任美鳳 董晉明 李大琪 暢建武 郝曉娟 陸俊姣

關(guān)鍵詞華北大黑鰓金龜;種衣劑;防治效果;解毒酶;紅蕓豆

紅蕓豆，學(xué)名菜豆Phaseolus vulgaris L.，經(jīng)濟(jì)價值較高，是山西小雜糧出口創(chuàng)匯的主要品種之一，每年出口量約3萬t，占中國紅蕓豆出口總量的40%以上。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，根腐病嚴(yán)重危害紅蕓豆種植。由于蠐螬為害損壞種子，咬食根系，加劇病原菌入侵，加重根腐病的發(fā)生，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益受損，降低農(nóng)民種植的積極性。加之全球氣候變暖及耕作模式的變化，導(dǎo)致地下害蟲蟲口基數(shù)加大，為害時期加長。如何科學(xué)、高效防控蠐螬是當(dāng)前紅蕓豆生產(chǎn)中急需解決的關(guān)鍵問題。

華北大黑鰓金龜Holotrichia oblita是土棲性金龜子的優(yōu)勢種之一，是華北旱作區(qū)重要的地下害蟲_，其幼蟲（蠐螬）取食發(fā)芽種子和根系，食性廣，為害重，為害時間長，防治非常困難。目前，生產(chǎn)中對蠐螬的防治主要采用農(nóng)藥溝施、撒毒土、灌根、毒餌誘殺等方法，費(fèi)時費(fèi)工，勞動成本較高。防治藥劑主要是有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類以及苯基吡唑類等傳統(tǒng)藥劑，如：克百威、甲拌磷、毒死蜱等，此類藥劑具有劇毒或高殘留，被限制使用或禁止使用，導(dǎo)致市場上用于防治蠐螬的藥劑比較缺乏。因此，急需精準(zhǔn)的施藥方式和綠色、安全、高效的化學(xué)藥劑。

種子包衣靶向性強(qiáng)，農(nóng)藥利用率高，保證有限的農(nóng)藥成分集中作用于種子和根部，精準(zhǔn)化防治蠐螬，減少農(nóng)藥施用量，相比傳統(tǒng)防治方法省時省力。李進(jìn)榮等研究發(fā)現(xiàn)，噻蟲嗪和吡蟲啉種衣劑對大豆田蠐螬具有75%左右的防效;劉煜財(cái)?shù)妊芯勘砻髀认x苯甲酰胺·噻蟲嗪種衣劑對花生田蠐螬具有較高防效，但由于紅蕓豆對多種藥劑敏感，目前尚無關(guān)于紅蕓豆田蠐螬防治藥劑的相關(guān)研究。本研究選取4種懸浮種衣劑，采用室內(nèi)盆栽方法，研究其對紅蕓豆的安全性和對華北大黑鰓金龜幼蟲的防治效果，為其防治提供科學(xué)用藥參考;采用酶學(xué)動力法測定對其解毒酶的影響，為華北大黑鰓金龜幼蟲解毒機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試?yán)ハx：華北大黑鰓金龜成蟲采自山西省汾陽市，室內(nèi)飼養(yǎng)待其產(chǎn)卵，將卵放人裝滿滅菌土的培養(yǎng)皿中，保持土壤濕度15%左右，放于人工氣候箱內(nèi)，在溫度（25±0.5）℃、光周期L//D=16h//8h的條件下飼養(yǎng)，待其孵化后，單頭飼養(yǎng)，選擇整齊一致的3齡幼蟲待用。

供試作物：紅蕓豆，品種為‘品金蕓3號，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所提供。

供試藥劑及儀器設(shè)備：50%氯蟲苯甲酰胺懸浮種衣劑（chlorantraniliprole）由美國杜邦公司提供;600 g/L吡蟲啉懸浮種衣劑（imidacloprid）由拜耳作物科學(xué)（中國）有限公司提供;40%溴?！む缦x嗪懸浮種衣劑（cyantraniliprole·thiamethoxam）（20%溴氰蟲酰胺，20%噻蟲嗪）由瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司提供;50%吡蟲·硫雙威懸浮種衣劑（imida-cloprid·thiodicarb）（37.5%硫雙威，12.5%吡蟲啉）由江蘇龍燈化學(xué)有限公司提供;十二烷基硫酸鈉、a-萘酚、固藍(lán)B鹽、a-乙酸萘酯、丙酮、還原性谷胱甘肽、1-2，4-二硝基苯、考馬斯亮藍(lán)G-250等購于生物工程（上海）股份有限公司。所用設(shè)備主要是synergy HT多功能酶標(biāo)儀，美國佰騰儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1供試藥劑的防蟲效果及種子被害情況評價

播種前，按各藥劑的推薦使用劑量確定包衣量，本試驗(yàn)中50%氯蟲苯甲酰胺FSC、600 g/L吡蟲啉FSC、40%溴?！む缦x嗪FSC、50 9/6吡蟲·硫雙威FSC的包衣量分別為3、4、3、4 mL/kg。先將各個藥劑按劑量調(diào)成漿狀液，然后將紅蕓豆種子和藥液倒入塑料袋中充分翻拌，待種子均勻著藥后，倒出攤開置于通風(fēng)處，晾干后備用?？瞻讓φ眨–K）用清水拌種，方法同上。

試驗(yàn)共設(shè)5個處理，3次重復(fù)，每個重復(fù)10盆（11.5cm×17cm×12cm）。每盆播種大小均勻種子3粒，播深4～5cm，室溫栽培，播時每盆接華北大黑鰓金龜3齡幼蟲1頭。播種30d后，調(diào)查各處理種子被害情況、活蟲數(shù)量，并測量豆苗的株高、根長、鮮重、干重等。被害情況分級標(biāo)準(zhǔn)如下：0級，完好無損;1級，種子被咬食5 9/6以下;2級，5%≤種子被咬食<10%;3級，10%≤種子被咬食<25%;4級，25%≤種子被咬食<50%;5級，50%≤種子被咬食。根據(jù)以下公式計(jì)算種子被害指數(shù)、蟲口存活率和防治效果。

種子被害指數(shù)=∑（各級被害株數(shù)×相對級值）/（調(diào)查總株數(shù)×5）×100;

蟲口存活率一處理后蟲口數(shù)/處理前蟲口數(shù)×100%;

防治效果=（對照蟲口存活率-藥劑處理蟲口存活率）/對照蟲口存活率×100%。

1.2.2供試藥劑對華北大黑鰓金龜幼蟲谷胱甘肽

S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）活性的影響

試驗(yàn)共設(shè)5個處理，將不同包衣處理的種子置于牙簽盒內(nèi)（每盒3顆種子）并放人相同體積的土壤（約占牙簽盒體積2/3），單頭飼養(yǎng)華北大黑鰓金龜幼蟲，分別于48、72、96h后收集試蟲，用去離子水清洗，吸水紙吸干水分，制備酶源。

取處理后試蟲5頭，稱重，置于預(yù)冷的研缽中，按照1：2（rn/V）比例加入預(yù)冷的pH為7.0的66 mmol/L磷酸緩沖液，冰浴條件下研磨勻漿，于4℃，12 000 r/min冷凍離心20 min，用紗布過濾得上清液，再4℃，12 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液備用，用66 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液稀釋50倍作為待測酶液。

參照Habig等的方法并加以改進(jìn)，取100 vL酶液，加入1.3 mL 66 mmol/L的磷酸緩沖液（pH7.0），加入150μL 50 mmol/L還原性谷胱甘肽溶液，50 μL O.03 mol/L CDNB，放入24孔板中，迅速混勻后于340 nm測出5min內(nèi)每隔1min的OD值變化;對照組不加入酶液，緩沖液加1.4mL，其他試劑體積不變，如前述測定OD值的變化。依照公式計(jì)算酶活力。

1.2.3供試藥劑對華北大黑鰓金龜幼蟲羧酸酯酶（CarE）活性的影響

試驗(yàn)處理如1.2.2，取處理后試蟲5頭，稱重，置于預(yù)冷的研缽中，按照1：2（m/V）比例加入預(yù)冷的pH為7.0的0.04 mol/L磷酸緩沖液，冰浴條件下研磨勻漿，于4℃，12 000 r/min冷凍離心20 min，用紗布過濾得上清液，再4℃，12000 r/min冷凍離心10min，取上清液備用，用0.04mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液稀釋50倍作為待測酶液。

參照Van Aspern等的方法并加以改進(jìn)，取0.5mL酶源，2.5 mL 3×10 a一乙酸萘酯，30。C恒溫水浴30 min后，加入0.5 mL顯色劑，于室溫靜置30 min，在波長600nm下測定OD值。以a-萘酚制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)酶源蛋白含量測定結(jié)果，計(jì)算CarE活力。

1.2.4蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍(lán)（G-250）法進(jìn)行測定。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，處理問差異采用單因素方差分析，用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同種衣劑對紅蕓豆出苗及生長的影響

4種種衣劑均對紅蕓豆安全，且顯著提高了出苗率、根鮮重和根干重（表1）。與對照相比，出苗率均顯著增加40百分點(diǎn)左右;根鮮重顯著增加50.00%～135.29%，50%吡蟲·硫雙威FSC和600 g/L吡蟲啉FSC增幅最高，為135.29%，50%氯蟲苯甲酰胺FSC次之，為88.24%，40%溴?！む缦x嗪FSC增幅較低，為50.00%;根干重顯著增加66.67%～133.33%，50%吡蟲·硫雙威FSC增幅最大，為133.33%，600 g/L吡蟲啉FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC次之，均為100%，40%溴?！む缦x嗪FSC增幅較低，為66.67%。600 g/L吡蟲啉FSC和50%吡蟲·硫雙威FSC可顯著提高紅蕓豆的莖鮮重，其他2種種衣劑對其無顯著性影響。50%吡蟲·硫雙威FSC和40%溴?！む缦x嗪FSC可顯著提高紅蕓豆的株高，其他2種種衣劑對其無顯著性影響。

2.2不同種衣劑的防治效果及保種效果

如表2所示，40%溴?！む缦x嗪FSC防治效果最好，為74.81%，50%氯蟲苯甲酰胺FSC次之，為60.65%，二者差異不顯著;50%吡蟲·硫雙威FSC和600 g/L吡蟲啉FSC防治效果較低，分別為29.32%、19.23%，其中50%吡蟲·硫雙威FSC與50%氯蟲苯甲酰胺FSC差異不顯著。

2.3不同種衣劑對華北大黑鰓金龜幼蟲解毒酶活性的影響

2.3.1不同種衣劑對華北大黑鰓金龜幼蟲谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）活性的影響

如圖1所示，經(jīng)50%氯蟲苯甲酰胺FSC和40%溴酰·噻蟲嗪FSC處理48 h時，華北大黑鰓金龜幼蟲體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力顯著低于對照，72、96h后酶活逐漸上升，與對照差異不顯著。經(jīng)4種種衣劑對紅蕓豆的莖干重均無顯著影響。幅為70.18%～74.92%。600 g/L吡蟲啉FSC種子被害指數(shù)最低，為6.96，40%溴?！む缦x嗪FSC種子被害指數(shù)次之，為8.25，二者差異不顯著;50%吡蟲·硫雙威FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC次之，分別為11.19、11.70，但與40%溴?！む缦x嗪FSC差異不顯著。

4種種衣劑都可顯著抑制華北大黑鰓金龜幼蟲的生長，平均體重減輕0.07～0.21g，而空白對照體重平均增加0.14g。

4種種衣劑顯著降低紅蕓豆種子被害指數(shù)，降600g/L吡蟲啉FSC處理48 h時GSTs酶活顯著低于對照，72、96 h時逐漸提升，96 h時顯著高于對照。經(jīng)50%吡蟲·硫雙威FSC處理48 h和72 h，GSTs酶活力與對照無顯著差異;96 h時顯著高于對照。結(jié)果說明：40%溴?！む缦x嗪FSC、50%氯蟲苯甲酰胺FSC和600 g/L吡蟲啉FSC，在48 h均可顯著降低谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶酶活以起到毒殺作用，但隨著處理時間的延長，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力均逐漸升高，且600g/L吡蟲啉FSC對其誘導(dǎo)作用較顯著;600g/L吡蟲啉FSC和50%吡蟲·硫雙威FSC處理96h均可誘導(dǎo)華北大黑鰓金龜幼蟲提高谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶酶活以降解殺蟲劑增加存活率。

2.3.2不同種衣劑對華北大黑鰓金龜幼蟲羧酸酯酶（CarE）活性的影響

如圖2所示，4種藥劑處理48h后華北大黑鰓金龜幼蟲羧酸酯酶活性均顯著高于對照;處理72h后，各處理CarE酶活性均顯著低于對照;處理96h后CarE酶活性均大于等于對照，其中50%氯蟲苯甲酰胺FSC、600 g/L吡蟲啉FSC顯著高于對照，50%吡蟲·硫雙威FSC、40%溴?！む缦x嗪FSC與對照差異不顯著。結(jié)果說明：處理48、72h后，4種種衣劑對羧酸酯酶活性表現(xiàn)為先激活后抑制;96h時50%吡蟲·硫雙威FSC和40%溴酰·噻蟲嗪FSC對羧酸酯酶活性作用不明顯，600g/L吡蟲啉FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC對其有激活作用。酶活的波浪形變化曲線表明，華北大黑鰓金龜幼蟲動態(tài)調(diào)整羧酸酯酶酶活以抵抗4種種衣劑的不良脅迫作用。

3討論

目前，國內(nèi)外關(guān)于紅蕓豆的研究主要集中于營養(yǎng)價值開發(fā)和品種選育，種衣劑的研究甚少。高效種衣劑推廣應(yīng)用的前提和關(guān)鍵是對作物的安全性，本研究結(jié)果表明，4種種衣劑均對紅蕓豆安全，能顯著提高其出苗率、根鮮重和根干重。段強(qiáng)等研究發(fā)現(xiàn)吡蟲啉種衣劑促進(jìn)玉米根長、根數(shù)等增加;尚棟亮等使用40%溴?！む缦x嗪FSC對玉米種子包衣，發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)玉米生長，對幼苗生長安全無害;何發(fā)林等經(jīng)研究證實(shí)2.40、3.20g/kg種子劑量的氯蟲苯甲酰胺對花生出苗安全，以上研究均與本研究結(jié)果一致。

王猛等研究發(fā)現(xiàn)，溴氰蟲酰胺對甜菜夜蛾、玉米螟和小地老虎的毒力比氯蟲苯甲酰胺高，與噻蟲嗪復(fù)配后增加殺蟲譜，提高防蟲效果，與本研究結(jié)果相似，40%溴酰·噻蟲嗪FSC防效最高，為74.81%，50%氯蟲苯甲酰胺FSC次之，為60.65%。何發(fā)林等經(jīng)室內(nèi)盆栽和大田試驗(yàn)證實(shí)了高劑量氯蟲苯甲酰胺對玉米和花生地下害蟲的防效高于吡蟲啉，在本研究中也得到驗(yàn)證，50%氯蟲苯甲酰胺FSC防治效果顯著高于吡蟲啉。復(fù)配種衣劑的防治效果高于單劑，與前人研究結(jié)果一致，50%吡蟲·硫雙威FSC防效高于600g/L吡蟲啉FSC，并且能夠有效減緩抗性的發(fā)展進(jìn)程。因此在生產(chǎn)中應(yīng)首選復(fù)配制劑防治華北大黑鰓金龜幼蟲。本研究中，4種種衣劑對華北大黑鰓金龜幼蟲的防治效果較其他研究低，可能是因?yàn)樵囼?yàn)用蟲蟲齡較大，抵抗力較強(qiáng)，需在田間進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。

近年來，山西省紅蕓豆根腐病發(fā)生較為嚴(yán)重，分析其原因，主要是由于連茬種植，導(dǎo)致病原菌數(shù)量增多，其次是由于土壤中地下害蟲數(shù)量逐年累積，咬食種子及根部，增加病原菌入侵機(jī)會，進(jìn)而增加根腐病發(fā)病率，因此，降低蠐螬為害率對防治根腐病具有重要意義。本研究中，4種種衣劑顯著降低紅蕓豆種子被害指數(shù)，究其原因可能是由于吡蟲啉對蠐螬有驅(qū)避作用或者氯蟲苯甲酰胺和溴氰蟲酰胺作用于魚尼丁受體，破壞昆蟲的肌肉收縮功能，導(dǎo)致其出現(xiàn)拒食現(xiàn)象，進(jìn)而降低對種子的危害程度。建議在蠐螬發(fā)生嚴(yán)重的地塊選用40%溴酰·噻蟲嗪FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC 2種種衣劑，在發(fā)生較輕的地方選擇50%吡蟲·硫雙威FSC和600g/L吡蟲啉FSC 2種種衣劑，降低蠐螬為害率，減少病原菌入侵機(jī)會。

當(dāng)昆蟲受到化學(xué)藥劑脅迫時，會調(diào)節(jié)體內(nèi)的解毒酶活性來抵御逆境脅迫毒害，而使其存活。何發(fā)林等發(fā)現(xiàn)，溴氰蟲酰胺可提高小地老虎體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的活性，但對羧酸酯酶活性表現(xiàn)為前期誘導(dǎo)后期抑制，而余慧靈等報(bào)道溴氰蟲酰胺對甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)解毒酶活性有不同程度的抑制作用。本研究中，4種種衣劑對兩種解毒酶的影響也不相同。40%溴?！む缦x嗪FSC、50%氯蟲苯甲酰胺FSC和600g/L吡蟲啉FSC，在48 h對谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力的影響均表現(xiàn)為抑制作用，隨著處理時間的延長，96 h時600g/L吡蟲啉FSC和50%吡蟲·硫雙威FSC誘導(dǎo)其活性顯著增加。處理48、72h后，4種種衣劑對羧酸酯酶活性表現(xiàn)為先激活后抑制;96h時50%吡蟲·硫雙威和40%溴?！む缦x嗪FSC對羧酸酯酶活性作用不明顯，600g/L吡蟲啉FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC對其有激活作用。說明不同藥劑可能由于作用方式、作用機(jī)理不同，而對同種昆蟲相同或不同解毒酶有不同影響，昆蟲調(diào)節(jié)不同解毒酶應(yīng)對不同藥劑脅迫。因此，在生產(chǎn)中用藥時一定要輪換使用，減緩抗性的產(chǎn)生，提高防效。

綜上所述，4種種衣劑可顯著降低種子被害指數(shù)，增加出苗率，促進(jìn)植物根系生長，并且40%溴?！む缦x嗪FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC對華北大黑鰓金龜幼蟲具有良好的防治效果。建議在紅蕓豆生產(chǎn)中根據(jù)蟲情針對性推廣應(yīng)用，并與其他藥劑輪換使用，以期為根腐病綜合防控提供技術(shù)參考，為紅蕓豆高效種植提供技術(shù)支撐。