任宏彬 花 錦 楊蒲晨 楊曉偉 賈曉婷 張志華
(太原海關(guān)技術(shù)中心,太原030024)
地塞米松是一種人工合成的皮質(zhì)類固醇,具有消炎、抗病毒、促進(jìn)泌乳等多種功效,在養(yǎng)殖業(yè)中被大量使用,造成不同程度藥物殘留,人體攝入過(guò)量可能會(huì)引起激素代謝紊亂、肥胖、骨質(zhì)疏松等病癥,并可能產(chǎn)生致畸、致癌等風(fēng)險(xiǎn)[1~5]。根據(jù)我國(guó)GB 31650-2019 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》 規(guī)定,地塞米松在牛奶中的最大殘留限量為0.3 μg/kg[6]。因此,為保障牛奶飲用安全,有必要建立一種安全、有效地分析牛奶中地塞米松殘留的方法。
目前,地塞米松檢測(cè)手段主要包括酶聯(lián)免疫法[7]、氣相色譜法[8~9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10]、液相色譜法[11~12]和液相色譜-質(zhì)譜法[13~14]等。其中,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法因其具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、分析速度快等優(yōu)點(diǎn),成為獸藥殘留檢測(cè)最有效的方法,被廣泛應(yīng)用于牛奶中地塞米松殘留的檢測(cè)[15~18]。本文基于農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-2-2008 《動(dòng)物源性食品中糖皮質(zhì)激素類藥物多殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[19],通過(guò)簡(jiǎn)化色譜條件,對(duì)比兩種樣品前處理方法的提取效果,改進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方式,旨在建立一種安全、高效、穩(wěn)定的檢測(cè)牛奶中地塞米松殘留的方法,為相關(guān)研究提供借鑒。
(一)材料與試劑學(xué)生飲用奶,大同市牧同乳業(yè)有限公司; 地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品 (純度98.7%),Bepure 公司; 甲醇、正己烷、乙酸乙酯 (色譜純),北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心; 丙酮 (分析純),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司; Silica 固相萃取柱(500 mg/3 mL)、有機(jī)濾膜 (0.22 μm),上海安譜實(shí)驗(yàn)股份科技有限公司。
(二)儀器與設(shè)備LC-30AD 高效液相色譜,LCMS-8050 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 (配有電噴霧離子源ESI),日本Shimadzu 公司; ST40R 高速冷凍離心機(jī),美國(guó)Thermo 公司; vortex genie 2 渦旋混合器,美國(guó)SI 公司; LE244S 電子天平,德國(guó)Sartorius 公司。
(三)試驗(yàn)設(shè)計(jì)
1.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱取地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解配制成濃度為100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。稱取5 份陰性牛奶樣品2.00 g,分別準(zhǔn)確加入稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)貯備液,按照下文步驟進(jìn)行樣品前處理,以最終定容體積得到濃度為1、2、5、10、50 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
2.樣品前處理。(1)提取。稱取牛奶樣品2.00 g 于50 mL 聚丙烯離心管中,加10 mL 乙酸乙酯,渦旋混勻3 min,超聲提取10 min,以8000 r/min離心5 min,移取上層乙酸乙酯,在40℃水浴下氮?dú)獯蹈?,? mL 乙酸乙酯-正己烷(1∶5,V∶V)振蕩溶解殘?jiān)?,待凈化。?)凈化。將溶解液轉(zhuǎn)移到固相萃取柱上 (使用前以3 mL 正己烷進(jìn)行活化),自然流干,以3 mL 正己烷淋洗,抽干。加3 mL 正己烷-丙酮(6∶4,V∶V)洗脫,收集洗脫液,在40℃水浴下氮?dú)獯蹈?,?0%乙腈水溶液定容至1 mL,過(guò)濾膜后待上機(jī)分析。
3.色譜條件。色譜柱為Shim-pack GIST C18(100×2.1 mm,2 μm); 柱流量為0.3 mL/min; 柱溫40℃; 流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為乙腈,等度洗脫,流動(dòng)相比例A∶B 為50∶50;進(jìn)樣體積為10 μL。
4.質(zhì)譜條件。掃描方式為負(fù)離子掃描; 接口電壓4.0 kV; 霧化氣為氮?dú)猓? L/min; 加熱氣流量為10 L/min; DL 溫 度 為250℃; 加 熱 塊 溫 度 為400℃; 碰撞氣為氬氣,270 kPa; 檢測(cè)方式為多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)模式。質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。
表1 MRM 質(zhì)譜參數(shù)
(一)色譜條件的優(yōu)化農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-2-2008 標(biāo)準(zhǔn)[19]中通過(guò)3 種流動(dòng)相 (水-乙腈-甲酸水)對(duì)多種糖皮質(zhì)激素類藥物進(jìn)行梯度洗脫??紤]到本試驗(yàn)僅需檢測(cè)地塞米松,因此,簡(jiǎn)化為2種流動(dòng)相0.1%甲酸水-乙腈 (50∶50,V∶V)進(jìn)行等度洗脫,結(jié)果如圖1 所示,在此條件下,目標(biāo)物在2 min 前出峰,峰型良好,有效節(jié)約了分析時(shí)間。
(二)質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化以5 ng/mL 地塞米松進(jìn)行掃描,對(duì)其母離子、子離子、碰撞能量等條件進(jìn)行優(yōu)化,使分子離子和特征碎片離子強(qiáng)度達(dá)到最大,選擇豐度最高的碎片離子作為定性與定量特征離子,優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。
圖1 5 ng/mL 地塞米松的總離子流色譜圖
(三)前處理方法的對(duì)比驗(yàn)證據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,正己烷脫脂法[20]是將待凈化濾液以正己烷脫脂,定容過(guò)膜后上機(jī)檢測(cè),相較于固相萃取法,在保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下,可有效節(jié)約樣品前處理時(shí)間和試驗(yàn)成本。為驗(yàn)證正己烷脫脂法和固相萃取法的差異,選取陰性牛奶樣品,在加標(biāo)濃度5 μg/kg下,分別按照文獻(xiàn)中的正己烷脫脂法和本試驗(yàn)中的固相萃取法對(duì)樣品進(jìn)行前處理后上機(jī)檢測(cè),結(jié)果如圖2 所示。
圖2 兩種前處理方法加標(biāo)檢測(cè)結(jié)果質(zhì)譜圖對(duì)比
由圖2 中2 種前處理方法加標(biāo)檢測(cè)結(jié)果質(zhì)譜圖對(duì)比可知,在相同加標(biāo)濃度下,正己烷脫脂法檢測(cè)結(jié)果存在明顯的雜峰干擾,且目標(biāo)峰強(qiáng)度相對(duì)較低; 而固相萃取法檢測(cè)結(jié)果目標(biāo)峰峰型尖銳對(duì)稱,響應(yīng)強(qiáng)度高,雜峰干擾小,更有利于定量分析。另外,在前處理過(guò)程中發(fā)現(xiàn),正己烷脫脂法在脫脂后,濾液呈白色渾濁狀態(tài),過(guò)濾膜時(shí)阻力較大,說(shuō)明存在大顆粒雜質(zhì),上機(jī)液呈白色半透明狀,存在阻塞管路、污染離子源的可能; 而固相萃取法定容后的濾液和過(guò)濾膜后的上機(jī)液均澄清透明,更有利于對(duì)儀器的保護(hù)。雖然正己烷脫脂法可在一定程度上節(jié)約時(shí)間和試驗(yàn)成本,但從峰型、響應(yīng)強(qiáng)度和儀器安全風(fēng)險(xiǎn)角度考慮,選擇固相萃取法更為可靠。
(四)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和精密度試驗(yàn)在痕量分析中,樣品前處理過(guò)程常常伴隨著目標(biāo)物的損失,影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,同位素內(nèi)標(biāo)法[21]可有效降低這一影響,但同位素內(nèi)標(biāo)往往價(jià)格昂貴,大幅提高了試驗(yàn)成本。因此,采用兩種方式進(jìn)行定量。方式1 采用外標(biāo)法,參考農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-2-2008 標(biāo)準(zhǔn)[19]要求,準(zhǔn)確移取地塞米松標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,以20%乙腈水溶液稀釋,配制成濃度為1、2、5、10、50 ng/mL 的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液; 方式2 采用標(biāo)準(zhǔn)加入法,按照本試驗(yàn)所述標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制步驟操作。將兩組標(biāo)準(zhǔn)工作液上機(jī)檢測(cè),以目標(biāo)化合物峰面積(Y)與濃度(X)進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 地塞米松的兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方式的線性回歸方程
由表2 可知,兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方式的線性關(guān)系良好,但各濃度點(diǎn)峰面積差別較大,方式1 是方式2 對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)峰面積的3~5 倍,表明受樣品前處理過(guò)程的影響,目標(biāo)物損失較為明顯。為進(jìn)一步驗(yàn)證兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方式的適用性,在線性范圍內(nèi)選擇0.5、2.5、5.0 μg/kg 水平加標(biāo)濃度(每個(gè)濃度點(diǎn)平行測(cè)定6 次),按照本試驗(yàn)所選擇的固相萃取法進(jìn)行前處理后上機(jī)檢測(cè),分別代入上述兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性擬合,考查回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 地塞米松在三水平加標(biāo)濃度下的回收率及精密度 (%)
由表3 可知,3 水平加標(biāo)檢測(cè)結(jié)果代入方式1所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線中,平均回收率<20%,RSD>10%,無(wú)法滿足實(shí)驗(yàn)要求; 代入方式2 所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線中,平均回收率在65.7%~85.7%,RSD<10%,滿足農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-2-2008 標(biāo)準(zhǔn)[19]中關(guān)于地塞米松在牛奶樣品中的回收率 (50%~120%)及精密度(<20%)要求。因此,選擇標(biāo)準(zhǔn)加入法定量結(jié)果更為準(zhǔn)確。
(五)方法定量限和檢出限準(zhǔn)確移取稀釋后的地塞米松標(biāo)準(zhǔn)貯備液逐級(jí)遞減添加到空白樣品中,按照上文選擇的固相萃取法和條件進(jìn)行處理和分析,以10 倍信噪比作為定量限,如圖3 所示,加標(biāo)濃度為0.25 μg/kg 可作為地塞米松在牛奶中的定量限,依據(jù)定量限為3 倍檢出限原則,得到方法檢出限約為0.08 μg/kg,滿足農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-2-2008 標(biāo)準(zhǔn)[19]中關(guān)于地塞米松在牛奶樣品中的靈敏度(定量限0.2 μg/L)要求。
圖3 牛奶中地塞米松加標(biāo)濃度為0.25 μg/kg 時(shí)檢測(cè)結(jié)果質(zhì)譜圖
(六)樣品檢測(cè)抽取當(dāng)?shù)刂行W(xué)的牛奶樣品14 份,采用本方法對(duì)其地塞米松殘留進(jìn)行測(cè)定,與農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-2-2008 標(biāo)準(zhǔn)[19]中的檢測(cè)方式和定量方法相比,可有效節(jié)約試驗(yàn)成本,提高分析準(zhǔn)確度。結(jié)果均未檢出地塞米松殘留,滿足食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于牛奶中地塞米松最大殘留限量的要求。
本研究通過(guò)簡(jiǎn)化農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-2-2008標(biāo)準(zhǔn)[19]中的流動(dòng)相組合,縮短分析時(shí)間,優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù),對(duì)比兩種樣品前處理方法,改進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方式,建立了檢測(cè)牛奶中地塞米松殘留的固相萃取-高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法。該方法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、可靠,能夠滿足實(shí)驗(yàn)室對(duì)批量牛奶樣品中地塞米松殘留的檢測(cè)要求。