李揚　凌永勝　林金秀

摘要：以17份馬鈴薯材料為試材，研究在低溫馴化前后，馬鈴薯葉片在低溫脅迫下電解質(zhì)外滲率的變化規(guī)律，經(jīng)Logistic方程擬合分析測定馬鈴薯的低溫半致死溫度（LT50），結(jié)合聚類分析和田間自然霜凍鑒定等方法，對試材耐寒性和耐寒類型進行評價，為指導(dǎo)馬鈴薯耐寒栽培及新品種推廣提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，相對電導(dǎo)率與處理溫度呈“S”形曲線變化，與Logistic方程相吻合;田間自然霜凍鑒定結(jié)果和室內(nèi)電導(dǎo)率鑒定均可以有效評價馬鈴薯材料的耐寒性;17份試材無低溫馴化能力或馴化能力較弱，其中桂龍薯1號、泉云4號和V201707表現(xiàn)出較強的耐寒性，可供耐寒性育種親本使用。

關(guān)鍵詞：低溫馴化;馬鈴薯;半致死溫度;耐寒性;電導(dǎo)率法

中圖分類號：S532.01文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）04-0045-06

作者簡介：李揚（1990—），女，四川成都人，碩士，研究實習(xí)員，[JP3]從事馬鈴薯育種及栽培技術(shù)研究。E-mail：liyang201862@qq.com。

通信作者：凌永勝，研究員，從事馬鈴薯等作物育種與栽培技術(shù)研究。E-mail：707993289@qq.com。

馬鈴薯（SolariumtuberosumL.）于2015年1月被列為繼水稻、玉米、小麥之后的我國第四大主糧作物，它喜冷涼，但不耐低溫霜凍。當(dāng)溫度低于7℃時，馬鈴薯停止生長，-0.8℃時遭受冷害，-1.5℃時遭受凍害，-3℃時植株會凍死[1-2]。我國南方秋冬作區(qū)馬鈴薯主要分布在福建、廣西、廣東、浙江、四川、云南、貴州、湖南和湖北等省（區(qū)）[3]。冬種馬鈴薯具有市場銷售價格高、對環(huán)境保護友好等優(yōu)勢，使得南方冬作區(qū)的馬鈴薯種植面積逐年增大[4]。馬鈴薯是福建三大作物之一，[HJ1.8mm]福建省內(nèi)每年1月中旬至2月中旬常受到強寒流天氣入侵，尤其是2008、2015、2018年的低溫霜凍天氣給省內(nèi)冬種馬鈴薯生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。因此，篩選、鑒定和研究耐寒性馬鈴薯材料對于馬鈴薯育種與促進產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義。

采用電導(dǎo)法配合Logistic方程推導(dǎo)半致死溫度的方法更能準(zhǔn)確反映植物所耐受的低溫極限，是目前鑒定植物耐寒性較為可靠的方法[5]，已被廣泛應(yīng)用于辣椒[6]、火龍果[7]、馬鈴薯[8-9]等不同的植物上。李華偉等應(yīng)用電導(dǎo)法配合Logistic方程，測定了17個馬鈴薯品種的半致死溫度[9]。許多植物在一定的非傷害性溫度下低溫鍛煉一段時間（即低溫馴化）后，其耐寒能力可以得到不同程度的提高[10]。目前，利用Logistic方程非線性擬合電導(dǎo)率鑒定馬鈴薯低溫馴化前后耐寒性的研究較少[9，11-22]，將室內(nèi)人工耐寒鑒定與田間自然鑒定相結(jié)合進行馬鈴薯耐寒性研究在南方冬作區(qū)尚未見報道。本研究以17份馬鈴薯品種（系）為試材，探究低溫馴化前后馬鈴薯電解質(zhì)外滲率的變化規(guī)律，分析測定馬鈴薯半致死溫度（LT50），并結(jié)合田間自然耐寒鑒定結(jié)果，探討應(yīng)用電導(dǎo)法配合Logistic方程快速測定馬鈴薯耐寒性的可行性，評價馬鈴薯材料的耐寒性及低溫馴化能力，為進一步研究馬鈴薯品種的耐寒性及耐寒品種的選育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

試驗材料共17份：桂龍薯1號、紫花851、費烏瑞它、泉云3號、泉云4號、V201701、V201703、V201706、V201707、V201711、V201719、V201723、V201725、V201810、V201818、V201823和V201831，均為泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所保存的品種（系）資源材料。2018年9月在泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗基地（118°34′27″E、24°52′50″N）播種，供試材料播種于10cm×10cm的塑料缽內(nèi)，栽培基質(zhì)為蛭石，每份材料播6盆，每盆1株。出苗26d后移入冷光源人工氣候培養(yǎng)箱中低溫馴化14d，培養(yǎng)箱設(shè)置如下：培養(yǎng)溫度4℃/2℃（晝/夜，下同），光照度100μmol/（m2·s），光照時間14h/d;出苗40d后，取頂端大小一致的葉片稱質(zhì)量后進行低溫處理及電導(dǎo)率測定。

1.2試驗方法

1.2.1離體葉片低溫處理采用魏亮的測定方法[11]（略改動）對試驗材料的離體葉片進行低溫處理，處理過程如下：用蒸餾水沖洗離體葉片3～5次，吸干水分后立即放入試管底部，每支試管放入1張葉片（共24支）封口;將試管放入低溫循環(huán)水浴鍋中（冷凍液為50%乙二醇），初始溫度設(shè)為0℃，保持30min，降到-0.5℃，保持30min;-0.5℃降到-1℃，保持1h，在-1℃下保持30min時在每支試管中加入一小塊冰塊，再保持30min后取樣;-1℃降到-1.5℃，保持1h，然后降到-2℃，保持30min后取樣;-2℃降到-3℃，保持30min后取樣;以此類推，直至溫度降到-7℃，分別取樣，每次取樣3支，將取樣試管放在4℃冰箱中解凍過夜。

1.2.2電導(dǎo)率的測定將解凍后的葉片剪成小塊后立即裝入試管，并加入20mL蒸餾水;用真空泵抽氣6min，在振蕩器上振蕩1h（轉(zhuǎn)速為220r/min）;靜置15min，測電導(dǎo)率，重復(fù)3次，取平均值為R1;將試管放入沸水浴30min后，測電導(dǎo)率，重復(fù)3次，取平均值為R2。

電解質(zhì)外滲率=R1/R2×100%。

1.2.3Logistic擬合方程及半致死溫度分析將每個溫度對應(yīng)的電導(dǎo)率平均值與Logistic方程進行非線性擬合分析，方程拐點即為試材的半致死溫度（LT50），即材料的抗寒能力。Logistic擬合方程：y=k/（1+ae-bt），式中：y為相對電導(dǎo)率;k為細(xì)胞傷害率的飽和容量即y的最大極限值，%;a、b為方程參數(shù);t為冷凍溫度，℃。

1.2.4田間自然耐寒性鑒定2018年10月10日于福建省德化縣美湖鎮(zhèn)美湖村（地理位置118°4′14″E、25°36′49″N）播種，海拔672m，沙質(zhì)紅壤，地勢平坦，前茬作物水稻，11月8日出苗。試驗采用隨機區(qū)組排列，種植畦寬（含溝）1.2m，雙行畦植，株距28cm，每份供試材料的小區(qū)面積6.67m2，3次重復(fù)。2018年12月18日，德化縣發(fā)布霜凍藍色預(yù)警，地表最低溫度為-1℃，12月9日對試驗材料的田間自然寒害損傷等級進行評分。損傷等級評分標(biāo)準(zhǔn)參照Vega等的方法[12-13]（表1），并對每份材料的評分結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同低溫的電導(dǎo)率變化

由圖1可知，隨著處理溫度的降低，各品種的相對電導(dǎo)率不斷升高，但上升的速度并不均勻，呈現(xiàn)出“慢—快—慢”的趨勢，大體呈“S”形曲線。當(dāng)處理溫度在0～-1℃時，各品種的相對電導(dǎo)率略有增加，平均上升7.2百分點，說明葉片細(xì)胞膜透性緩慢增大;處理溫度在-1～-5℃時，各品種相對電導(dǎo)率急驟上升，平均上升63.4百分點，說明葉片細(xì)胞膜受到嚴(yán)重傷害;處理溫度在-5～-7℃時，相對電導(dǎo)率變化較小，平均僅提高2.1百分點，說明葉片細(xì)胞膜已失去基本功能。

不同的馬鈴薯品種在低溫處理下葉片相對電導(dǎo)率的增加速率不同。處理溫度在-1～-3℃時，桂龍薯1號、泉云3號及泉云4號的相對電導(dǎo)率均低于50%，表現(xiàn)出較強的耐寒性;處理溫度在-3～-5℃時，各品種的電導(dǎo)率均超過80%，表明葉片電解質(zhì)滲出十分嚴(yán)重，細(xì)胞膜受到的不可逆損傷加劇。從測定結(jié)果來看，紫花851和費烏瑞它耐寒力相對較弱，桂龍薯1號、泉云3號和泉云4號耐寒力較強。

2.2低溫馴化前后電導(dǎo)率配合Logistic方程求LT50

低溫使膜透性呈可逆性增加時，可能是葉片[HJ2mm]細(xì)胞對低溫刺激的一種適應(yīng)性反應(yīng);當(dāng)它呈半可逆增加時，則是細(xì)胞遭受傷害的標(biāo)志;當(dāng)它呈不可逆增加時，則是細(xì)胞因低溫寒害致死的結(jié)果。通過Logistic方程y=k/（1+ae-bx）對相對電導(dǎo)率（y）和溫度（x）進行擬合，能夠較好地反映兩者之間的關(guān)系，當(dāng)電解質(zhì)滲透為50%時的溫度即為半致死溫度（LT50）。

對17份馬鈴薯材料的相對電導(dǎo)率配合Logistic方程，所得方程和LT50見表2。低溫馴化前各Logistic方程的擬合度R2在0.961～0.991范圍內(nèi)（P<0.01），表明擬合結(jié)果精確可靠，低溫脅迫下電解質(zhì)外滲率遵循Logistic方程的變化規(guī)律。

從表2可以看出，低溫馴化前17份馬鈴薯材料的LT50在-1.2～-3.6℃之間，平均LT50為-2.5℃。LT50可以區(qū)別耐寒性差異，LT50低的材料耐寒性較強。以耐寒性較強的品種桂龍薯1號為對照，V201707的耐寒性最強，泉云4號其次，二者的LT50均低于對照的-3.4℃;V201703的耐寒性最弱（LT50為-1.2℃）。

如表3、表4所示，經(jīng)低溫馴化后，大部分材料的LT50均高于-4℃，僅有V201707的LT50最低，為-4.0℃;各材料馴化前后的LT50變化不大，其中V201711、V201810和V201823的LT50幾乎沒有改變（<0.1℃），其他的LT50均有所降低，其中費烏瑞它的LT50降幅最大，降低了0.6℃，說明供試材料冷馴化能力較弱。

由圖2可知，經(jīng)人工氣候培養(yǎng)箱低溫馴化7d后顯示，部分材料的葉片出現(xiàn)卷曲、萎蔫、葉片邊緣變褐及植株長高緩慢的現(xiàn)象，且隨著馴化時間的延長，癥狀越來越嚴(yán)重。這進一步表明供試的17份材料馴化能力較弱。

2.3低溫馴化前LT50的聚類分析

低溫馴化前，17份材料的LT50聚類分析結(jié)果見圖3，在歐氏距離4.8處可將供試材料劃分為3類：第1類為寒害敏感型，包括V201701、V201703、V201719、V201725共4份材料，占供試材料的23.5%。這些材料在低溫馴化前的LT50在-1.2～-1.9℃之間，表現(xiàn)對寒害敏感。第2類為耐寒力較弱型，包括紫花851、費烏瑞它、泉云3號及V201706等共10份材料，占供試材料的58.8%。各材料的LT50都在-2.1～-2.9℃范圍內(nèi)。第3類為耐寒型材料，共3份，分別是桂龍薯1號（對照）、泉云4號和V201707材料，占供試材料的17.6%。這些材料在低溫馴化前的LT50介于-3.4～-3.6℃之間，說明低溫馴化前的耐寒力強。

2.4田間自然寒害鑒定

2018年12月18日德化縣美湖鄉(xiāng)試驗基地的地表最低溫度為-1℃，12月9日對試驗材料進行自然寒害損傷等級評分（表5）。田間自然寒害損傷評分值低于2的有桂龍薯1號、泉云3號、泉云4號和V201831共4份材料，表現(xiàn)為耐寒性強;田間自然寒害損傷評分值在2～4的有紫花851、費烏瑞它、V201706、V201707、V201711、V201719、V201723、V201725、V201810、V201818和V201823共11份材料，表現(xiàn)為耐寒性弱;田間自然寒害損傷評分值超過4的V20170和V201703，表現(xiàn)對寒害敏感。

將低溫馴化前后的室內(nèi)電導(dǎo)率結(jié)果分別與田間自然霜凍鑒定結(jié)果進行相關(guān)性分析，結(jié)果（圖4、圖5）顯示，室內(nèi)鑒定的LT50與田間自然霜凍損傷結(jié)果均極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.846和0.853，表明室內(nèi)低溫鑒定結(jié)果是真實可靠的，能夠有效評價馬鈴薯材料在田間低溫霜凍環(huán)境下的存活情況，且田間霜凍損傷評價結(jié)果與低溫馴化后的LT50相關(guān)性更強。

3討論與結(jié)論

植物耐寒性的鑒定方法主要有電導(dǎo)率鑒定法、形態(tài)學(xué)鑒定法、田間霜凍鑒定法、葉綠素?zé)晒夥治龇?、同工酶分析法、電阻分析法等[14]。目前，評價馬鈴薯耐寒性的方法主要有室內(nèi)電導(dǎo)率法和田間自然霜凍鑒定法，其中田間自然鑒定法簡單、快捷，適合大批材料的鑒定，Vega等對2600多份馬鈴薯材料進行了田間自然霜凍評價，并建立了馬鈴薯田間自然霜凍評價標(biāo)準(zhǔn)[12]，但該方法容易受田間氣候的影響，具有一定的局限性;植物的生物膜系統(tǒng)在冷害脅迫下膜脂產(chǎn)生相變，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增大以及次生的其他生理生化反應(yīng)[15]，室內(nèi)電導(dǎo)率法基于此原理來推測細(xì)胞膜的受傷程度，當(dāng)電解質(zhì)滲透率為50%時的溫度即半致死溫度（LT50），可以用來準(zhǔn)確地反映馬鈴薯耐寒性，該方法適合小樣本的測定。

本研究將室內(nèi)電導(dǎo)率法和田間自然霜凍鑒定法相結(jié)合，研究發(fā)現(xiàn)相對電導(dǎo)率與處理溫度呈“S”形曲線變化，與Logistic方程相吻合，并且隨著溫度的降低，葉片受到的傷害愈發(fā)嚴(yán)重，電解質(zhì)滲透率增加，葉片的相對電導(dǎo)率上升，這與葛亞英等的研究結(jié)果[16]相一致。將田間自然霜凍鑒定結(jié)果與室內(nèi)電導(dǎo)率鑒定結(jié)果進行相關(guān)性分析，相關(guān)性達極顯著水平，表明室內(nèi)電導(dǎo)率鑒定結(jié)果真實可信，能夠評價馬鈴薯材料在田間低溫霜凍環(huán)境下的存活情況，可以作為馬鈴薯田間自然霜凍損傷程度的預(yù)測方式，與魏亮等的研究結(jié)果[11，14，17]一致。低溫馴化前，本研究分析的17份馬鈴薯材料的LT50介于-1.2～-3.6℃，絕大多數(shù)材料（82.4%）不耐低溫霜凍，可能在我國馬鈴薯育種中，傳統(tǒng)育種是主要的育種方式，審定品種的遺傳背景差異較小;低溫馴化后，各材料的LT50沒有顯著的變化，說明我國栽培品種無馴化能力或馴化能力很弱，與前人研究結(jié)果[11，14，18-22]吻合。在本試驗條件下，共篩選出3份耐寒性較強的材料，分別是桂龍薯1號、泉云4號和V201707，可為耐寒育種提供種質(zhì)材料;此外，V201831在室內(nèi)試驗中電導(dǎo)率表現(xiàn)一般，經(jīng)聚類分析，屬耐寒力較弱型，但在田間自然霜凍鑒定中，該材料表現(xiàn)出較強的耐寒力，尚待進一步研究。

本研究應(yīng)用電導(dǎo)率法配合Logistic方程測定了低溫馴化前后17份馬鈴薯材料的LT50，并結(jié)合田間自然霜凍鑒定結(jié)果。結(jié)果表明：應(yīng)用電導(dǎo)法配合Logistic方程可以對馬鈴薯材料的耐寒性進行快速鑒定，能夠準(zhǔn)確評價馬鈴薯材料的田間耐寒情況，并且我國選育的栽培品種（系）的低溫馴化能力普遍較弱。

參考文獻：

[1]門福義，劉夢蕓.馬鈴薯栽培生理[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1995：102-110.

[2]張珍.馬鈴薯早熟防寒栽培技術(shù)[J].河南農(nóng)業(yè)，2013（5）：46.

[3]古秋霞，林群，黃修杰，等.2015年廣東馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展形勢與對策建議[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（3）：21-24.

[4]謝開云，王曉雪，王鳳義.我國冬閑稻田馬鈴薯生產(chǎn)的潛力與問題[J].中國馬鈴薯，2010，24（6）：370-375.

[5]張鋼.國外木本植物抗寒性測定方法綜述[J].世界林業(yè)研究，2005，18（5）：14-20.

[6]楊少瑕，呂慶芳，梁春林.電導(dǎo)法對32個辣椒品種組合抗寒性的測定及配合力分析[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（2）：6-15.

[7]鄧仁菊，范建新，王永清，等.低溫脅迫下火龍果的半致死溫度及抗寒性分析[J].植物生理學(xué)報，2014，50（11）：1742-1748.

[8]FranckoDA，WilsonKG，LiQQ，etal.Atopicalspraytoenhanceplantresistancetocoldinjuryandmortality[J].Horttechnology，2011，21（1）：109-118.

[9]李華偉，林志堅，許泳清，等.電導(dǎo)率法及Logistic方程鑒定馬鈴薯材料的耐寒性[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，31（8）：810-815.

[10]LevittJ.ResponsesofPlanttoEnvironmentalstresses：chillingfreezing，andhightemperaturestresses[M].2nded.NewYork：AcademicPress，1980：497.

[11]魏亮.中國主要馬鈴薯品種抗寒性鑒定及抗寒相關(guān)基因表達分析[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[12]VegaSE，BambergJB.ScreeningtheUSpotatocollectionforfrosthardiness[J].AmericanpotatoJournal，1995，72：13-21.

[13]鄧英毅，鄭虛，熊軍，等.馬鈴薯新品種桂農(nóng)薯1號冬種田間耐寒性鑒定[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，48（1）：66-71.

[14]李飛，金黎平.馬鈴薯耐霜凍研究進展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（4）：140-142，145.

[15]解越.低溫逆境下冷敏果實組織冷損傷及半致死溫度的研究[D].上海：上海海洋大學(xué)，2016：1-7.

[16]葛亞英，田丹青，郁永明，等.應(yīng)用Logistic方程確定‘圓葉紅花口紅花的抗寒性[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，24（1）：48-51.

[17]SukumaranNP，WeiserCJ.Freezinginjuryinpotatoleaves[J].PlantPhysiology，1972，50：564-567.

[18]李飛.野生馬鈴薯植株苗期耐凍性鑒定及耐凍機理研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2008：1-19.

[19]李飛，雷尊國，劉杰，等.野生馬鈴薯材料苗期耐凍性鑒定[J].中國蔬菜，2008（12）：6-10.

[20]楊超英，王芳，王艦.低溫馴化對馬鈴薯半致死溫度的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（4）：80-81，87.

[21]許娟，鄭虛，閆海鋒，等.不同馬鈴薯品種苗期葉片對低溫脅迫的生理響應(yīng)[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，47（11）：1837-1843.

[22]曹紅星，雷新濤，劉艷菊，等.不同來源地油棕種質(zhì)資源耐寒適應(yīng)性初步研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，28（5）：1916-1919.