劉洪 顏成東 蔣尚飛

甲狀旁腺素相關蛋白(parathyroid hormone related protein, PTHrP)已經被證實分布于人體的多種器官和組織，如牙齒、骨骼、皮膚等[1]。其N末端的氨基酸序列和甲狀旁腺素(parathyroid hormone, PTH)高度同源，并且共享PTH/PTHrP 1型受體(PTH/PTHrP type 1 receptor)，發(fā)揮類似的生理學功能；而其核定位序列和C-末端能夠進入胞核，發(fā)揮調節(jié)細胞周期功能[2]。利用基因工程手段制作僅表達PTHrP蛋白N末端1-84位氨基酸的動物模型PTHrP knock in(PTHrP KI)小鼠[3]，并且和野生型(wild type, WT)小鼠相比，結果發(fā)現(xiàn)PTHrP KI小鼠的下頜磨牙發(fā)育明顯不良，Hertwig上皮根鞘(herswig's epithelial root，HERs)細胞增殖減少，顯示細胞凋亡的指標如p27明顯上調[4]?；钚匝?reactive oxygen species, ROS)由線粒體在進行呼吸作用時產生，是有氧代謝的副產物，包括超氧陰離子自由基(O2-·)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(OH·)和單線態(tài)氧等[5]。研究表明，ROS能直接損傷DNA導致細胞凋亡，而體內多余的ROS能夠被超氧化物歧化酶1(Superoxide dismutase 1，SOD1)、超氧化物歧化酶2(Superoxide dismutase 2，SOD2)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)等酶抗氧化系統(tǒng)所清除[6-8]。本次研究使用2 周齡PTHrP KI小鼠并與同窩的WT小鼠比較下頜切牙的發(fā)育、礦化和凋亡情況，并檢測相關酶抗氧化系統(tǒng)的RNA表達水平。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

將成年雌雄PTHrP KI雜合子小鼠(小鼠購自江蘇省實驗動物中心)合籠，子代小鼠出生后立即剪尾尖提取DNA，使用PCR擴增目標片段并使用BstEⅡ內切酶進行酶切PCR產物，電泳后鑒定基因型[9]，獲得同窩的野生型(wild type, WT)小鼠和PTHrP KI仔鼠，為了控制實驗的均一性，控制每窩WT小鼠和PTHrP小鼠均為2 只。小鼠生長至2 周齡使用頸椎脫臼法處死、取材，WT小鼠和PTHrP KI小鼠分別取20 只進行X線檢查、切片染色和real-time RT-PCR檢測。本次實驗經過江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院倫理委員會審核通過。

1.2 取材

待WT小鼠和PTHrP KI小鼠生長至2周后，頸椎脫臼處死，解剖分離左右兩側下頜骨，左側下頜骨解剖分離下頜切牙后置于液氮中保存進行后續(xù)的real-time RT-PCR檢測，右側下頜骨使用免疫電鏡固定液進行固定后先進行X線掃描，然后使用乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣30 d，待脫鈣完成后沿著下頜第二磨牙的遠中將下頜骨切斷，分別脫水包埋，下頜骨前部沿著下頜第一磨牙的近中根管方向進行切片，片厚5 μm，用來進行HE染色、總膠原染色和免疫組織化學染色；后部沿著近遠中方向進行切片，片厚5 μm，用來進行原位末端轉移酶標記檢測(TUNEL)染色。

1.3 X線掃描

將用免疫電鏡固定液固定后的小鼠下頜骨使用805型X光機(Faxitron公司生產,德國)進行X線掃描，并且分別測量X光片上的小鼠下頜切牙的長度和切緣厚度。

1.4 HE染色

石蠟切片使用先使用二甲苯進行脫蠟，然后從高濃度到低濃度的梯度酒精當中進行水化，使用蘇木素進行染色5 min，流水沖洗至細胞核呈現(xiàn)藍色，使用伊紅染色30 s，再使用從低濃度到高濃度直至無水酒精進行脫水，二甲苯透明3 次，中性樹膠封片。

1.5 總膠原染色

石蠟切片順序使用二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后使用苦味酸-直紅染色液熱色30 min，流水沖洗后蘇木素染色30 s，再次流水沖洗后梯度酒精脫水，二甲苯透明后使用中性樹膠封片。

1.6 I型膠原免疫組化染色

石蠟切片循序二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后使用0.5%牛睪丸透明質酸酶消化30 min后流水沖洗，用5%正常兔血清封閉20 min，分別加入鼠源I型膠原單克隆一抗(1 ∶500，Merk公司, 美國)4 ℃孵育過夜，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗，加兔抗鼠IgG二抗(1 ∶200，Sigma公司, 美國)，室溫孵育30 min；PBS清洗，加使用生物素-親和素-橋聯(lián)堿性磷酸酶酶標液(ABC-AP， Vector公司, 美國)孵育，PBS清洗，堿性磷酸酶染色液染色，甲基綠復染，加熱明膠并過濾后使用過濾后的明膠封片。

1.7 TUNEL染色

石蠟切片循序二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，使用0.01%蛋白酶K孵育5 min，使用PBS清洗，用TUNEL反應混合物(Boehringer Mannheim公司， 英國)在37 ℃下孵育60 min，再次使用PBS清洗，converter-AP(Vector公司， 美國)孵育30 min后繼續(xù)使用PBS清洗，堿性磷酸酶顯色液染色，甲基綠復染，加熱明膠并過濾后使用過濾后的明膠封片。

1.8 實時熒光定量RT-PCR實驗

從液氮中取出小鼠下頜切牙，在研缽中搗碎，一步法提取總 RNA，常規(guī)方法進行逆轉錄，使用real timeRT-PCR方法檢測骨鈣素(osteocalcin, OCN)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px的mRNA表達水平。用7300 System SDS software 軟件(Applied Systems 公司，美國)統(tǒng)計分析實驗結果，PTHrP KI組各個指標以WT組作為參照。

1.9 統(tǒng)計學方法

實驗數據輸入SPSS 10.0統(tǒng)計學軟件進行組間單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 X線掃描結果

X線掃描結果顯示，PTHrP KI組小鼠的下頜切牙長度為(6.34±0.31) mm，切緣厚度為(0.34±0.02) mm，而WT組小鼠下頜切牙長度為(8.83±0.34) mm，切緣長度為(0.47±0.03) mm，PTHrP KI組小鼠下頜切牙長度、切緣厚度均明顯低于WT組小鼠(P<0.05)(圖 1，表 1)。

2.2 HE染色、總膠原染色、I型膠原免疫組化染色和TUNEL染色結果

通過HE染色檢測前期牙本質和牙本質，并且計算前期牙本質占總牙本質的比例，WT小鼠的前期牙本質占總牙本質比例明顯高于PTHrP KI小鼠(P<0.01)；使用總膠原染色方法測定根管厚度， WT小鼠的髓腔壁牙本質厚度明顯高于PTHrP KI小鼠(P<0.01)；I型膠原免疫組化染色表明WT小鼠的I型膠原陽性面積占切牙面積的百分比明顯高于PTHrP KI小鼠(P<0.01)；TUNEL染色結果顯示WT小鼠的切牙末端凋亡細胞比例明顯低于PTHrP KI小鼠(P<0.01)(圖 2、 表 2)。

圖 1 2 組小鼠X線掃描

表 1 小鼠下頜切牙長度和切緣厚度 (n=20,

圖 2 2 種小鼠下頜骨及牙齒染色方法檢測 (A～F:×400, G、 H: ×200)

表 2 HE染色、總膠原染色、I型膠原免疫組化染色和TUNEL染色結果統(tǒng)計

表 3 實時熒光定量RT-PCR實驗結果

2.3 實時熒光定量RT-PCR實驗結果

實時熒光定量RT-PCR實驗結果顯示，WT小鼠的ALP、OCN、SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px的mRNA表達水平均高于PTHrP KI小鼠(P<0.01)(表 3)。

3 討 論

PTHrP最初被發(fā)現(xiàn)在癌癥惡液質患者中，這些患者均伴有明顯的消瘦和高鈣血癥[10]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，PTHrP在血液中的濃度極低，在機體發(fā)育的不同時期、不同組織中均有表達，PTHrP的不同片段具有不同的生理功能， 其N-末端1-84位氨基酸序列與PTH相同，使用共同的受體，也發(fā)揮調節(jié)鈣、磷水平的作用，核定位序列(87-107位氨基酸)能進入細胞核起到胞內分泌的作用， C-末端有抑制骨吸收作用[11]。利用基因工程技術制作僅表達PTHrP蛋白N-末端1-84位氨基酸的小鼠動物模型，發(fā)現(xiàn)小鼠生存期極短，僅為15～18 d，盡管該種動物模型的血清鈣、磷濃度基本正常，但是小鼠的多種器官均發(fā)育不良[12]。

本次實驗利用2 周齡PTHrP KI小鼠進行實驗，并且和同窩的WT小鼠進行對照。X光掃描表明，PTHrP KI小鼠下頜切牙的長度明顯縮短，并且切緣的厚度也明顯減少，X光檢查的實驗初步表明PTHrP核定位序列和C-末端的缺失可能導致了小鼠下頜切牙的發(fā)育障礙；進一步進行HE染色檢查，結果發(fā)現(xiàn)，PTHrP KI小鼠下頜切牙的前期牙本質所占的比例明顯增加。此外，實時熒光定量RT-PCR實驗結果發(fā)現(xiàn)，PTHrP核定位序列和C-末端的缺失導致了小鼠下頜切牙ALP和OCN的mRNA表達水平明顯下調。研究表明，在牙本質的形成過程當中，成牙本質細胞不斷地合成和分泌有機基質，然后礦物不斷地在有機基質當中沉積形成牙本質，而前期牙本質是在成牙本質細胞和牙本質之間的一層沒有礦化的有機基質，ALP礦化過程中能夠發(fā)揮促進鈣離子與磷酸鹽結合形成無機物結晶的作用，在牙本質的鈣化開始后，成牙本質細胞中的ALP表達水平明顯增高；而OCN是一種牙本質非膠原蛋白，主要由成牙本質細胞合成和分泌，在牙本質的礦化過程中起到重要的作用[13]。本研究結果表明，PTHrP核定位序列和C-末端的缺失導致了小鼠下頜切牙前期牙本質比例增加，牙本質礦化不良。

總膠原的染色結果發(fā)現(xiàn)PTHrP KI小鼠下頜切牙髓腔壁的厚度明顯減少，進一步的I型膠原免疫組化染色表明，PTHrP KI小鼠的I型膠原陽性面積也明顯減少。牙本質的胞外基質中主要成分是膠原蛋白，在膠原蛋白中，尤以I型膠原為主；另外還有少量的蛋白多糖和糖蛋白；這些膠原蛋白按照特定的空間構象進行排列，構成了牙本質的主要框架結構，礦物質沉積于其間[14]。上述實驗結果表明，PTHrP核定位序列和C-末端的缺失導致了小鼠下頜切牙的胞外基質分泌減少。

此外，TUNEL染色表明，PTHrP KI小鼠下頜切牙頸環(huán)及附近牙髓細胞凋亡明顯增加。小鼠的下頜切牙終身生長，其原因在于小鼠的下頜切牙末端上皮結構不能像磨牙一樣形成HERs結構而是被稱為頸環(huán)，因而不能形成真正意義上的牙根而終止牙齒的發(fā)育[15]。進一步對SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px等酶抗氧化mRNA的表達水平檢查也發(fā)現(xiàn)，PTHrP KI小鼠下頜切牙的SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px的mRNA的表達水平明顯降低。 線粒體在進行呼吸作用時，可以產生 ROS，過多的ROS如果不能被及時的清除，不僅能夠直接攻擊DNA導致細胞凋亡，也可以通過Fas通路、P53/MPTP 通路、NF- B通路等信號通路引發(fā)細胞凋亡；正常情況下，酶抗氧化系統(tǒng)能夠及時的清除ROS，使得ROS 維持在低水平[16-17]。本研究結果卻發(fā)現(xiàn)，PTHrP核定位序列和C-末端的缺失導致了小鼠下頜切牙的SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px的mRNA的表達水平明顯降低，表明線粒體呼吸作用產生的ROS不能被及時清除，導致相關區(qū)域的氧化應激異常，進而使得細胞凋亡增加，從而導致小鼠下頜切牙變短，發(fā)育異常。

本研究結果表明，PTHrP核定位序列和C-末端的缺失導致幼年小鼠下頜切牙頸環(huán)細胞凋亡增加、牙本質的胞外基質生成和礦化減少，導致了小鼠下頜切牙的發(fā)育異常。