胡世康，武海波，王博，秦海鵬，廖栩崢，趙吉臣，何子豪，陳燮燕，孫成波，3*

(1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088； 2.佛山市順德順爺水產(chǎn)有限公司，廣東 佛山 528000； 3.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室，廣東 湛江 524088)

自然界中，常見的鱧科魚類主要有烏鱧Channaargus和斑鱧Channamaculata[1]，在廣東將烏鱧、斑鱧和雜交鱧統(tǒng)稱為“生魚”，因其具有肉質(zhì)細膩、味道鮮美、骨刺少、含肉率高和營養(yǎng)價值高等諸多優(yōu)點，深受消費者青睞[2-5]，在中國淡水魚養(yǎng)殖中占有較大比重。烏鱧和斑鱧具有各自的優(yōu)缺點，烏鱧生長快速但不能攝食人工配合飼料，只能投喂冰鮮雜魚，而過多投喂冰鮮魚會敗壞水質(zhì)引起病害頻發(fā)和水源污染等問題[6-10]；斑鱧雖然可以攝食配合飼料但生長速度緩慢且個體較小，不受養(yǎng)殖戶的喜愛。目前，廣東省養(yǎng)殖的鱧科魚類主要以雜交鱧為主，且 90% 以上均以廣東烏鱧為父本、外省斑鱧為母本進行雜交得到(Channamaculata♀×Channaargus♂)，雜交鱧具備攝食人工配合飼料、耐低溫、耐低溶氧和耐惡劣環(huán)境的諸多優(yōu)點，且生長速度也比之前的主養(yǎng)品種有了大幅提高，適合在中國大部分地區(qū)推廣養(yǎng)殖，有利于推動整個鱧科魚類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

腸道微生物在水生動物生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用，正常的腸道微生物具有消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)和調(diào)節(jié)魚類免疫等諸多功能，與魚類的健康生長密切相關(guān)[11-13]，因此，研究魚類腸道微生物對實際生產(chǎn)具有重大意義。目前，眾多學(xué)者對雜交鱧的病害、營養(yǎng)、藥物殘留等方面的研究已有諸多報道[14-16]，但不同養(yǎng)殖模式下雜交鱧腸道微生物組成及多樣性研究鮮有報道。目前，鱧科魚類的養(yǎng)殖以土池為主，少部分地區(qū)用高位鋪膜池進行養(yǎng)殖，兩種養(yǎng)殖模式產(chǎn)生的生態(tài)效益和經(jīng)濟效益差異較大，本研究中以土池和高位鋪膜池養(yǎng)殖的健康雜交鱧的腸道為研究對象，采用高通量測序技術(shù)進行兩種養(yǎng)殖模式下雜交鱧腸道微生物組成及多樣性的差異性研究，以期從微生物角度分析不同養(yǎng)殖模式下雜交鱧腸道微生物組成及多樣性差異，旨在為雜交鱧健康高效養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗樣品于2019年4月分別取自佛山市順德順爺水產(chǎn)有限公司的高位鋪膜池和旁邊的土池，樣品采集前，使用水質(zhì)監(jiān)測儀(DZS-706，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)和可見分光光度計(722 s，上海棱光技術(shù)有限公司)等儀器測量2種養(yǎng)殖池中的溫度、pH、氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮和總堿度等水質(zhì)指標。為保證水質(zhì)測量的科學(xué)性，采用 2 L有機玻璃采水器分別在高位鋪膜池和土池的水面下 50 cm處采集水樣，取水樣 2 L，取樣地點分別在池塘中央和4個拐角處，將這5個點的水樣混合后，先用0.15 mm的尼龍過濾網(wǎng)濾去雜質(zhì)和大顆粒物，然后進行水質(zhì)指標的測定。

高位鋪膜池面積為 2 000 m2，平均水深約 2.5 m，日換水量約為 30%；土塘面積約為3 333 m2，平均水深約2 m。兩種池塘的日換水量約為20%，養(yǎng)殖水源相同，都是河涌水，投喂飼料為同一廠商生產(chǎn)，投喂等其他管理方式相同。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及前處理 土池設(shè)置 3 個重復(fù)組，分別記為abce123、abce124和abce125，高位鋪膜池設(shè)置 3 個重復(fù)組，分別記為abce126、abce127和abce128。取樣前停止攝食 24 h，從2種養(yǎng)殖模式池塘中各取 3 尾健康且規(guī)格相近的雜交鱧，高位鋪膜池雜交鱧體質(zhì)量為(1 130.00±96.27)g，體長為(35.33±1.70)cm，土池雜交鱧平均體質(zhì)量為(1 140.67±45.88)g，體長為(35.67±1.70)cm。取樣前先將解剖盤滅菌，然后在解剖盤上鋪一層碎冰。將樣本魚先用冰水混合物浸泡30 min左右，待魚失去活力并產(chǎn)生休克后，將魚置于解剖盤中，用體積分數(shù)為75%的乙醇擦拭魚體進行消毒，再用 0.85%(質(zhì)量分數(shù))無菌生理鹽水洗滌 2～3 次，打開魚的腹腔，用體積分數(shù)為75%的乙醇擦拭腸道外部，用無菌剪刀剪取部分腸道中部組織，樣品不混樣，2種養(yǎng)殖模式腸道樣品均留備用樣品，將取好的腸道組織樣本迅速放入液氮中速凍后于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA提取 使用Soil DNA Kit(OMEGA，US)提取腸道樣本的DNA，具體操作按照試劑盒說明書進行，所有樣品總DNA均重復(fù)提取 2～3 次并混合均勻，以避免出現(xiàn)誤差。提取完成后使用Thermo NanoDrop 8000(賽默飛世爾科技，美國)分光光度計測定其濃度和純度，以確保所提取的DNA 質(zhì)量能夠滿足后續(xù)擴增要求，將提取成功的DNA樣品存放于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細菌16S rDNA序列的v3～v4可變區(qū)擴增和Illumina Miseq 測序 以提取成功的各樣本細菌總DNA作為模板，擴增16S rDNA序列的v3～v4可變區(qū)域，為保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析的準確性及可靠性，擴增需要兩個條件，首先是盡可能使用低循環(huán)數(shù)擴增，其次保證每個樣品擴增的循環(huán)數(shù)統(tǒng)一。引物為341F(5′CCTAYGGGRBGCASCAG 3′)和806R(5′GGACTACNNGGGTATCTAAT 3′)。PCR 采用PrimeSTAR HS DNA Polymerase，反應(yīng)體系(20 μL)包括：5× PrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus)10 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol/L each)4 μL，F(xiàn)orward Primer(5 μmol/L)1 μL，Reverse Primer(5 μmol/L)1 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，Template DNA 10 ng，用滅菌雙蒸水補足至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃下預(yù)變性3 min； 98 ℃下循環(huán)變性30 s，55 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸30 s，共進行27個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸 5 min(PCR儀，ABI 9700型GeneAmp PCR System 9700)，擴增好的DNA 序列經(jīng)瓊脂糖電泳檢測呈陽性后交由廣州賽哲生物科技股份有限公司用 Illumina Miseq PE300高通量測序技術(shù)進行序列測定和分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Barcode序列和PCR擴增引物序列從以下數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode序列和引物序列，對樣品的reads進行拼接，得到的拼接序列為原始Tags數(shù)據(jù)(Raw Tags)，Raw Tags經(jīng)過過濾操作，去掉低質(zhì)量、不符合長度的tag及嵌合體，得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags)。之后，基于Clean Tags進行OTUs(Operational Taxonomic Units，操作分類單元)聚類，以 97%相似性為標準劃分操作分類單元OTU作為分類和計算的依據(jù)。根據(jù)OTU聚類結(jié)果，對每個OTU的代表序列做物種注釋，得到對應(yīng)的物種注釋信息和基于物種的豐度分布情況。同時，對OTU豐度(統(tǒng)計，可視化)、Alpha多樣性進行分析等，以得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTU信息。本研究中，定義1個OTU為堿基差異小于3%的序列群，且在結(jié)果分析中1個OTU被視為代表一種細菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 池塘水質(zhì)指標

高位鋪膜池：水溫為30.3 ℃，pH為7.88，總氨氮為0.38 mg/L，亞硝酸鹽氮為0.44 mg/L，硝酸鹽氮為10.87 mg/L，總堿度為17.17 mg/L。

土池：水溫為30.8 ℃，pH 為7.88，總氨氮為5.78 mg/L，亞硝酸鹽氮為3.29 mg/L，硝酸鹽氮為35.10 mg/L，總堿度為50.61 mg/L。

高位鋪膜池的水溫和pH與土池?zé)o明顯差異，但高位鋪膜池的氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮和總堿度含量均明顯低于土池。

2.2 OTU稀釋曲線分析

從圖1可見，當(dāng)樣品測序數(shù)量一定時，土池樣品獲得的OTU數(shù)量遠遠大于高位鋪膜池，土池樣品的OTU稀釋曲線在樣品測序數(shù)量低于10 000時就逐漸趨于平緩，而高位鋪膜池的OTU稀釋曲線在樣品測序數(shù)量超過10 000時才逐漸開始趨于平緩，這說明樣品測序數(shù)量比較合理，再增加樣品測序數(shù)量，獲得的新的OTU數(shù)量也很少，從另一個角度也說明隨著樣品測序數(shù)量增加，沒有新的微生物種類被發(fā)現(xiàn)，細菌多樣性也無明顯變化?？偟膩碚f，測序深度比較合理，能夠覆蓋樣品絕大多數(shù)的微生物，表明此次菌群分析結(jié)果合理。

2.3 基于16S rDNA測序的細菌多樣性分析

2.3.1 測序樣品中OTU數(shù)量及基于16S rDNA基因序列的細菌多樣性指數(shù) 對高位鋪膜池和土池樣本中高通量測序的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，高位鋪膜池的 3 個樣本abce126、abce127和abce128分別獲得136、85和79 個 OTU，土池的 3 個樣本abce123、abce124和abce125分別獲得1 034、489和 414 個OTU；土池 3 個樣本的OTU數(shù)量和Alpha多樣性指數(shù)(ACE、Chao1、 Shannon、 Simpson)均明顯高于高位鋪膜池(表1)。這表明，土池雜交鱧腸道細菌多樣性高于高位鋪膜池。

2.3.2 細菌多樣性的等級分布曲線分析 細菌多樣性的等級分布曲線可直觀反映樣品中包含的分類豐富度和均勻度，即在水平方向，分類豐度由曲線寬度反映，分類豐富度越高，曲線在橫軸上的跨度越大；在垂直方向曲線的平滑程度，反映了樣品中分類的均勻程度，曲線越平緩，物種分布越均勻。從圖2可見：土池樣本曲線在橫軸上的寬度均顯著高于高位鋪膜池樣品曲線寬度最高的樣本(abce126)，表明土池雜交鱧腸道微生物分類豐度高于高位鋪膜池；土池樣品曲線在縱軸上的平滑程度均顯著高于高位鋪膜池，表明土池雜交鱧腸道微生物分布均勻度高于高位鋪膜池。這表明，土池雜交鱧腸道細菌多樣性高于高位鋪膜池。

圖1 測序樣品中OTU稀釋曲線Fig.1 OTU dilution curve of sequencing samples

圖2 測序樣品中細菌多樣性的等級分布曲線Fig.2 Hierarchical distribution curve of bacterial diversity in sequenced samples

2.3.3 OTU豐度的PCA分析 利用OTU數(shù)據(jù)繪制PCA圖，進一步分析觀察各樣品間的關(guān)系，樣品間距離越遠表示樣品的物種組成差異越大。從圖3可見：PC1軸對樣品的貢獻率為92.7%，PC2軸對樣品的貢獻率為6.62%，高位鋪膜池和土池腸道樣品的距離較遠，這說明腸道樣品的物種組成差

圖3 OTU豐度的PCA分析結(jié)果Fig.3 PCA results of OTU abundance

異較大；土池中的abce123腸道樣品與另外2個腸道樣品距離較遠，高位鋪膜池中的abce127腸道樣品與另外2個腸道樣品距離較遠。這表明，土地與高位鋪膜池雜交鱧腸道細菌組成差異較大。

2.4 不同養(yǎng)殖模式雜交鱧腸道菌群結(jié)構(gòu)組成

2.4.1 門水平菌群組成 從圖4可見：土池雜交鱧腸道樣品中優(yōu)勢細菌門類包括酸桿菌門Acidobacteria、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、厚壁菌門Firmicutes、梭桿菌門Fusobacteria、變形菌門Proteobacteria 和軟壁菌門Tenericutes，而高位鋪膜池雜交鱧腸道樣品中優(yōu)勢細菌門類包括厚壁菌門Firmicutes和梭桿菌門Fusobacteria；土池樣品abce123中變形菌門所占比例明顯高于其他門類，樣品abce124和樣品abce125中分別以變形菌門和擬桿菌門所占比例最高，而高位鋪膜池 3 個樣品中均以梭桿菌門所占比例最高。這表明，土池雜交鱧樣品腸道物種豐富度明顯高于高位鋪膜池。

圖4 各樣品中門水平上的物種相對豐度Fig.4 Relative species abundance in each sample at phylum level

2.4.2 屬水平菌群組成 進一步對高位鋪膜池和土池雜交鱧腸道樣品中細菌進行屬類別統(tǒng)計。從圖5可見：土池雜交鱧腸道樣品中優(yōu)勢菌目類包括食酸菌屬Acidovorax、不動桿菌屬Acinetobacter、鯨桿菌屬Cetobacterium、金黃桿菌屬Chryseobacterium和支原體屬Mycoplasma，而高位鋪膜池雜交鱧腸道樣品中優(yōu)勢細菌屬類為鯨桿菌屬Cetobacterium；土

圖5 各樣品中屬水平上的物種相對豐度Fig.5 Relative species abundance in each sample at genus level

池abce123腸道樣品中優(yōu)勢細菌屬類均為未知細菌屬類，abce124腸道樣品中優(yōu)勢細菌屬類按豐度依次為金黃桿菌屬、支原體屬、食酸菌屬、不動桿菌屬和鯨桿菌屬，abce125腸道樣品中優(yōu)勢細菌屬類按豐度依次為金黃桿菌屬、不動桿菌屬、食酸菌屬、支原體屬和鯨桿菌屬，而高位鋪膜池 3 個樣品中均以鯨桿菌屬為主。

3 討論

3.1 養(yǎng)殖雜交鱧的土池和高位鋪膜池水質(zhì)分析

高位鋪膜池的水溫、pH與土池?zé)o顯著性差異，但總氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮和總堿度均明顯低于土池，這可能是高位鋪膜池換水頻率高且換水量大造成的。相關(guān)研究表明，水產(chǎn)動物在幼體階段的腸道微生物組成最初來源于水環(huán)境，而水體中溫度、pH、氨氮等理化因子的變化會影響水體中微生物組成，從而影響水產(chǎn)動物腸道微生物的組成[17-18]。

3.2 土池和高位鋪膜池養(yǎng)殖的雜交鱧腸道微生物多樣性和豐度比較

研究腸道微生物的傳統(tǒng)方法主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)和末端限制性長度(T-RFLP)等技術(shù)[18-19]，但均存在諸多缺陷，不能全面揭示腸道微生物結(jié)構(gòu)多樣性的特點。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)憑借高準確性、測序速度快、成本低和測序范圍廣等優(yōu)點開始在腸道微生物研究中廣泛應(yīng)用[20]。本試驗中，利用高通量測序技術(shù)分析雜交鱧在不同養(yǎng)殖模式下腸道細菌群落組成差異，發(fā)現(xiàn)不同養(yǎng)殖模式下雜交鱧腸道微生物菌落結(jié)構(gòu)有顯著性差異。高位鋪膜池的 3 個樣本abce126、abce127和abce128分別獲得136、85和 79 個OTU；土池的 3 個樣本abce123、abce124和abce125分別獲得1 034、489和 414 個OTU，這與徐晟云等[21]在不同環(huán)境下取樣雜交鱧腸道內(nèi)容物測出OTU的數(shù)量差異較大的結(jié)果一致，可能與雜交鱧所處的水環(huán)境及投喂餌料種類不同有關(guān)[22]。本研究中，通過樣品測序序列和OTU豐度計算Alpha多樣性指數(shù)(ACE、 Chao1、 Shannon、 Simpson)，綜合分析表明，土池雜交鱧腸道菌群多樣性高于高位鋪膜池，這與李存玉[23]關(guān)于池塘養(yǎng)殖牙鲆腸道菌群多樣性高于工廠化養(yǎng)殖結(jié)果一致，這可能是雜交鱧喜歡鉆泥的習(xí)性導(dǎo)致的，池塘養(yǎng)殖的雜交鱧在自然環(huán)境中以池塘底泥為食物來源，這樣其腸道內(nèi)的微生物含量就較高，菌群結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。陸振等[24]研究也發(fā)現(xiàn)，池塘養(yǎng)殖刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)比海上吊籠養(yǎng)殖更豐富。至于本研究中高位鋪膜池樣本abce126和土池樣本abce123的OTU數(shù)量分別明顯高于另外 2 個樣本的原因還有待進一步研究。

3.3 土池和高位鋪膜池養(yǎng)殖的雜交鱧腸道細菌群落組成比較

在門水平上，本研究中土池的3 個樣品中細菌門類豐富，以變形菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌門，有研究表明，變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門等是魚類腸道中的優(yōu)勢菌門[25]，而高位鋪膜池 3 個樣品中均以梭桿菌門所占比例最高，占 90%以上，微生物群落結(jié)構(gòu)單一，與土池樣品細菌門類構(gòu)成差異較大，這可能與雜交鱧不同發(fā)育階段和營養(yǎng)狀態(tài)(饑餓、飽食)等因素有關(guān)。Verner-Jeffreys等[26]發(fā)現(xiàn)，大西洋比目魚HippoglossushippoglossusL.腸道菌群在仔魚卵黃囊階段以假單胞菌Pseudoalteromonas為主，而在開口仔魚階段則以弧菌Vibrioanguillarum為主。Xia等[27]也發(fā)現(xiàn)，饑餓可以改變亞洲鱸腸道細菌群落的組成。

在屬水平上，本研究中土池abce123腸道樣品中優(yōu)勢細菌屬類均為未知細菌屬類，abce124腸道樣品中優(yōu)勢細菌屬類按豐度依次為金黃桿菌屬、支原體屬、食酸菌屬、不動桿菌屬和鯨桿菌屬，abce125腸道樣品中優(yōu)勢細菌屬類按豐度依次為金黃桿菌屬、不動桿菌屬、食酸菌屬、支原體屬和鯨桿菌屬，其中，金黃桿菌屬屬于擬桿菌門，支原體屬屬于厚壁菌門；高位鋪膜池 3 個樣品中均以鯨桿菌屬為主，淡水魚類腸道內(nèi)好氧、兼性厭氧細菌一般以氣單胞菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬和腸桿菌科等為主[28]，鯨桿菌屬可以發(fā)酵多肽碳水化合物并在其過程中產(chǎn)生維生素B12[29]，這說明鯨桿菌屬在魚類消化和營養(yǎng)方面有著重要作用。土池雜交鱧腸道樣品中，微生物群落多樣性明顯高于高位鋪膜池，但鱧腸道中鯨桿菌屬的比例明顯低于高位鋪膜池。

微生物群落的生物多樣性可反映一定區(qū)域內(nèi)微生物資源的豐富程度，可以評價微生物群落的結(jié)構(gòu)特征、穩(wěn)定度等[30]。Yachi等[31]曾經(jīng)提出過保險假說，當(dāng)外界環(huán)境不斷發(fā)生變化時，較高的生物多樣性一定程度上可以緩沖環(huán)境變化帶來的壓力，使生態(tài)系統(tǒng)維持相對穩(wěn)定。維持微生物群落多樣性在一定程度上可以降低養(yǎng)殖生物發(fā)病的風(fēng)險[32]，在實際生產(chǎn)中，相同條件下土池養(yǎng)殖雜交鱧換水一次可以維持池塘生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的時間大約是高位鋪膜池的2倍。

4 結(jié)論

1)養(yǎng)殖雜交鱧的土池和高位鋪膜池，溫度和pH無顯著性差異，土池的氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮和總堿度明顯高于高位鋪膜池。

2)土池養(yǎng)殖雜交鱧腸道樣品OTU豐度和Alpha多樣性指數(shù)(ACE、Chao1、Shannon、Simpson)明顯高于高位鋪膜池。

3)在門和屬水平上，土池養(yǎng)殖雜交鱧腸道樣品微生物多樣性均大于高位鋪膜池。