16]、毛蚶[17]、青蛤[18]、文蛤[18]等埋棲貝類(lèi)的潛沙行為進(jìn)行了研究，但由于試驗(yàn)條件、受試生物的規(guī)格與發(fā)育階段的不同等，較難相互比較。

3.2 TAN對(duì)“Zebra 2”幼貝潛沙的影響

本研究中，分析TAN對(duì)幼貝潛沙速度的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ρ(TAN)≤28.00 mg/L時(shí)，對(duì)豎殼ET5、豎殼ET50和潛沙ET50均無(wú)明顯影響，但隨著TAN質(zhì)量濃度的增加ET100增大，即100%潛沙的時(shí)間延長(zhǎng)(表1)，如對(duì)照組平均用時(shí)33.33 min就全部潛沙，5.93 mg/L TAN質(zhì)量濃度組則用時(shí)142.00 min左右，而兩個(gè)高TAN濃度組(28.00、54.90 mg/L)至試驗(yàn)開(kāi)始后4 h，許多幼貝水管與足全部伸張，不能潛沙，且濃度越高越明顯。

“Zebra 2”潛沙率的4 h MATC為12.30～28.00 mg/L，24 h MATC為5.93～12.30 mg/L，且除最高TAN濃度組(54.90 mg/L)外，各個(gè)試驗(yàn)組的24 h潛沙率均低于4 h潛沙率，表明隨著TAN質(zhì)量濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，幼貝的潛沙率下降。54.90 mg/L組的4 h潛沙率為11.7%，低于24 h潛沙率(32.1%)，是否高質(zhì)量濃度的TAN短期內(nèi)抑制了幼貝的潛沙能力，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的適應(yīng)后少部分個(gè)體潛沙能力恢復(fù)，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

“Zebra 2”潛沙ET100的MATC為0.51～1.03 mg/L，低于4 h與24 h潛沙率的MATC，表明指標(biāo)潛沙ET100對(duì)TAN更敏感。從潛沙ET100的MATC可以推測(cè)，水中TAN濃度低于0.51 mg/L(ρ(非離子氨)≤0.022 mg/L)不會(huì)對(duì)幼貝潛沙產(chǎn)生明顯影響。該非離子氨濃度高于對(duì)普通蛤仔早期生長(zhǎng)發(fā)育研究所得安全濃度0.020 mg/L[19]。

有研究表明，TAN可以顯著影響菲律賓蛤仔體內(nèi)的去甲腎上腺素和腎上腺素含量，從而顯著影響菲律賓蛤仔的神經(jīng)信號(hào)傳遞,推測(cè)TAN可以擾亂菲律賓蛤仔的行為軌跡及其他生理生化功能[20～21]。這可能是一定濃度的TAN使“Zebra 2”幼貝潛沙速度和潛沙率下降的主要原因，確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.3 pH對(duì)“Zebra 2”幼貝潛沙的影響

本研究中，以pH 8.15的天然海水為對(duì)照，在pH為7.00～9.09時(shí)，對(duì)幼貝的豎殼ET5無(wú)顯著性影響，pH為7.55～9.09時(shí)對(duì)豎殼ET50無(wú)顯著性影響，pH為7.31～9.09時(shí)對(duì)潛沙ET50無(wú)顯著性影響，pH為7.31～8.27時(shí)對(duì)潛沙ET100無(wú)顯著性影響，且以對(duì)照組潛沙ET100值為中心，隨著pH向兩側(cè)遞變，潛沙ET100逐漸增大(表2)，酸性環(huán)境條件下ET50較堿性環(huán)境條件用時(shí)長(zhǎng)，這一結(jié)果與對(duì)普通蛤仔的研究結(jié)果相同[3]?？傊?，與TAN的影響類(lèi)似，pH的變化對(duì)潛沙ET100影響最為明顯。

水生生物對(duì)pH的耐受范圍受原水pH和變化方式(突變還是漸變)等的影響。楊鳳等[5]對(duì)普通蛤仔潛沙的研究表明，莆田蛤仔幼貝適宜潛沙的pH為7～9，莊河蛤仔幼貝最適潛沙的pH為8.0，與本試驗(yàn)結(jié)果相近。

4 結(jié)論

1) 5 mm左右的“Zebra 2”蛤仔幼貝，在沙質(zhì)底、水溫20～27 ℃、鹽度22～29、pH 7.00～9.09時(shí)均能潛沙，且在適宜條件下9.0～30.0 min能100%潛沙。

2)ρ(TAN)≤0.51 mg/L(ρ(非離子氨)≤0.022 mg/L)對(duì)100%潛沙時(shí)間ET100無(wú)顯著性影響，ρ(TAN)≤5.93 mg/L(ρ(非離子氨)≤0.254 mg/L)對(duì)24 h內(nèi)潛沙率無(wú)顯著性影響(P>0.05)。pH為7.31～8.27時(shí)對(duì)ET100無(wú)顯著性影響。

3)天然海水的TAN質(zhì)量濃度較難達(dá)到0.51 mg/L，pH一般為7.0～8.5，所以在近岸海水中投放“Zebra 2”，TAN和pH不會(huì)成為影響其潛沙的主要因素。但是投餌施肥的養(yǎng)殖池塘和沿海，水中TAN含量可能較高，池塘pH最高可達(dá)10以上，且波動(dòng)幅度大，可能會(huì)影響蛤仔潛沙。

4) 本試驗(yàn)中所用幼貝屬可投放苗種的較小規(guī)格，較大規(guī)格幼貝潛沙能力更強(qiáng)，對(duì)TAN和pH的耐受能力也可能更強(qiáng)。