芮藝　徐洲　趙寶華

摘要：江蘇某肉鴿養(yǎng)殖合作社飼養(yǎng)的乳鴿出現(xiàn)扭頭等神經(jīng)癥狀，死亡率高達(dá)65%，剖檢可見腦部出血、頸部皮下出血、十二指腸出血。從病死乳鴿中采集病料，分離到1株鴿新城疫強(qiáng)毒株，病毒毒力測(cè)定其MDT為52h、ICPI為2.2，動(dòng)物回歸試驗(yàn)表明具有較高的致病力，基因測(cè)序其F基因型為ClassⅡ基因Ⅵb亞型。病理組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，新城疫病毒會(huì)引起非化膿性腦炎和出血性壞死。研究結(jié)果為了解江蘇地區(qū)乳鴿新城疫的發(fā)生、流行和組織損害提供了研究數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：乳鴿;新城疫病毒;毒力;F基因型;病理組織學(xué)

中圖分類號(hào)：S852.65+7文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）04-0116-04

作者簡(jiǎn)介：芮藝（1967—），男，江蘇泰興人，副教授，主要從事動(dòng)物疾病教學(xué)和科研工作。E-mail：13814423402@139.com。

通信作者：趙寶華，碩士，研究員，主要從事禽病傳染病研究工作。E-mail：yzzhaobao@126.com。

鴿新城疫，俗稱鴿瘟，又稱鴿Ⅰ型副黏病毒病，是鴿的重要傳染病。該病危害極大，鴿群常突然發(fā)病，蔓延迅速，具有發(fā)病快、流行期長(zhǎng)、發(fā)病率和死亡率高的特點(diǎn)，病死率一般為30%～80%，嚴(yán)重時(shí)，死亡率可達(dá)95%以上[1]。病鴿的康復(fù)時(shí)間較長(zhǎng)，通常需要1月左右才逐漸康復(fù)，有些需要更長(zhǎng)時(shí)間才能康復(fù)，部分患病鴿表現(xiàn)扭頭等神經(jīng)癥狀，從而喪失了其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，損失嚴(yán)重[2]。

江蘇徐州某肉鴿養(yǎng)殖合作社成員飼養(yǎng)2000多對(duì)肉鴿，2019年11月入冬后，其乳鴿不斷地出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，死亡的有7日齡小乳鴿，也有20多日齡[HJ1.8mm]大的乳鴿，起初死亡2～3只/d，成年鴿臨床上未發(fā)現(xiàn)明顯異常。1周后乳鴿死亡近10只/d;部分成年鴿拉稀，并出現(xiàn)零星死亡。解剖病死乳鴿，主要表現(xiàn)腦部出血，頸部皮下出血，十二指腸等腸道出血，少部分可見腺胃乳頭、肌胃出血、泄殖腔黏膜出血。病死成年鴿腦部出血不明顯，此病變與乳鴿的解剖病變有明顯差異，但可見頸部皮下、腺胃乳頭、肌胃和十二指腸出血[3]。

為此，本研究團(tuán)隊(duì)從病死乳鴿中采集病料，分離到1株鴿新城疫病毒，進(jìn)行了鴿新城疫病毒毒力測(cè)定，對(duì)新城疫病毒F基因測(cè)序，開展了病理組織學(xué)研究，以期為了解江蘇地區(qū)乳鴿新城疫的發(fā)生、流行和組織損害提供數(shù)據(jù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料無(wú)菌采集江蘇徐州某肉鴿養(yǎng)殖合作社病死乳鴿的腦組織，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2試驗(yàn)雞胚SPF雞蛋購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)室孵化至10日齡雞胚供使用。

1.1.3試劑新城疫病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清（生產(chǎn)批號(hào)20190508）、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒陽(yáng)性血清（生產(chǎn)批號(hào)20190308）和H5、H7、H9亞型禽流感病毒陽(yáng)性血清（生產(chǎn)批號(hào)分別為20190522、20181206、20191116），購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司;TRIzol，購(gòu)自Invitrogen公司;AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、ExTaq酶、pMD18-T、感受態(tài)細(xì)胞DH5α，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;DNA回收試劑盒，購(gòu)自O(shè)MEGA公司[4]。

1.1.4未免疫鴿未免疫鴿，購(gòu)自揚(yáng)州市綠楊畜禽養(yǎng)殖專業(yè)合作社，揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)供試驗(yàn)用。

1.2方法

1.2.1病毒的分離和鑒定

1.2.1.1病毒分離2020年3月23日于揚(yáng)州大學(xué)生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，取出無(wú)菌采集病死乳鴿的腦組織病料，將病料剪成小塊，置于研磨器內(nèi)磨碎，用生理鹽水將病料按1∶5稀釋制成組織混懸液，經(jīng)3次凍融后，置離心機(jī)中以5000r/min離心10min，取上清，加入“雙抗”（含青霉素1000mg/mL和鏈霉素1000mg/mL），室溫作用4h。取處理好的病料上清液，經(jīng)尿囊腔接種10日齡的SPF雞胚，每枚0.2mL，用蠟封孔，置于37℃繼續(xù)孵化，棄去24h死亡的雞胚。24h后每2h照蛋1次，收取死亡的雞胚，置4℃冰箱，4h后無(wú)菌收集其尿囊液[4]。

1.2.1.2微量血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)

血凝抑制（HA）試驗(yàn)和血凝抑制（HI）試驗(yàn)按常規(guī)微量方法。2020年4月26日于江蘇省家禽科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室，對(duì)收獲的尿囊液進(jìn)行HA試驗(yàn)，對(duì)HA陰性者盲傳3代。經(jīng)檢測(cè)，對(duì)具有血凝性的雞胚尿囊液，再用抗新城疫病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒陽(yáng)性血清和H5、H7、H9亞型禽流感病毒陽(yáng)性血清進(jìn)行HI試驗(yàn)[4]。

1.2.1.3病毒毒力測(cè)定

2020年5月11日于揚(yáng)州大學(xué)生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，采用世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的方法測(cè)定分離病毒的雞胚最小致死量平均死亡時(shí)間（MDT）和1日齡雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）[5]。

1.2.1.4動(dòng)物回歸試驗(yàn)

2020年5月21日于揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房隔離器，分別以0.1mL的分離毒株第3代種毒液對(duì)10羽1月齡未免疫的鴿進(jìn)行肌肉注射，觀察20d，記錄發(fā)病和死亡情況，未發(fā)病的鴿則采血檢測(cè)新城疫抗體[6]。同時(shí)設(shè)置未攻毒的未免疫鴿10羽作為對(duì)照，觀察記錄，采血檢測(cè)新城疫抗體。

1.2.2引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中收錄的數(shù)百條NDVF基因序列[7]，用Primer5.0自行設(shè)計(jì)擴(kuò)增NDVF基因部分片段的引物，P1：5′-[JP9]AGGATCCTTGGGTCTACAGGTAACTC-3′;P2：5′-[JP9]AAAGCTTGTTCGTTCCTCATCTGTGTTC-3′。引物交生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3RT-PCR

按照TRIzol試劑盒的說(shuō)明對(duì)第3代分離毒株的尿囊液進(jìn)行病毒RNA的抽提，加入適量的DEPC水溶解。在PCR管中加入RNA9.5μL，10mmol/LdNTP2μL，10×RTbuffer2μL，AMV反轉(zhuǎn)錄1μL，RNA酶抑制劑0.5μL，隨機(jī)引物1μL，加滅菌去離子水至20μL，混勻，室溫下作用10min，接著42℃水浴1h，即為第一鏈cDNA，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系為：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL，5×RTbuffer5μL，10mmol/LdNTP2μL，20μmol/L的上下游引物各1μL，Ex-Taq0.25μL，加滅菌去離子水至25μL。反應(yīng)條件：94℃2min;然后94℃30s，59℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min，取5μL反應(yīng)產(chǎn)物在1%瓊脂糖中電泳進(jìn)行檢驗(yàn)[8]。

1.2.4連接、轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物的測(cè)序

按照DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明回收PCR產(chǎn)物，按照pMD18-T載體試劑盒說(shuō)明進(jìn)行連接，16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，均勻涂布在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18h后，挑取大小合適的白色單菌落進(jìn)行培養(yǎng)。將菌液PCR陽(yáng)性者送上海華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.2.5病毒F基因片段的序列分析

利用DNASTAR5.0軟件分析測(cè)序結(jié)果，并翻譯F基因裂解位點(diǎn)氨基酸序列。對(duì)F基因核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，并將F基因片段序列與GenBank中收錄的NDV毒株繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹;分析F基因裂解位點(diǎn)區(qū)（112～117）氨基酸序列特征。通過對(duì)F基因分型相關(guān)序列的生物遺傳進(jìn)化分析進(jìn)行基因分型[9]。

1.2.6病理組織學(xué)研究

2020年3月23日于揚(yáng)州大學(xué)生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，采集病死乳鴿的腦、肺、肝、腸、脾組織器官，浸泡于10%福爾馬林溶液中，按常規(guī)病理切片制作方法，按次序?qū)ζ浣M織器官進(jìn)行固定、脫水、浸泡包埋、切片、貼片、H.E染色和封片[10]，放置高倍顯微鏡下觀察。

2結(jié)果與分析

2.1病毒分離鑒定結(jié)果

從乳鴿腦組織中分離得到1株具有血凝性的病毒株，在雞胚上傳第3代后，雞胚出現(xiàn)規(guī)律性死亡，死亡時(shí)間集中于48～60h。其第3代尿囊液HA效價(jià)為27，血凝性能被新城疫陽(yáng)性血清所抑制，但不能被產(chǎn)蛋下降綜合征及H5、H7、H9亞型禽流感陽(yáng)性血清所抑制。經(jīng)鑒定其為鴿新城疫病毒，稱為鴿新城疫徐州毒株，命名為PPMV-1/Pigeon/XZ/CH/2019（簡(jiǎn)稱XZ2019）。

2.2病毒毒力測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)表明，鴿新城疫徐州毒株的MDT為52h、ICPI為2.2，根據(jù)OIE推薦的毒力判定標(biāo)準(zhǔn)，可判定其為速發(fā)型新城疫病毒。

2.3動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)注射鴿新城疫徐州毒株的10羽非免疫鴿，2d3羽發(fā)病，4d內(nèi)全部發(fā)病。3d出現(xiàn)2羽死亡，4d死亡3羽，6d死亡4羽，其他存活至20d出現(xiàn)扭頭等神經(jīng)癥狀。檢測(cè)未死亡鴿的血清，其NDV的HI效價(jià)達(dá)到25，表明鴿感染了鴿新城疫徐州毒株。對(duì)照組10羽非免疫鴿表現(xiàn)正常，20d采集鴿的血清，進(jìn)行NDV的HI效價(jià)測(cè)定，均為0。

2.4鴿新城疫徐州毒株F蛋白基因序列及同性分析

鴿新城疫徐州毒株F蛋白基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物見圖1。由圖1可知，F(xiàn)蛋白裂解位點(diǎn)處的序列（112R-R-Q-K-R-117F）與新城疫強(qiáng)毒在這一區(qū)域的序列相符，與國(guó)內(nèi)強(qiáng)毒F48E9株、疫苗毒LaSota株的核苷酸同源性分別為85.2%、80.0%，氨基酸同源性為83.6%、81.5%。經(jīng)基因的遺傳進(jìn)化分析（圖2）可知，鴿新城疫徐州毒株屬于ClassⅡ基因Ⅵb亞型。

2.5病理組織學(xué)研究結(jié)果

通過病理切片觀察（圖3）可知，鴿新城疫病毒能引起非化膿性腦炎，壞死灶中心和周圍有大量多核巨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。由圖4可知，腦組織內(nèi)血管充血、水腫和出血，血管中層水腫變性，毛細(xì)血管和小動(dòng)脈玻璃樣變，小血管生成透明血栓及血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死;腸道黏膜絨毛脫落，出血性壞死。肝臟出現(xiàn)網(wǎng)狀組織細(xì)胞增生，脾臟的皮質(zhì)部和生發(fā)中心可見局灶性淋巴細(xì)胞的空泡形成和破壞，出現(xiàn)壞死性損害;肺組織損害不明顯。

3小結(jié)與討論

本研究從病死乳鴿腦組織中分離得到1株鴿新城疫病毒株，其MDT為52h、ICPI為2.2，動(dòng)物回歸試驗(yàn)及其F蛋白裂解位點(diǎn)處的序列測(cè)定，均表明鴿

新城疫徐州毒株為強(qiáng)毒株，對(duì)鴿尤其是乳鴿具有較強(qiáng)的致病力，與臨診表現(xiàn)相符。據(jù)繪制的基因遺傳進(jìn)化樹，鑒定出該分離株為基因Ⅵ型，為國(guó)內(nèi)常發(fā)生的病毒基因型毒株[11]。本結(jié)果提示我們?cè)谌怿澤a(chǎn)上需加強(qiáng)對(duì)鴿城疫強(qiáng)毒株的防控，尤其需加強(qiáng)鴿場(chǎng)的衛(wèi)生消毒工作，避免鴿新城疫強(qiáng)毒株的侵入，減少鴿場(chǎng)內(nèi)的病原數(shù)量，降低鴿群的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

通過病理組織學(xué)觀察，鴿新城疫病毒具有較強(qiáng)的嗜神經(jīng)性，從而使乳鴿臨床上出現(xiàn)扭頭等神經(jīng)癥狀。鴿新城疫病毒對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損害對(duì)乳鴿的危害尤其嚴(yán)重，由于鴿是晚成鳥，乳鴿出生后并不張眼，自身無(wú)法覓食，完全靠親鴿哺喂，其腦部神經(jīng)受鴿新城疫病毒侵襲而損傷后，造成乳鴿在哺食時(shí)抬頭或舉頭困難，致使無(wú)法吃到食物，這可能是乳鴿發(fā)生鴿新城疫后死亡率較高的原因之一。

通過基因的遺傳進(jìn)化分析，鴿新城疫徐州毒株與目前國(guó)內(nèi)流行株屬于同一遺傳分支，與弱毒疫苗株LaSota的遺傳距離較遠(yuǎn)，提示需加強(qiáng)鴿新城疫專用疫苗的研制，并建議對(duì)乳鴿新城疫防制應(yīng)盡量選擇鴿新城疫專用疫苗，專用疫苗對(duì)鴿新城疫防疫將更有針對(duì)性，免疫效果也會(huì)更好，避免僅使用雞新城疫弱毒LaSota株而影響免疫效果的問題[12]。另外，為有效預(yù)防乳鴿發(fā)生新城疫，生產(chǎn)上需加強(qiáng)對(duì)親鴿的新城疫防疫工作，以提高乳鴿的母源抗體水平，提高乳鴿特異性抵抗力，避免乳鴿早期被新城疫病毒感染而造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。

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