劉紅云 吳昊 張莉 許世富 吳蕾 明文慶 蔡一杰 許曉靖

摘要 [目的]采用二極管陣列高效液相色譜法，建立飼料中莫昔克丁的檢測(cè)方法。[方法]樣品經(jīng)乙腈溶液提取后，通過(guò)HLB 6cc SPE固相萃取小柱凈化，C18色譜柱分離;以醋酸-醋酸銨緩沖液（pH 4.8）（取醋酸銨7.7 g，加水400 mL溶解后，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.8）-乙腈（400∶600）為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為242 nm;柱溫50 ℃;流速為2.5 mL/min。[結(jié)果]莫昔克丁在5～100 μg/mL具有良好的線性關(guān)系（R.2=0.999 0）。檢出限為0.5 mg/kg，定量限為1.0 mg/kg。樣品在定量限1倍、2倍、10倍3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為95.0%～105.2%，批內(nèi)、批間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，日間和日內(nèi)變異系數(shù)均低于15%。[結(jié)論]該試驗(yàn)建立的HPLC法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，可用于飼料中莫昔克丁的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞 飼料;莫昔克丁;含量測(cè)定;HPLC法

中圖分類號(hào) S816.17文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2021）07-0197-02

Abstract [Objective]A method for the determination of moxidectin feed by diode array high performance liquid chromatography （DADHPLC）was established.[Method]The sample was extracted by acetonitrile solution and purified by HLB 6cc SPE SPE solid phase extraction column. The mobile phase was acetic acidammonium acetate buffer （pH 4.8） （7.7 g ammonium acetate was dissolved in 400 mL water， and pH was adjusted to 4.8 with glacial acetic acid）acetonitrile （400∶600） as the mobile phase;the detection wavelength was 242 nm;the column temperature was 50 ℃;the flow rate was 2.5 mL/min. [Result]There was a good linear relationship in the range of 5-100 μg/mL （R.2=0.999 0）. The detection limit was 0.5 mg/kg and the limit of quantitation was 1.0 mg/kg. The average recoveries of the samples were 950% - 105.2% at 1， 2 and 10 times of the limit of quantification （LOQ）. The intra and inter assay relative deviations were less than 10%， and the interday and intraday coefficients of variation were less than 15%. [Conclusion]The HPLC method established in this experiment is simple， sensitive and accurate， and can be used to determine the content of moxidectin in feed.

Key words Feed;Moxidectin;Content determination;HPLC method

作者簡(jiǎn)介 劉紅云（1975—），女，安徽合肥人，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，從事獸藥、飼料、畜牧產(chǎn)品檢測(cè)和研究工作。

莫昔克丁是一種新型抗寄生蟲(chóng)藥，是由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生、成分單一、半合成的大環(huán)內(nèi)酯類藥物。莫昔克丁比阿維菌素類藥物具有更好的驅(qū)蟲(chóng)活性，同時(shí)具有長(zhǎng)效、安全等特性，且極低劑量下就有很強(qiáng)的抗線蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物等體內(nèi)外寄生蟲(chóng)活性，對(duì)豬體內(nèi)的消化道線蟲(chóng)、肺線蟲(chóng)和體外寄生蟲(chóng)都有良好的驅(qū)殺效果[1-5]。20世紀(jì)80年代中期，莫昔克丁開(kāi)始作為獸用驅(qū)蟲(chóng)藥使用。作為新一代驅(qū)蟲(chóng)藥物，莫昔克丁能夠高效地殺滅線蟲(chóng)和體表寄生蟲(chóng)，同時(shí)對(duì)動(dòng)物有很好的安全性?，F(xiàn)有的殺蟲(chóng)劑伊維菌素、阿維菌素等異味較大，施用后無(wú)論是對(duì)于動(dòng)物還是使用者而言都有較為嚴(yán)重的感官刺激。有效防治寄生蟲(chóng)病，定期驅(qū)蟲(chóng)、殺蟲(chóng)是養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的重要工作。但是隨著民眾對(duì)食品安全的重視，需要合理規(guī)范用藥[6-7]。目前文獻(xiàn)報(bào)道中尚無(wú)飼料中莫昔克丁的含量測(cè)定。該試驗(yàn)參照相關(guān)文獻(xiàn)，采用乙腈提取，通過(guò)HLB 6cc SPE固相萃取小柱凈化，C18色譜柱分離，旨在建立靈敏度高的、快速高效的二極管陣列高效液相色譜法，制定莫昔克丁在飼料中的檢測(cè)方法[8-10]，以期為飼料安全保駕護(hù)航。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

U3000戴安高效液相色譜儀，配安二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)熱電公司;BT-125D 電子天平，賽多利斯;KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;立式低溫高速離心機(jī)CF16RN，日立公司;IKA渦旋混合機(jī)，上海滬西分析儀器廠有限公司;HGG-12A氮吹儀，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司;HEI-VAP型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，德國(guó)海道夫;HLB 6cc SPE固相萃取柱（500 mg/6 mL填料）;0.22 μm微孔濾膜，天津津騰試驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 藥品與試劑

莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)品Dr 113507-06-5，德國(guó);乙醇、甲醇、醋酸、醋酸銨，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán);乙腈、甲醇為色譜純，美國(guó)Biopure;試驗(yàn)用水為 milli-Q 超純水。洗脫液為95%乙醇-甲醇（95∶5）。

莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備：精密稱取莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，置于50 mL容量瓶中，加乙腈溶解定容，該溶液中莫昔克丁濃度為2 mg/mL，于冰箱4 ℃保存，可使用1個(gè)月。

1.3 樣品處理

1.3.1 提取。取5.0 g（預(yù)混合飼料2.0 g）樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL乙腈均質(zhì)提取1 min，80 000 r/min離心10 min，備用。

1.3.2 凈化。精密量取5 mL上清液，直接過(guò)HLB 6cc SPE固相萃取柱，收集全部流出液，加10 mL洗脫液，收集流出液與洗脫液于茄形瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在60～70 ℃蒸干，精密加入2 mL乙腈定容，過(guò)0.22 μm微孔濾膜上機(jī)檢測(cè)。

1.4 色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相為醋酸-醋酸銨緩沖液（pH 4.8）（取醋酸銨7.7 g，加水400 mL溶解后，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.8）-乙腈（400∶600），檢測(cè)波長(zhǎng)為242 nm;柱溫50 ℃;流速為2.5 mL/min。色譜和光譜圖見(jiàn)圖1～3。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密量取“1.2”標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量，加乙腈稀釋成濃度約為5、10、20、50、100 μg/mL的系列溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程為Y=0.469 2X+0.084（R.2=0.999 0），表明莫昔克丁濃度在5～100 μg/mL與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 檢出限和定量限

添加適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于空白飼料中，經(jīng)提取后測(cè)定，以信噪比（S/N）為3作為方法的檢出限（LOD），以信噪比（S/N）為10作為方法的定量限（LQD），得出莫昔克丁的檢出限為0.5 mg/kg，定量限為1.0 mg/kg。

2.3 回收率和精密度測(cè)定

在空白飼料樣品中添加莫昔克丁定量限的1倍（1.0 mg/kg）、2倍（2.0 mg/kg）、10倍（10.0 mg/kg）3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平的濃度做5個(gè)平行樣品，連續(xù)測(cè)定3次，求其平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。 結(jié)果顯示（表1），莫昔克丁在3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率為95.0%～105.5%，批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。

3 討論

3.1 樣品提取及凈化方法的優(yōu)化

莫昔克丁不溶于水，易溶于甲醇、乙腈、乙醇等溶劑。飼料成分復(fù)雜，尤其是預(yù)混料，粉塵顆粒較多，若凈化效果不好將嚴(yán)重影響結(jié)果的判定，而且飼料樣品基質(zhì)復(fù)雜，因此對(duì)樣品基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了考察。制備了3個(gè)樣品，分別為標(biāo)準(zhǔn)品溶液、空白樣品基質(zhì)提取后添加標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品基質(zhì)提取前添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3”方法制成上機(jī)樣品。試驗(yàn)結(jié)果顯示，無(wú)明顯基質(zhì)效應(yīng)。

飼料基質(zhì)復(fù)雜，不同的提取溶劑對(duì)回收率的影響較大。該研究考察了甲醇、乙腈、乙醇作為提取劑對(duì)莫昔克丁回收率的影響，乙腈是一種中等極性的提取溶劑，與大多數(shù)獸藥的極性較接近，試驗(yàn)結(jié)果顯示，乙腈的提取效率最好，對(duì)不同濃度的添加試驗(yàn)其回收率均高于80%，符合飼料中藥物檢測(cè)的要求。在對(duì)均質(zhì)時(shí)間、離心的轉(zhuǎn)速和時(shí)間的選擇上，通過(guò)試驗(yàn)最終確定均質(zhì)1 min、8 000 r/min離心10 min的除雜效果最好。

該試驗(yàn)用固相萃取技術(shù)進(jìn)行樣品凈化?？疾炝薓CX、PCX、WCX、HLB 4種固相萃取柱對(duì)目標(biāo)物回收率和穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)HLB柱好于MCX、PCX、WCX，HLB固相萃取小柱有別于傳統(tǒng)的固相萃取小柱，它凈化時(shí)也不需要不同極性或pH的溶劑進(jìn)行淋洗、洗脫等，該小柱能極大地提高樣品分析通道。試驗(yàn)最終選用HLB固相萃取柱。在洗脫液的選擇上，分別考察了95%乙醇-甲醇95∶5、80∶20、60∶40、40∶60、20∶80這5種體積比例的洗脫液，試驗(yàn)結(jié)果顯示95%乙醇-甲醇體積比例為95∶5時(shí)，目標(biāo)物的回收率最高，最后確定洗脫液為95%乙醇-甲醇（95∶5）。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

莫昔克丁在反相色譜柱上能較好的保留，采用C18色譜柱分離，莫昔克丁峰形良好，受基質(zhì)干擾少。試驗(yàn)選擇了4款不同品牌的反相色譜柱Phenomenex Luna C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）、Waters XSelect CSH C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Aglient Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和依特利SinoChromODS-AP8（4.6 mm×250 mm，5 μm）進(jìn)行樣品分析，結(jié)果表明4種品牌色譜柱均可使莫昔克丁分離度、理論塔板數(shù)、對(duì)稱因子良好。

4 結(jié)論

該研究采用乙腈溶液提取，通過(guò)HLB 6cc SPE固相萃取小柱凈化，C18色譜柱分離，建立了二極管陣列HPLC法測(cè)定飼料中莫昔克丁的方法。結(jié)果顯示，莫昔克丁5～100 μg/mL具有良好的線性關(guān)系（R.2=0.999 0）。檢出限為0.5 mg/kg，定量限為1.0 mg/kg。樣品在定量限1倍、2倍、10倍3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為95.0%～105.2%，批內(nèi)、批間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，日間和日內(nèi)變異系數(shù)均低于15%。該試驗(yàn)建立的HPLC法靈敏度高、專屬性強(qiáng)，滿足復(fù)雜飼料中莫昔克丁含量的測(cè)定。

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