余佳熹，張佳琪，何貴平，鄧莎，呂遠(yuǎn)平，2*

（1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065；2.四川大學(xué)健康食品科學(xué)評價(jià)體系研究中心，四川 成都 610065）

咖啡堿又名 1，3，7-三甲基-2，6-二氧嘌呤，是一種普遍存在于植物中的嘌呤類生物堿物質(zhì)[1]，多從咖啡果[2]、可可豆[3]、可拉果、茶葉[4]等中提取而得?？Х葔A是一種中樞神經(jīng)興奮劑，人們獲取咖啡堿的產(chǎn)品包括咖啡、能量飲料、藥丸、茶水和蘇打水[5]。然而，咖啡堿的使用可能會(huì)影響健康狀況[6]，有研究表明高劑量地?cái)z入咖啡堿會(huì)降低睡眠效率[7]，引起焦慮[8]、頭疼、心血管疾病[9]，甚至胎兒畸形[10]、孕期婦女流產(chǎn)[11]、青少年鈣流失[12]、運(yùn)動(dòng)功能受損[13-15]等不良影響，過度攝入咖啡堿還會(huì)影響人體對鐵的吸收，從而造成貧血[16]。因此，低咖啡堿制品越來越受到消費(fèi)者的歡迎。

目前主要的脫除咖啡堿的方法有水脫除法[17]、吸附分離法[18]、溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法[19]以及微生物法等。但前幾種方法耗時(shí)費(fèi)力且咖啡堿降解率不高，還會(huì)對環(huán)境造成一定程度的污染，而微生物法以安全無毒、降解效率高的優(yōu)點(diǎn)獲得了越來越多學(xué)者的青睞。國內(nèi)外專家經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌類的假單胞菌以及真菌類的曲霉菌降解咖啡堿的效果較好，但大多都不能直接應(yīng)用于食品當(dāng)中。因此本試驗(yàn)從茶葉基地土壤中篩選純化出一株具有咖啡堿降解能力的酵母菌株，對其進(jìn)行鑒定分析，并通過優(yōu)化降解條件的方式提高其降解咖啡堿的能力，以期獲得一株可應(yīng)用于食品行業(yè)的具有脫除咖啡堿能力的菌株。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

本試驗(yàn)中所用的土壤由貴州省畢節(jié)市金沙縣茶葉種植基地提供；咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、KH2PO4（均為分析純）：成都科隆化學(xué)品有限公司；YPD培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（internal transcriptional spacer sequence，ITS）測定委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高溫高壓蒸汽滅菌鍋（YXQ-30SI）：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；高效液相色譜儀（1260InfinityⅡ，配有7890A自動(dòng)進(jìn)樣氣相色譜儀）：安捷倫科技有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（MJ-250）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；光吸收型酶標(biāo)儀（SPECTRA MAX190）：美國分子儀器公司。

1.3 培養(yǎng)基配方

培養(yǎng)基配制方法如表1所示。

表1 培養(yǎng)基的配制Table 1 Culture medium

1.4 方法

1.4.1 可降解咖啡堿菌株的篩選與鑒定

1.4.1.1 菌株的篩選

以植株根系附近的土壤為媒介，經(jīng)3次富集培養(yǎng)后，稀釋富集液，配成不同濃度的菌懸液。將菌懸液涂布于固體篩選培養(yǎng)基中，30℃恒溫條件下培養(yǎng)72 h，選取固體篩選培養(yǎng)基中的單菌落，并經(jīng)多次平板劃線將其分離純化。

1.4.1.2 菌株的鑒定

通過菌落形態(tài)觀察、細(xì)胞形態(tài)記錄以及對ITS進(jìn)行DNA測序，鑒定菌株的種屬情況。

1.4.2 生長曲線的測定

取活化后的菌株，以2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種至降解培養(yǎng)基中，在30℃，120 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)4 d，每隔6 h在600 nm下檢測菌液濃度。

1.4.3 咖啡堿降解率測定

高效液相色譜條件[20]：色譜柱：Poroshell 120 ECC18（4.6mm×150mm，4μm）；柱溫：30℃；流速：1mL/min；檢測波長285 nm；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相A：0.5%甲酸水溶液，B：甲醇，梯度洗脫，洗脫程序如表2所示。

表2 高效液相色譜條件Table 2 Gradient operation in HPLC

咖啡堿降解率計(jì)算方法見公式（1）。

1.4.4 降解條件對咖啡堿降解率的影響

1.4.4.1 單因素試驗(yàn)

將活化后的菌種（活菌數(shù)為1×108CFU/mL）培養(yǎng)28 h后，分別以溫度（20、24、28、32、37℃），菌種添加量（2%、4%、6%、8%、10%），發(fā)酵時(shí)間（12 h～72 h，每隔 4 h取樣測定），搖床速度（100、120、140、160、180 r/min），咖啡堿添加量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL）為因素設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，其它條件分別固定為咖啡堿添加量0.5 mg/mL、菌種添加量4%、搖床速度140 r/min、溫度28℃，以咖啡堿降解率為指標(biāo)探究菌種降解咖啡堿的條件。

1.4.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取溫度、菌種添加量、發(fā)酵時(shí)間、咖啡堿添加量4個(gè)因素，以咖啡堿降解率為評價(jià)指標(biāo)，對菌種降解咖啡堿的工藝進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見表3。使用Design Expert 11軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 3 Factors and levels of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 可降解咖啡堿菌株的篩選與鑒定

經(jīng)分離和純化，得到一株可降解咖啡堿的菌種，命名為Y-1。Y-1菌株在YPD培養(yǎng)基上的形態(tài)如圖1所示。

圖1 Y-1菌形態(tài)觀察圖Fig.1 Morphological observation of Y-1 bacteria

該菌的單個(gè)菌落呈圓形，菌落較大較厚，為乳白色，表面濕潤且黏稠，容易被挑起。由圖1（B）Y-1菌株在40倍光學(xué)顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)，可觀察到視野中細(xì)胞呈圓形或橢圓形，且較大的母體細(xì)胞旁有芽體存在。

根據(jù)基因序列，使用MEGAX 10.1.8軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。

圖2 Y-1菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of strain Y-1

結(jié)果表明Y-1菌株與Saccharomyces cerevisiae（釀酒酵母）同源性最高。經(jīng)形態(tài)學(xué)和ITS基因測序與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，可以確定菌株Y-1屬于酵母菌屬。

2.2 生長狀況與降解能力分析

釀酒酵母Y-1菌株在含有1 mg/mL咖啡堿的降解培養(yǎng)基中生長，生長狀況如圖3所示。

圖3 Y-1菌種在液體篩選培養(yǎng)基中的生長情況Fig.3 Growth of Y-1 strain in liquid screening medium

釀酒酵母通常在5 h～12 h內(nèi)就會(huì)進(jìn)入對數(shù)生長期快速生長，釀酒酵母Y-1菌株在含有1 mg/mL咖啡堿的降解培養(yǎng)基中遲滯期延長到了22h，說明咖啡堿的存在對釀酒酵母Y-1菌株的生長有抑制作用。在30℃培養(yǎng)22 h后，菌體細(xì)胞密度（OD600）迅速上升，開始進(jìn)入對數(shù)生長期，并在42 h時(shí)OD600值達(dá)到了0.600 2±0.023。

2.3 降解條件對菌種生長和咖啡堿降解率的影響

2.3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 培養(yǎng)條件對咖啡堿降解率的影響Fig.4 Effects of culture conditions on theine degradation rate

從圖4（A）中可知，咖啡堿降解率隨時(shí)間的增加呈“S形”曲線式增加。在培養(yǎng)的20 h～36 h內(nèi)，釀酒酵母Y-1菌株迅速代謝咖啡堿，并在第36小時(shí)達(dá)到了（39.06±2.38）%。36 h后咖啡堿的降解速率趨緩，52 h后咖啡堿降解率趨于穩(wěn)定，在72 h時(shí)咖啡堿降解率為（45.85±1.52）%。

由 4（B）可知，釀酒酵母 Y-1 菌株在 32、28、24 ℃的培養(yǎng)條件下，降解咖啡堿的能力較好。釀酒酵母是兼性厭氧菌，在氧氣存在的環(huán)境下進(jìn)行有氧呼吸，大量繁殖，將葡萄糖分解為二氧化碳和水，并產(chǎn)生大量能量；在氧氣不足的情況下進(jìn)行無氧呼吸，產(chǎn)生乙醇、水和少量能量。搖床的速度主要影響的是培養(yǎng)液中氧氣的含量。從圖4（C）可知，搖床速度對釀酒酵母Y-1菌株利用咖啡堿進(jìn)行代謝的影響較小，雖然咖啡堿的降解率隨搖床速度的增加而增加，但各個(gè)速度之間的咖啡堿降解率差別不明顯。

由4（D）可知，當(dāng)菌種添加量為10%時(shí)，培養(yǎng)的前20 h內(nèi)咖啡堿的降解率都高于其它菌種添加量，但在20 h后其降解速率趨于平緩，并逐漸低于其它菌種添加量。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由于環(huán)境營養(yǎng)有限，大量的釀酒酵母Y-1菌株過快地消耗了營養(yǎng)物質(zhì)，使得環(huán)境內(nèi)菌株的衰亡期提前到來，最終影響了咖啡堿的降解率。當(dāng)菌種添加量為6%時(shí)，咖啡堿的降解率最高，其次是4%和8%的菌種添加量，因此可選擇4%～8%作為較佳的菌種添加量。

由圖4（E）可知，當(dāng)咖啡堿添加量高于2 mg/mL時(shí)，釀酒酵母Y-1菌株對咖啡堿的利用率迅速下降，這可能是因?yàn)檩^高濃度的咖啡堿抑制了菌株的生長。釀酒酵母Y-1菌株在咖啡堿添加量為0.5 mg/mL～1.5 mg/mL時(shí)降解咖啡堿的能力較好，可以用于脫除茶葉中的咖啡堿。

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表4所示。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Results of response surface experiments

續(xù)表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 4 Results of response surface experiments

非線性回歸二次多項(xiàng)式擬合分析得到咖啡堿降解率與各個(gè)因素間的回歸方程：Y=47.56+3.88A+0.805 8B+3.22C-8.36D+1.08AB-1.02AC-3.08AD+0.122 5BC+0.330 0BD-2.20CD-2.06A2-4.38B2-0.722 9C2-1.24D2。

方差分析結(jié)果見表5。

表5 回歸方程方差分析結(jié)果Table 5 Analysis results of regression and variance

由表5可知，該模型回歸性極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.860 3＞0.05），說明模型在回歸區(qū)域內(nèi)的擬合度較高，實(shí)測值與預(yù)測值之間的相關(guān)性良好?；貧w方程中的一次項(xiàng)A、B、C、D都極顯著，交互項(xiàng)AD、CD以及二次項(xiàng)A2、B2、D2也均達(dá)到了極顯著水平，這表明各因素對響應(yīng)值的影響不是呈簡單的線性關(guān)系的。各因素對酵母菌Y-1降解咖啡堿的影響程度大小順序?yàn)椋嚎Х葔A添加量＞溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞菌種添加量。

各因素交互作用對咖啡堿降解率影響的響應(yīng)面圖見圖5。

圖5 各因素交互作用對咖啡堿降解率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot and contour map showing the interactive effects of two factors on decaffeination rate

采用Design Expert 11軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化預(yù)測，選擇咖啡堿降解率最大值為排序條件，模型預(yù)測出的最優(yōu)條件為：發(fā)酵溫度30.673℃、發(fā)酵時(shí)間46.636 h，咖啡堿添加量0.530 mg/mL、菌種添加量6.906%，此條件下咖啡堿降解率為59.800%。結(jié)合試驗(yàn)中實(shí)際操作的可能性，將參數(shù)調(diào)整為：發(fā)酵溫度31.00℃、發(fā)酵時(shí)間46.60 h，咖啡堿添加量0.50 mg/mL、菌種添加量6.90%。在修正參數(shù)的條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，咖啡堿降解率為（59.39±0.28）%，與預(yù)測值相比，相對誤差為（1.06±0.28）%。

3 結(jié)論

從茶葉種植基地的土壤中分離得到一株可降解咖啡堿的真菌，命名為Y-1，經(jīng)過對其表型特征分析、ITS測序分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析鑒定為釀酒酵母的同源菌。以咖啡堿降解率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)得到最佳培養(yǎng)條件為：發(fā)酵溫度31.00℃、發(fā)酵時(shí)間46.60 h，咖啡堿添加量0.50 mg/mL、菌種添加量6.90%。在此條件下，菌株Y-1在培養(yǎng)基中的咖啡堿降解率最高可達(dá)（59.39±0.28）%。將其應(yīng)用于食品行業(yè)生產(chǎn)茶酒飲料，可以有效去除產(chǎn)品中的咖啡堿，對低咖啡堿產(chǎn)品的開發(fā)具有重要意義。