高延奇，王森，劉娟，黨慧鳳，黎睿君

(大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連市海珍品疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

盾纖毛蟲隸屬于纖毛門Ciliophora寡膜綱Oligohymenophorea盾纖目Scuticociliatida[1]。該類纖毛蟲能夠自由生活在海水中，但在魚體受傷、環(huán)境惡化等情況下，可引起海水養(yǎng)殖動(dòng)物感染，主要表現(xiàn)為以宿主細(xì)胞或組織為食的組織性寄生蟲，導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物大量死亡[2]。盾纖毛蟲現(xiàn)已被公認(rèn)為是海水養(yǎng)殖動(dòng)物的一類病原體，在亞洲、大洋洲、歐洲和北美洲等地區(qū)均已報(bào)道魚類嚴(yán)重感染盾纖毛蟲的病例，如海洋尾絲蟲Uronemamarinum、水滴偽康纖蟲Pseudocohnilembuspersalinus和貪食邁阿密蟲Miamiensisavidus等，能夠引起大菱鲆Scophthalmusmaximus[3-4]、歐洲舌齒鱸Dicentrarchuslabrax[5]、比目魚Paralichthysolivaceus[6]、海龍Phyllopteryxtaeniolatus[7]、虹鱒Oncorhynchusmykiss[8]、藍(lán)鰭金槍魚Thunnusmaccoyii[9]等魚類發(fā)病。

本試驗(yàn)中，從遼寧大連地區(qū)養(yǎng)殖的患病刺參、紅鰭東方鲀、大菱鲆體表分離出3種盾纖毛蟲，根據(jù)其形態(tài)分析，并結(jié)合3種盾纖毛蟲的18S rDNA基因序列[10]，構(gòu)建了相關(guān)類群的系統(tǒng)發(fā)育樹，從分子序列方面進(jìn)一步確定了其屬級系統(tǒng)分類地位[11]，在盾纖毛蟲適宜環(huán)境生活溫度20 ℃下，篩選了3種盾纖毛蟲體外培養(yǎng)的最適細(xì)胞培養(yǎng)基，初步研究了不同溫度、鹽度、pH條件對3種盾纖毛蟲種群生長的影響，旨在為盾纖毛蟲的分離鑒定及基于盾纖毛蟲全蟲疫苗研制的體外培養(yǎng)條件優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年10月—2017年5月分別從遼寧省大連市某紅鰭東方鲀、大菱鲆和刺參養(yǎng)殖場收集病料，于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對病料進(jìn)行病原分離。將分離到的蟲體接種于海水肉湯培養(yǎng)基中馴化培養(yǎng)，之后挑取單個(gè)蟲體接種于改良過的L-15培養(yǎng)基內(nèi)純化培養(yǎng)，并在實(shí)驗(yàn)室傳代保種。

1.2 方法

1.2.1 盾纖毛蟲的形態(tài)觀察 活體觀察：在干凈載玻片上滴加蟲液，并緩慢蓋上蓋玻片，由低倍鏡到高倍鏡，依次觀察并拍照記錄。

甲醛固定觀察：吸取1 mL蟲液加至1.5 mL的離心管中，吸取少量體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液滴入離心管，搖勻滅活之后，從中吸取蟲液滴在干凈載玻片上，并緩慢蓋上蓋玻片，由低倍鏡到高倍鏡依次觀察并拍照記錄。

甲基綠派洛寧染色觀察：吸取1 mL蟲液加至1.5 mL的離心管中，吸取經(jīng)離心處理過的甲基綠派洛寧上清染液0.1 mL滴入離心管，搖勻之后，從中吸取蟲液滴在干凈載玻片上，并緩慢蓋上蓋玻片，由低倍鏡到高倍鏡依次觀察并拍照記錄。

醋酸洋紅染色觀察：染色條件及觀察步驟均同甲基綠派洛寧染色觀察，只將甲基綠洛寧液換為等量醋酸洋紅染液(不經(jīng)離心)。

掃描電鏡觀察：參照王印庚等[12]的步驟。

1.2.2 3種盾纖毛蟲總DNA的提取 對純化后擴(kuò)大培養(yǎng)的盾纖毛蟲，采用浮游生物計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù)其種群密度(每次吸取25 μL，計(jì)數(shù)3次，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示)，并加入適量體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液殺死盾纖毛蟲，以4 000 r/min離心10 min，收集5×105個(gè)盾纖毛蟲，使用TIANamp Genomic DNA 基因組提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取盾纖毛蟲總DNA。用50 μL滅菌雙蒸水溶解DNA沉淀，于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 18S rDNA 基因序列的PCR擴(kuò)增 選用18S rDNA通用引物，上游引物F:5′AACCTGGTTGATCCTGCCAGT 3′，下游引物R:5′TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC 3′[13]，以提取的盾纖毛蟲總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25 μL)包含：rTaq酶0.25 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，總DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 下預(yù)變性 5 min；94 ℃下循環(huán)變性1 min， 58 ℃下退火復(fù)性2 min，72 ℃下延伸2 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸5 min，4 ℃下結(jié)束。取3 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(50×TAE緩沖液，電壓120 V)，DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)使用DL2000，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察。

1.2.4 基因克隆與測序 采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)純化回收PCR產(chǎn)物，將純化后的PCR產(chǎn)物直接連接至pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞EscherichicoliDH5中，接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)5 h，經(jīng)特異PCR驗(yàn)證后，將陽性菌株送至北京華大基因研究中心進(jìn)行DNA測序驗(yàn)證。

1.2.5 環(huán)境因子對3種盾纖毛蟲種群生長的影響試驗(yàn)

1)培養(yǎng)基的篩選。 在6孔板中分別加入配制好的L-15、RPMI1640和MEM培養(yǎng)基(調(diào)節(jié)鹽度為30，pH為7.2)，每種培養(yǎng)基設(shè)置3個(gè)平行，每孔3 mL，再分別接種300個(gè)盾纖毛蟲，溫度設(shè)置為盾纖毛蟲自然環(huán)境生長適宜溫度20 ℃，每天觀察并統(tǒng)計(jì)25 μL蟲液中的種群數(shù)量(計(jì)數(shù)3次，取其平均值)，連續(xù)觀察統(tǒng)計(jì)7d。

2)不同溫度條件下3種盾纖毛蟲種群密度的計(jì)數(shù)。接種處于種群生長指數(shù)期的蟲體于50 mL的錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶盛入20 mL篩選出的最適細(xì)胞培養(yǎng)基L-15培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)鹽度為30，pH為7.2，分別在10、15、20、30 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)溫度設(shè)3個(gè)平行組，盾纖毛蟲種群初始密度為100 ind./mL，每天觀察并統(tǒng)計(jì)25 μL蟲液中的種群數(shù)量(計(jì)數(shù)3次，取其平均值)，連續(xù)觀察統(tǒng)計(jì)7 d。

3)不同鹽度條件下3種盾纖毛蟲種群密度的計(jì)數(shù)。接種處于種群生長指數(shù)期的蟲體于50 mL的錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶盛入20 mL的L-15培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為20 ℃，pH 為7.2，分別在13、20、30和40鹽度下進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)鹽度設(shè)3個(gè)平行組，盾纖毛蟲種群初始密度為100 ind./mL，觀察及統(tǒng)計(jì)方法同溫度試驗(yàn)。

4)不同pH條件下3種盾纖毛蟲種群密度的計(jì)數(shù)。接種處于種群生長指數(shù)期的蟲體于50 mL的錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶盛入20 mL的L-15培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為20 ℃，鹽度為30，分別在pH為4.2、5.2、7.2、9.2下進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)pH設(shè)3個(gè)平行組，盾纖毛蟲種群初始密度為100 ind./mL，觀察及統(tǒng)計(jì)方法同溫度試驗(yàn)。

1.2.6 序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化分析 將測序所得到的3種盾纖毛蟲的18S rDNA序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫中用BLAST進(jìn)行比對分析，并收集相關(guān)的盾纖目纖毛蟲18S rDNA 基因序列，采用Clustalx軟件進(jìn)行多序列比對。運(yùn)用MEGA 4軟件采用鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，并通過自舉分析(bootstrap)進(jìn)行置信度檢測，自舉數(shù)據(jù)集為1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種盾纖毛蟲的形態(tài)學(xué)

1)分離自大菱鲆的盾纖毛蟲(TUR-2)形態(tài)特征：活體外形為飽滿的水滴狀，呈瓜子形，表膜無缺刻；蟲體頂端略尖，向背彎曲，后端渾圓，周身長有纖毛，排列稀疏(圖1 A～C)，后體部有一條較長的尾纖毛(圖1F)；體內(nèi)具有多個(gè)圓形食物泡，細(xì)胞質(zhì)無色，顯微鏡下有時(shí)可見位于中央?yún)^(qū)的不透明大核，呈圓形；一個(gè)明顯伸縮泡，位于體后端。甲基綠派洛寧及醋酸洋紅染色結(jié)果顯示，可見明顯大核，位于體中部，為不規(guī)則的橢圓形或圓形(圖1D、E)。

A、B—活體觀察；C—甲醛固定觀察；D—甲基綠派洛寧染色觀察；E—醋酸洋紅染色觀察；F—掃描顯微鏡觀察；FV—食物泡；CV—伸縮泡；CC—尾纖毛；Ma—大核。A and B—observation of living ciliate; C—observation of ciliates fixed by formaldehyde; D—methyl green-pyronin method; E—aeto carmine method; F—electron scanning microscope method; FV—food vacuole; CV—contractile vacuole; CC—caudal cilium; Ma— macronucleus.圖1 分離自大菱鲆的盾纖毛蟲TUR-2形態(tài)觀察Fig.1 Morphologic observation of scuticociliates TUR-2 isolated from turbot Scophthalmus maximus

2)分離自紅鰭東方鲀的盾纖毛蟲(TFG-1)形態(tài)特征：蟲體呈葵花籽形，前半部稍向內(nèi)側(cè)彎曲，頂端形成不明顯的喙?fàn)钔黄?，表膜無缺刻，體內(nèi)具有多個(gè)晶體(圖2A、B)；蟲體周身長有纖毛，蟲體后端有一條長尾纖毛(圖2E)。甲基綠派洛寧及醋酸洋紅染色結(jié)果顯示，可見明顯大核，位于體中部，為不規(guī)則的橢圓形或圓形(圖2C、D)。

A—甲醛固定觀察；B—活體觀察；C—甲基綠派洛寧染色觀察；D—醋酸洋紅染色觀察；E—掃描顯微鏡觀察；CC—尾纖毛；Ma—大核。A—observation of ciliates fixed by formaldehyde; B—observation of living ciliate; C—methyl green-pyronin method; D—aeto carmine method; E—electron scanning microscope method; CC—caudal cilium; Ma—macronucleus.圖2 分離自紅鰭東方鲀的盾纖毛蟲TFG-1形態(tài)觀察Fig.2 Morphologic observation of scuticociliates TFG-1 isolated from tiger putter Takifugu rubripes

3)分離自刺參的盾纖毛蟲(STI-3)形態(tài)特征：活體外形穩(wěn)定，呈典型瓜子形，前半部稍向內(nèi)側(cè)彎曲，頂端裸毛區(qū)形成明顯的喙?fàn)钔黄?，呈尖角?圖3B);表膜無缺刻，體內(nèi)具有多個(gè)不透明晶體(圖3A、B)，中央?yún)^(qū)或前端偏上可見大核；蟲體頂端尖，周身遍布纖毛，后端有一條略長的尾纖毛(圖3E)。甲基綠派洛寧及醋酸洋紅染色結(jié)果顯示，可見中央?yún)^(qū)或前端明顯大核，為不規(guī)則的橢圓形或圓形，小核不明顯，近球形，緊位于大核側(cè)邊(圖3C、D)。

A—活體觀察；B—甲醛固定觀察；C—甲基綠派洛寧染色觀察；D—醋酸洋紅染色觀察；E—掃描顯微鏡觀察；CC—尾纖毛；Ma—大核；Mi—小核。A—observation of living ciliate; B—observation of ciliates fixed by formaldehyde; C—methyl green-pyronin method; D—aeto carmine method; E—electron scanning microscope method; CC—caudal cilium;Ma—macronucleus;Mi—micronucleus.圖3 分離自刺參的盾纖毛蟲STI-3形態(tài)觀察Fig.3 Morphologic observation of scuticociliates STI-3 isolated from sea cucumber Apostichopus japonicus

2.2 序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用真核生物18S rDNA的通用引物F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳膠圖如圖4所示。測序結(jié)果顯示，TFG-1基因片段大小為1 756 bp，TUR-2基因片段大小為1 755 bp，STI-3基因片段大小為1 755 bp。將擴(kuò)增片段的測序序列在GenBank上進(jìn)行同源性比對后顯示， TFG-1序列與海洋尾絲蟲Uronemamarinum(GQ259747.1)的一致性高達(dá)99%，TUR-2序列與水滴偽康纖蟲Pseudocohnilembuspersalinus(GQ265955.1)的一致性高達(dá)99%，STI-3序列與海洋尾絲蟲U.marinum(DQ867074)的一致性高達(dá)99%。

M—DL2000 DNA Marker；1～3—TFG-1的18S rDNA條帶；4～6—STI-3的18S rDNA條帶；7～9—TUR-2的18S rDNA條帶。M—DL2000 DNA Marker; 1-3—PCR product of 18S rDNA gene of the TFG-1; 4-6—PCR product of 18S rDNA gene of the STI-3; 7-9—PCR product of 18S rDNA gene of the TUR-2.圖4 18S rDNA通用引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification of 18S rDNA gene by PCR

在GenBank 數(shù)據(jù)庫中，選取17 種不同種屬的纖毛蟲相應(yīng)序列，采用MEGA 4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖5所示，TFG-1序列與U.marinum(GQ259747.1)以最高置信值(100%)聚為一支；TUR-2 序列與P.persalinus(GQ265955.1)以最高置信值(100%)聚為一支, 再與Mesanophryscarcini(AY103189)以置信度(47%)聚為一支，而與其他種類相距較遠(yuǎn)；STI-3序列與U.marinum(DQ867074)以最高置信值(100%)聚為一支。

圖5 基于18S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of the related ciliates based on 18S rDNA sequences

2.3 盾纖毛蟲體外培養(yǎng)基篩選

在盾纖毛蟲適宜環(huán)境生活溫度20 ℃下，設(shè)置鹽度30、 pH 7.2，開展了3種盾纖毛蟲在不同培養(yǎng)基中的體外培養(yǎng)，結(jié)果如圖6所示。從圖6可見：TFG-1、TUR-2 和STI-3均能在L-15、MEM和RPMI1640培養(yǎng)基中生長，且培養(yǎng)4～5 d時(shí)，種群密度達(dá)到最大值，之后處于穩(wěn)定期；在生長期，TFG-1、TUR-2 和STI-3在L-15培養(yǎng)基的繁殖速度比在MEM、RPMI1640培養(yǎng)基中快；3種盾纖毛蟲在L-15培養(yǎng)基中生長的最大種群密度也比在MEM、RPMI1640培養(yǎng)基中高，且穩(wěn)定期較長。

圖6 3種盾纖毛蟲在3種培養(yǎng)基中的生長情況Fig.6 Growth of three species of scuticociliates in the three media

這表明，在20 ℃培養(yǎng)溫度下，3種盾纖毛蟲均能夠在3種細(xì)胞培養(yǎng)基中生長，但在L-15細(xì)胞培養(yǎng)基中的種群密度顯著高于MEM和RPMI1640培養(yǎng)基。

2.4 溫度對3種盾纖毛蟲種群生長的影響

在鹽度30、pH 7.2條件下，開展了3種盾纖毛蟲在不同培養(yǎng)溫度下的體外培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果如圖7所示。10 ℃時(shí)，TUR-2能夠分裂增殖，種群密度在第6天時(shí)達(dá)到最大值，TFG-1和STI-3種群密度較低，未出現(xiàn)明顯增殖(圖7(a))；15 ℃時(shí)，TUR-2的種群密度在第5天時(shí)達(dá)到最大值，STI-3的種群密度在第7天時(shí)達(dá)到最大值，TFG-1種群密度較低，未出現(xiàn)明顯增殖，TUR-2的種群密度明顯高于STI-3(圖7(b))；20 ℃時(shí)，STI-3的種群密度在第4天時(shí)達(dá)到最大值，TFG-1種群密度在第4天時(shí)達(dá)到最大值，TUR-2的種群密度在第6天時(shí)達(dá)到最大值，STI-3的種群密度明顯高于TUR-2和TFG-1(圖7(b))；30 ℃時(shí)，STI-3和TUR-2的種群密度均在第5天時(shí)達(dá)到最大值，STI-3的增長明顯高于TFG-1和TUR-2，TFG-1的種群密度明顯高于TUR-2(圖7(b))。

3種盾纖毛蟲在15、20、30 ℃培養(yǎng)溫度中均能夠生長，隨著溫度的升高盾纖毛蟲呈現(xiàn)出了種群密度增大的趨勢，表明一定范圍內(nèi)溫度的提升有助于盾纖毛蟲種群密度的增加，但根據(jù)本研究中宿主的自然生活溫度，均為低溫養(yǎng)殖動(dòng)物，最終確定20 ℃用于3種盾纖毛蟲體外培養(yǎng)溫度。

2.5 鹽度對3種盾纖毛蟲種群生長的影響

在溫度為20 ℃、pH 7.2條件下，開展了3種盾纖毛蟲在不同鹽度下的體外培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果如圖8所示。初始鹽度為13時(shí)，TUR-2的種群密度在第5天時(shí)達(dá)到最大值，STI-3的種群密度在第5天時(shí)開始增加，TFG-1的種群密度較低，不增殖(圖8(a))；初始鹽度為20時(shí)，TUR-2 的種群密度在第5天時(shí)達(dá)到最大值，TFG-1的種群密度在第7天時(shí)達(dá)到最大值，STI-3的種群密度在第4天時(shí)達(dá)到最大值(圖8(b))；初始鹽度為30時(shí)，STI-3種群密度在第6天時(shí)達(dá)到最大值，TUR-2種群密度在第7天時(shí)達(dá)到最大值，TFG-1的種群密度在第5天時(shí)達(dá)到最大值，STI-3的種群密度明顯高于TUR-2和TFG-1，TUR-2 的種群密度明顯高于TFG-1(圖8(b))；初始鹽度為40時(shí)，STI-3的種群密度在第4天時(shí)達(dá)到最大值，TUR-2的種群密度在第6天時(shí)達(dá)到最大值，TFG-1的種群密度在第5天時(shí)達(dá)到最大值，STI-3的種群密度明顯高于TUR-2、TFG-1(圖8(b))。

這表明，在20 ℃培養(yǎng)溫度下，3種盾纖毛蟲均能夠在鹽度為20、30、40的L-15細(xì)胞培養(yǎng)基中生長，但在鹽度為30的L-15細(xì)胞培養(yǎng)基中的種群密度明顯高于鹽度為20和40的細(xì)胞培養(yǎng)基。

2.6 pH對3種盾纖毛蟲種群生長的影響

在溫度為20 ℃、鹽度30條件下，開展了3種盾纖毛蟲在不同pH下的體外培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果如圖9所示。初始pH為4.2時(shí)，STI-3、TFG-1和TUR-2的種群密度均較低，未出現(xiàn)明顯增殖(圖9(a));初始pH為5.2時(shí), 培養(yǎng)到第4天時(shí), TFG-1種群密度開始增加, 在第7天時(shí)達(dá)到最大值，培養(yǎng)到第5天時(shí)，STI-3種群密度開始增加，STI-3的種群密度在第7天時(shí)達(dá)到最大值，TUR-2的種群密度較低，未出現(xiàn)明顯增殖(圖9(b));初始pH為7.2時(shí)，STI-3和TFG-1的種群密度在第4天時(shí)達(dá)到最大值，TUR-2的種群密度均在第5天時(shí)達(dá)到最大值，STI-3的種群密度明顯高于TFG-1、TUR-2(圖9(b))；初始pH為9.2時(shí)，TUR-2和STI-3的種群密度均在第5天時(shí)達(dá)到最大值，TFG-1的種群密度在第6天時(shí)達(dá)到最大值(圖9(b))。

圖9 3種盾纖毛蟲在pH為4.2、5.2、7.2和9.2時(shí)的生長情況Fig.9 Growth of three species of scuticociliates at pH 4.2, 5.2, 7.2 and 9.2

這表明，在20 ℃培養(yǎng)溫度下，3種盾纖毛蟲均能夠在pH為7.2和9.2的L-15細(xì)胞培養(yǎng)基中生長，但在pH為7.2的L-15細(xì)胞培養(yǎng)基中的種群密度最高。

3 討論

3.1 不同宿主源盾纖毛蟲的分離與鑒定

目前，國內(nèi)已有紅鰭東方鲀、大菱鲆等海洋動(dòng)物盾纖毛蟲病的報(bào)道，且能夠從同一種宿主上分離出不同種類的盾纖毛蟲，或者同一種類的盾纖毛蟲能夠從多種宿主上分離出來，這表明盾纖毛蟲無明顯的宿主選擇性。高曉田等[14]、張立坤等[15]分離并鑒定出引起牙鲆體表潰爛的寄生蟲為貪食邁阿密蟲Miamiensisavidus和水滴偽康纖蟲P.persalinus。研究表明，蟹棲擬阿腦蟲Paranophrgscarcini不僅能感染中華絨螯蟹[16]，而且能感染人工越冬期的中國對蝦[17]，同時(shí)吞食大菱鲆體表組織引起體表潰爛[12]。

本研究中從患病養(yǎng)殖大菱鲆體表潰爛處分離到的病原盾纖毛蟲，與張立坤等[15]分離自養(yǎng)殖牙鲆體表潰爛組織中的盾纖毛蟲，以及宋微波等[18]從養(yǎng)殖對蝦中分離到的盾纖毛蟲，均在形態(tài)特征上較為相似。結(jié)合18S rDNA序列比對結(jié)果，本研究中確定此盾纖毛蟲是偽康纖蟲屬的一種，再次證明了盾纖毛蟲無明顯的宿主選擇性。麻麗丹等[19]從患病養(yǎng)殖紅鰭東方鲀體表分離到的盾纖毛蟲，以及王會(huì)芳[20]從紅鰭東方鲀分離到的盾纖毛蟲，均只根據(jù)形態(tài)特征鑒定病原體為海洋尾絲蟲，而本研究中從形態(tài)特征和18S rDNA序列信息兩方面進(jìn)一步證實(shí)了本次引起養(yǎng)殖紅鰭東方鲀體表潰爛的寄生蟲屬于尾絲蟲屬。本研究中同時(shí)還從患病養(yǎng)殖刺參潰爛組織中分離到病原，通過形態(tài)特征及分子生物學(xué)方法確定其也隸屬尾絲蟲屬。

目前，尚未有由尾絲蟲屬寄生引起養(yǎng)殖刺參盾纖毛蟲病的研究報(bào)道，本研究在國內(nèi)屬首次報(bào)道，病因可能與刺參的生活習(xí)性有關(guān)，野生刺參是底棲動(dòng)物，一般生活在潮流暢通、水質(zhì)清澈的巖礁底或沙底海域[21]，幾乎不與營腐生盾纖毛蟲接觸，同時(shí)刺參生活的低溫環(huán)境不利于盾纖毛蟲的大量繁殖，但隨著人工養(yǎng)殖刺參的環(huán)境惡化，加劇了盾纖毛蟲病在刺參中傳播的風(fēng)險(xiǎn)，具體原因還需進(jìn)一步研究。本研究中分離自紅鰭東方鲀的盾纖毛蟲與分離自刺參的盾纖毛蟲均屬于尾絲蟲，但在形態(tài)特征上存在較大差異，如吻端大小不同，形體不同等，再結(jié)合分子信息，兩者18S rDNA序列存在一個(gè)堿基的差異, 推測是否因?yàn)樗拗鞑煌瑢?dǎo)致的寄生蟲相應(yīng)突變, 還需進(jìn)一步研究證明。

3.2 體外培養(yǎng)基篩選和最佳培養(yǎng)條件篩選

本研究在盾纖毛蟲體外培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，L-15培養(yǎng)基更適合盾纖毛蟲的體外培養(yǎng)。L-15培養(yǎng)基富含無機(jī)鹽、氨基酸和維生素，與MEM、RPMI1640培養(yǎng)基相比，L-15培養(yǎng)基的氨基酸含量更高，高水平的氨基酸對體外培養(yǎng)盾纖毛蟲的生存和繁殖很重要。本試驗(yàn)結(jié)果與Iglesias 等[22]的研究結(jié)果相同。雖然本試驗(yàn)中已在L-15培養(yǎng)基里添加了一定量的青霉素和鏈霉素，可抑制絕大多數(shù)的細(xì)菌，但后續(xù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基里還有少量細(xì)菌，通過藥敏試驗(yàn)篩選出了最佳的抗生素是諾氟沙星，因此，可以在培養(yǎng)基里添加適當(dāng)?shù)闹Z氟沙星，以進(jìn)一步抑制細(xì)菌滋生。

此外，本研究在實(shí)驗(yàn)室不同溫度、鹽度和pH條件下對3種盾纖毛蟲種群密度的影響試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在更接近盾纖毛蟲自然環(huán)境溫度20 ℃條件下，鹽度為30、pH為7.2時(shí)，3種盾纖毛蟲的種群密度相對較高，且維持時(shí)間較長，這與張立坤等[23]研究貪食邁阿密蟲在實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)結(jié)果相吻合。

4 結(jié)論

1)本研究中從刺參和紅鰭東方鲀體表分離出的盾纖毛蟲均屬于尾絲蟲Uronemasp.，但兩者的18S rDNA序列存在一個(gè)堿基的差異；從大菱鲆體表分離出的盾纖毛蟲屬于偽康纖蟲Pseudocohnilembussp.，尚屬國內(nèi)首次報(bào)道。

2)3種盾纖毛蟲在L-15培養(yǎng)基中培養(yǎng)的種群密度較MEM、RPMI1640高，L-15培養(yǎng)基為3種盾纖毛蟲的最佳體外培養(yǎng)基。推薦體外培養(yǎng)條件為溫度20 ℃、鹽度30、pH 7.2。本研究結(jié)果可為海水養(yǎng)殖動(dòng)物盾纖毛蟲的分離鑒定及進(jìn)一步研究提供科學(xué)參考。

3)通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，病料采集養(yǎng)殖場所用水源靠近人類生活區(qū)，養(yǎng)殖水源未經(jīng)充分沉淀過濾消毒等處理直接使用，養(yǎng)殖污水未經(jīng)處理直接流入附近海水，以及養(yǎng)殖水池消毒不徹底等，造成水體中有大量盾纖毛蟲滋生、繁殖，并有機(jī)會(huì)寄生在養(yǎng)殖海水魚類及刺參體上，引發(fā)盾纖毛蟲病。因此，在養(yǎng)殖過程中，保持良好的養(yǎng)殖環(huán)境，徹底消滅水體病原對預(yù)防疾病發(fā)生具有重要的意義。