初正帥，彭效明，蔡青蔓，段陽，梁曉旭

(北京石油化工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，北京 102600)

桑葉多糖具有降血糖、降血脂、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種功能，近代中醫(yī)學(xué)家也常將桑葉配伍于中藥復(fù)方中，應(yīng)用于臨床，且多獲效。另外，植物多糖對(duì)體液免疫、細(xì)胞免疫、單核巨噬細(xì)胞、細(xì)胞因子等方面都具有調(diào)節(jié)作用。部分科學(xué)家發(fā)現(xiàn)近年桑葉多糖已成為植物活性成分研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。桑葉多糖含有單糖（果糖、葡萄糖等）、低聚糖（蔗糖）、多糖（MPA-1、PMP-11、PMP-12等）[1-2]。

目前，桑葉多糖提取與分離常采用煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流法等[3-9]，在這些方法操作過程中常用甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、甲苯、乙醚等有機(jī)溶劑，但它們具有較強(qiáng)的揮發(fā)性或毒性，在生產(chǎn)過程中會(huì)引起環(huán)境污染。而離子液體具有不揮發(fā)、液程寬、溶解強(qiáng)、可設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)等特性。將離子液體作為萃取劑，不僅對(duì)環(huán)境友好，而且能提高選擇性，增加萃取化合物的范圍，集合高效萃取和欲富集的優(yōu)點(diǎn)。而將離子液體雙水相體系運(yùn)用到桑葉有效成分的萃取工作中更是一個(gè)很好的嘗試。Gutowski等采用親水性離子液體1-丁基-3-甲基咪唑鹽酸鹽和磷酸鉀（K3PO4）首次提出了離子液體雙水相體系這一概念[10]。離子液體雙水相比較于傳統(tǒng)雙水相既為萃取營造了溫和的環(huán)境，又避免了萃取過程中有機(jī)溶劑的使用，具備萃取率高、兩相界面清晰、黏度低、綠色環(huán)保、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。因此近年來離子液體在分離天然活性物質(zhì)方面被廣泛研究[11-20]。

本文對(duì)離子液體和雙水相體系在桑葉多糖提取工藝方面進(jìn)行了研究，為桑葉多糖的有效開發(fā)，以及如何將離子液體應(yīng)用在桑葉多糖的開發(fā)中奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉：北京市大興區(qū)安定鎮(zhèn)御林古桑園。

氫氧化鉀、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀（分析純）：北京化工廠；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀（分析純）：北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；無水碳酸鉀、硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉、硫酸銨（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；蒽酮、無水碳酸鈉（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；硫酸（分析純）：北京興青紅精細(xì)化學(xué)品科技有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）：北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；無水氯化鈣(分析純)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鈉（分析純）：天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠。

1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽、1-羥乙基-2，3-二甲基咪唑氟鹽、1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽、谷氨酸雙三氟甲磺酰亞胺鹽、1-丁基-3-甲基咪唑雙三氟甲烷酰亞胺鹽、羥乙基三甲基氯化銨、1-羥乙基-3-甲基咪唑氯鹽、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽、1-庚基-3-甲基咪唑氯鹽、1-辛基-3-甲基咪唑氯鹽、1-戊基-3-甲基咪唑氯鹽、1-癸基-3-甲基咪唑氯鹽、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽、1-己基-3-甲基咪唑氯鹽（純度≥99%，分析純）：中科院蘭州化學(xué)物理研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

CP224C電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；DT5-4B低速離心機(jī)：北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；KH-500DB數(shù)控超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；WE-2B玻璃儀器氣流烘干器：（鄭州）長城科工貿(mào)有限公司；UV2600紫外可見分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器：金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖100 mg，混勻后用蒸餾水溶解并定容至100 mL。量取20 mL并定容至100 mL，得到濃度為0.2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，待用。

1.3.2 蒽酮試劑的配制

精密稱取蒽酮0.2 g，加入濃硫酸100 mL，完全溶解后，置于棕色瓶?jī)?nèi)，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

依次量取葡萄糖標(biāo)品 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.5 mg置于10 mL具塞試管中，加入4 mL現(xiàn)配的蒽酮試劑，100℃油浴加熱10 min，冷卻至室溫25℃后，靜置20 min，于620 nm下測(cè)定吸光度（葡萄糖濃度=標(biāo)品濃度×所加標(biāo)品體積/總體積；總體積=標(biāo)品體積+蒽酮試劑體積）。

1.3.4 篩選合適的離子液體

稱取一定質(zhì)量的無機(jī)鹽（以該無機(jī)鹽0.01 mol計(jì)算）和1 g的離子液體混合于10 mL水中振蕩后靜置，觀察是否有雙水相形成；若無，則放入數(shù)控超聲波清洗器中超聲至有雙水相形成，若超聲時(shí)間超過105 min，則可表明無雙水相形成（超聲提取溫度低，有利于萃取一些熱不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物，在超聲場(chǎng)的作用下，由于超聲的空化作用，相間的傳質(zhì)速度更快，因而萃取效果更好）。

1.3.5 確定最優(yōu)的離子液體濃度

在提取溫度為80℃，提取時(shí)間為90 min，料液比為桑葉∶水=1∶17（g/mL）的條件下，于離子液體濃度 0～0.001 mol/mL范圍內(nèi)配制不同濃度溶液，在轉(zhuǎn)速為2 500 r/min條件下離心3 min，量取離心后液體的體積并記錄；用0.2 mL移液管量取離心后上清液0.1 mL，定容至10 mL容量瓶中；再用1 mL移液管量取定容后液體1 mL于試管中，加入4 mL配制的蒽酮溶液，封口，100℃油浴加熱10 min，冷卻（20 min左右）至室溫25℃，于620 nm下測(cè)吸光度，比較吸光度值并確定最優(yōu)的離子液體濃度。

1.3.6 單因素試驗(yàn)方法

以已知離子液體濃度配制的溶液為研究對(duì)象，以吸光度為指標(biāo)，在單變量的情況下考察提取溫度、提取時(shí)間、料液比對(duì)桑葉中多糖提取結(jié)果的影響[4]。在單因素的考察中，因?yàn)殡x子液體的存在，參比溶液的獲得難度較大，故而雙水相中更多考慮的是不同條件下的相對(duì)值，吸光度有負(fù)數(shù)出現(xiàn)，但不影響各個(gè)參數(shù)之間的定性趨勢(shì)判斷。

1.3.6.1 提取溫度的影響

在提取時(shí)間為 90 min，料液比為桑葉∶水=1∶17（g/mL），最優(yōu)離子濃度下，在不同溫度下油浴加熱，測(cè)其吸光度確定適宜溫度；考察提取溫度分別為60、70、80、90、100℃。

1.3.6.2 提取時(shí)間的影響

在料液比為桑葉∶水=1∶17（g/mL），適宜提取溫度和最優(yōu)離子液體濃度下，油浴加熱不同時(shí)間，測(cè)其吸光度確定適宜的提取時(shí)間；考察提取時(shí)間分別為30、60、90、120、150 min。

1.3.6.3 料液比的影響

在已確定最優(yōu)離子液體濃度、適宜提取溫度和提取時(shí)間的試驗(yàn)條件下，測(cè)定不同料液比下吸光度確定適宜料液比；考察料液比分別為 1∶13、1∶14、1∶17、1∶20、1∶21（g/mL）。

1.3.6.4 響應(yīng)面試驗(yàn)方法

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理優(yōu)化工藝條件，并采用Design Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Level of experimental factors and coding

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，線性方程為：Y=33.239X-0.276 5，R2=0.999 8。結(jié)果表明，葡萄糖濃度在0～0.06 mg/mL的范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 離子液體篩選

選擇15種離子液體分別與不同的無機(jī)鹽進(jìn)行試驗(yàn)。選用的無機(jī)鹽分別為磷酸氫二鉀、無水氯化鈣、氫氧化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸銨、無水碳酸鉀、硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、磷酸二氫鈉。依次進(jìn)行超聲波分層效果的試驗(yàn)，試驗(yàn)得出1-辛基-3-甲基咪唑氯鹽、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽、1-丁基-3-甲基咪唑雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽這5種離子液體在加入大部分的無機(jī)鹽后都可以發(fā)生分層現(xiàn)象，其中1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽對(duì)氯化鈉不發(fā)生分層現(xiàn)象，其它12種無機(jī)鹽都可發(fā)生分層現(xiàn)象；1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽對(duì)13種無機(jī)鹽都可發(fā)生分層現(xiàn)象，考慮經(jīng)濟(jì)效益，最終決定選用1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽為本次試驗(yàn)合適的離子液體。

2.3 最優(yōu)離子液體濃度

離子液體濃度對(duì)桑葉多糖提取效果的影響見圖2。

圖2 離子液體濃度對(duì)桑葉多糖提取效果的影響Fig.2 Effect of ionic liquid concentration on polysaccharide extraction from mulberry leaves

由圖2可得，離子液體濃度在0～0.000 8 mol/L范圍內(nèi)，吸光度隨濃度的變化大致為先增大后減小，并在0.000 3 mol/L處達(dá)到最大值；由此可以確定最優(yōu)離子液體濃度為0.000 3 mol/L。

2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 提取溫度的影響規(guī)律

提取溫度對(duì)桑葉多糖提取效果的影響見圖3。

圖3 溫度對(duì)桑葉多糖提取效果的影響Fig.3 Effect of temperature on polysaccharide extraction from mulberry leaves

由圖3可以看出不同溫度下吸光度的變化關(guān)系。在60℃～80℃提取溫度范圍內(nèi)，吸光度隨溫度的升高先增大后減小，并在70℃時(shí)達(dá)到最大；之后隨著溫度的上升，吸光度又回升，結(jié)合實(shí)際經(jīng)濟(jì)效益，初步得出最佳溫度為70℃。

2.4.2 提取時(shí)間與吸光度的影響

提取時(shí)間對(duì)桑葉多糖提取效果的影響見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)桑葉多糖提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction time on polysaccharide extraction from mulberry leaves

由圖4可直觀地看出當(dāng)提取時(shí)間為120 min時(shí)，效果最好。

2.4.3 料液比與吸光度的影響

料液比對(duì)桑葉多糖提取效果的影響見圖5。

圖5 料液比對(duì)桑葉多糖提取效果的影響Fig.5 Effect of material liquid ratio on polysaccharide extraction from mulberry leaves

從圖5縱坐標(biāo)中可以看出在料液比為1∶17(g/mL)時(shí)，吸光度值相對(duì)最高，則料液比為1∶17（g/mL）時(shí)是提取多糖的最優(yōu)值。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面設(shè)計(jì)見表2，回歸模型方差分析見表3。0.474 07A-0.300 67B+0.940 88C+0.356 51AC-0.916 94A2-0.580 25B2。R2Adj=0.908 6、R2Pred=0.851 6 和信噪比為15.954值遠(yuǎn)大于4，回歸方程擬合度和可信度均很高，能夠很好地對(duì)吸光度進(jìn)行預(yù)測(cè)，從而獲得最佳多糖濃度提取方法。

表2 響應(yīng)面分析方案與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface analysis scheme and test results

料液比、提取溫度交互作用對(duì)多糖提取效果影響的響應(yīng)面見圖6。

圖6 料液比與提取溫度交互作用對(duì)多糖提取效果影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surface and contour of the interaction of material-liquid ratio and extraction temperature on the extraction effect of polysaccharides

從圖6可以看出，桑葉多糖的提取效果隨著溫度和料液比的提高而加大，這可能是由于溫度和多糖分子內(nèi)能之間的正相關(guān)的關(guān)系，但太高的溫度亦會(huì)使多糖分子結(jié)構(gòu)的破壞，料液比的提高將以更多的溶劑處理和成本高昂為代價(jià)，在一定范圍之上將不可無限制的增加。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)多糖提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，在模型取值范圍內(nèi)選擇起始點(diǎn)作為最低點(diǎn)，將高值選擇一個(gè)極大值，采用模型快速上升法進(jìn)行優(yōu)化，由此得到最佳的提取工藝條件為提取溫度 76.3 ℃，料液比 1∶19.89（g/mL），提取時(shí)間為109.38min。根據(jù)實(shí)際，將參數(shù)調(diào)整為提取溫度76℃、料液比 1∶20（g/mL）、提取時(shí)間 109 min，所得到的吸光度為0.836。進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，兩次吸光度平均值為0.817，多糖提取率為6.77%，實(shí)測(cè)值與理論值無顯著性差異，表明響應(yīng)面分析得到的最佳工藝具有可信度。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過篩選形成雙水相現(xiàn)象較好的離子液體和鹽并用溶劑浸提法對(duì)桑葉中多糖的提取工藝進(jìn)行探究。通過用15種不同的離子液體與13種不同的無機(jī)鹽的結(jié)合篩選，發(fā)現(xiàn)在桑葉多糖的提取體系中離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽有很好的提取效果。而通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)最終確定了離子液體溶劑浸提法提取桑葉多糖的最佳工藝條件為離子液體的濃度0.000 3 mol/L，提取溫度76℃，提取時(shí)間 109 min，料液比 1 ∶20（g/mL）。