秦超，馮永海，張嬈嬈，卜克，王璐

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 a.重癥醫(yī)學(xué)科；b.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州 410052)

膿毒癥(sepsis)是一種由感染誘導(dǎo)異常宿主反應(yīng)導(dǎo)致的致死性系統(tǒng)疾病，全球每年有上百萬(wàn)膿毒癥患者[1]。膿毒癥往往發(fā)病迅速，并且常并發(fā)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，病死率較高[2]。早期識(shí)別膿毒癥風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后轉(zhuǎn)歸可在一定程度上增強(qiáng)膿毒癥患者管理水平和降低死亡風(fēng)險(xiǎn)，因此積極探尋可能的生物標(biāo)志物十分必要[3-5]。JNK通路磷酸酶[Jun N-terminal kinase (JNK) pathway-associated phosphatase，JKAP]既往被發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)調(diào)控Th1、Th17細(xì)胞分化及炎癥因子的釋放，從而參與多種炎癥性或感染性疾病的發(fā)病和進(jìn)展[6-7]。此外，JKAP還被報(bào)道在膿毒癥患者中異常表達(dá)[8]。然而，在膿毒癥患者中JKAP與Th1及Th17細(xì)胞的關(guān)聯(lián)，以及它們作為膿毒癥患病風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后標(biāo)志物的潛能，尚不清楚。因此，本研究旨在探討膿毒癥患者中外周血JKAP水平與Th1、Th17細(xì)胞的關(guān)聯(lián)，以及它們與膿毒癥發(fā)病和死亡風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象本研究連續(xù)納入于2019年1月至2020年12月在鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院就診的79例膿毒癥患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2016年國(guó)際膿毒癥會(huì)議制定的Sepsis 3.0診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；(2)年齡滿(mǎn)18周歲；(3)于癥狀出現(xiàn)后24 h內(nèi)入重癥醫(yī)學(xué)科治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并惡性血液疾病或腫瘤；(2)3個(gè)月內(nèi)接受過(guò)化療；(3)伴有自身免疫性疾??；(4)長(zhǎng)期使用免疫抑制劑或抗生素；(5)孕婦或哺乳期婦女。入組患者的平均年齡為(54.8±12.4)歲；男49例(62.0%)，女30例(38.0%)；平均體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)為(23.4±3.7) kg·m-2；有吸煙史26例(32.9%)、飲酒史32例(40.5%)、高血壓史33例(41.8%)、高脂血癥史18例(22.8%)、糖尿病史13例(16.5%)、慢性腎病史10例(12.7%)、心腦血管史20例(25.3%)；主要感染部位包括腹部33例(41.8%)、呼吸道15例(19.0%)、皮膚和軟組織14例(17.7%)、血液感染9例(11.4%)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)4例(5.1%)、其他部位4例(5.1%)；血液培養(yǎng)結(jié)果為革蘭陰性菌感染43例(54.4%)、革蘭陽(yáng)性菌感染17例(21.5%)、厭氧菌感染9例(11.4%)、真菌感染3例(3.8%)、支原體感染5例(6.3%)、陰性18例(22.8%)。患者中位血清肌酐(serum creatinine，Scr)水平為1.4 mg·dL-1(四分位區(qū)間：0.9～2.01 mg·dL-1，中位白蛋白(albumin，ALB)水平為27.0 g·L-1(四分位區(qū)間：21.6～38.8 g·L-1)，中位白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell，WBC)水平為16.5×109L-1(四分位區(qū)間：11.2～26.5×109L-1)，中位C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)水平為86.8 mg·L-1(四分位區(qū)間：48.0～131.9 mg·L-1)?；颊呷朐?4 h內(nèi)的急性生理與慢性健康(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHE Ⅱ)評(píng)分中位值為13.0(四分位區(qū)間：8.0～17.0)，序貫器官衰竭評(píng)估(sequential organ failure assessment，SOFA)評(píng)分中位值為5.0(四分位區(qū)間：4.0～8.0)。此外，本研究納入于2020年7月至2020年12月在鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院行體檢的80例健康受試者(年齡和性別與已入組患者匹配)作為對(duì)照組。健康受試者平均年齡為(53.7±11.9)歲；男28例(35.0%)，女52例(65.0%)；平均BMI為(22.9±2.9)kg·m-2；有吸煙史21例(26.3%)、飲酒史35例(43.8%)；中位Scr水平為0.8 mg·dL-1(四分位區(qū)間：0.7～1.0 mg·dL-1)，中位ALB水平為42.6 g·L-1(四分位區(qū)間：39.1～47.4 g·L-1)，中位WBC水平為6.4×109L-1(四分位區(qū)間：5.4～7.5×109L-1)，CRP水平為3.6 mg·L-1(四分位區(qū)間：2.4～6.4 mg·L-1)。本研究已獲得醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有患者已提供書(shū)面知情同意。

1.2 血液樣本收集和處理所有膿毒癥患者入院后，使用真空采血管采集外周血液樣本。健康受試者的外周血液樣本于體檢時(shí)采集。所有血液樣本在采集后，立即通過(guò)離心分離獲得血清樣本，通過(guò)梯度密度離心分離方法并使用Ficoll?PM 400(Sigma，USA)試劑分離外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。分離后的血清樣本以及PBMC樣本均保存在超低溫冰箱中待后續(xù)檢測(cè)使用。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)在血清分離后的24 h內(nèi)，采用人JKAP ELISA 試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，中國(guó))檢測(cè)血清樣本中JKAP的水平；分別采用人腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA試劑盒(invitrogen，USA)、人白介素β(interleukin beta，IL-β)ELISA試劑盒(invitrogen，USA)以及人白介素17(interleukin 17，IL-17)ELISA試劑盒(Invitrogen，USA)檢測(cè)血清中TNF-α、IL-β以及IL-17的水平，所有ELISA實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程均嚴(yán)格按照試劑盒廠家說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)分析在PBMC分離后的24 h內(nèi)，采用Human Th1/Th17 Phenotyping Kit (BD PharmingenTM，USA)中的特異性熒光抗體標(biāo)記CD4陽(yáng)性T細(xì)胞以及Th1、Th17細(xì)胞，然后使用流式細(xì)胞儀對(duì)被標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行流式計(jì)數(shù)，最終計(jì)算出Th1和Th17細(xì)胞在CD4陽(yáng)性T細(xì)胞中的比率。具體操作步驟均嚴(yán)格按照試劑盒廠家說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.5 28 d死亡率評(píng)估對(duì)所有膿毒癥患者密切觀察隨訪至死亡或直至28 d，記錄28 d內(nèi)的死亡情況，并評(píng)估28 d死亡率。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析變量分布特征采用均值、標(biāo)準(zhǔn)差、中位值、四分位值以及例次百分比進(jìn)行描述。連續(xù)變量?jī)山M之間的比較分析采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。連續(xù)變量間的關(guān)聯(lián)采用Spearman秩相關(guān)分析。變量對(duì)于不同受試者的區(qū)分作用采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線以及曲線下面積(area under the curve，AUC)來(lái)評(píng)估。使用SPSS 24.0(IBM，USA)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用GraphPad Prism 7.01軟件(GraphPad Inc.，USA)進(jìn)行繪圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 JKAP、Th1、Th17在膿毒癥患者中的異常水平與對(duì)照組相比較，膿毒癥患者JKAP水平降低[26.5(14.8～43.8)ng·L-1比98.6(53.5～145.5)ng·L-1，P<0.001](圖1 A)，Th1[13.6%(11.9%～18.6%)比9.2%(7.9%～11.0%)，P<0.001]和Th17[3.3%(2.0%～4.9%)比1.8%(1.5%～2.0%)，P<0.001]細(xì)胞比率升高(圖1 B～C)。進(jìn)一步ROC曲線分析表明，JKAP(AUC：0.904，95% CI：0.860～0.949)、Th1細(xì)胞(AUC：0.897，95% CI：0.849～0.944)、Th17細(xì)胞(AUC：0.804，95% CI：0.728～0.879)水平均可以較好地區(qū)分膿毒癥患者和對(duì)照組患者(圖1 D～F)。

圖1 JKAP、Th1和Th17在健康受試者與膿毒癥患者中的差異以及ROC曲線分析

2.2 膿毒癥患者中JKAP與Th1、Th17的關(guān)聯(lián)性膿毒癥患者中，JKAP水平與Th1細(xì)胞比率(P<0.001)和Th17細(xì)胞比率(P<0.001)均呈負(fù)相關(guān)(表1)。JKAP水平與炎癥因子TNF-α(P=0.008)、IL-1β(P=0.006)和IL-17(P=0.010)呈負(fù)相關(guān)(表1)。

表1 JKAP與Th1、Th17、TNF-α、IL-1β和IL-17的關(guān)聯(lián)性

2.3 膿毒癥患者中JKAP與常見(jiàn)生化指標(biāo)及疾病綜合評(píng)分的關(guān)聯(lián)性膿毒癥患者中，JKAP水平與Scr(P<0.001)、WBC(P<0.001)及CRP(P<0.001)水平呈負(fù)相關(guān)，與ALB呈正相關(guān)(P<0.001)(表2)。JKAP水平與疾病綜合評(píng)分APACHE Ⅱ(P<0.001)和SOFA(P<0.001)呈負(fù)相關(guān)(表2)。

2.4 膿毒癥患者中JKAP、Th1、Th17與死亡風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性JKAP水平在膿毒癥死亡患者中低于生存患者[20.1(8.2～24.2)ng·L-1比32.8(18.2～49.3)ng·L-1，P<0.001](圖2 A)，Th1[18.2%(14.9%～23.1%)比13.1%(11.6%～17.2%)，P=0.001]和Th17[5.8%(3.2%～9.5%)比2.9%(1.8%～4.0%)，P=0.001]細(xì)胞水平在膿毒癥死亡患者中高于生存患者(圖2 B～C)。此外，進(jìn)一步ROC曲線分析表明，JKAP(AUC：0.799，95% CI：0.697～0.901)、Th1細(xì)胞(AUC：0.759，95% CI：0.636～0.882)、Th17細(xì)胞(AUC：0.763，95% CI：0.632～0.894)水平均可以預(yù)測(cè)膿毒癥患者死亡風(fēng)險(xiǎn)(圖2 D～F)。

表2 JKAP與生化指標(biāo)和疾病嚴(yán)重程度的關(guān)聯(lián)性

圖2 JKAP、Th1和Th17在膿毒癥生存患者與死亡患者中的比較以及ROC曲線分析

3 討論

本研究通過(guò)檢測(cè)膿毒癥患者外周血中JKAP、Th1和Th17細(xì)胞水平，發(fā)現(xiàn)他們不僅在膿毒癥患者中異常表達(dá)，并且有作為膿毒癥患者死亡風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物的潛能。此外，膿毒癥患者中JKAP水平與Th1和Th17細(xì)胞水平高度相關(guān)，并且還與患者系統(tǒng)性炎癥水平和疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，進(jìn)一步表明JKAP作為膿毒癥生物標(biāo)志物的潛能及可能機(jī)制。

JKAP在調(diào)控多種免疫和炎癥性反應(yīng)中均有著重要作用。一項(xiàng)既往研究報(bào)道，JKAP可以通過(guò)調(diào)控CD4+T細(xì)胞分化及炎癥因子參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病和進(jìn)展[7]。另外一項(xiàng)研究報(bào)道，JKAP可以通過(guò)激活CD4+T細(xì)胞并促進(jìn)其向Th1和Th17分化，并同時(shí)調(diào)控炎癥因子，從而參與炎癥性腸病的疾病進(jìn)展[6]。此外，JKAP還被報(bào)道與克羅恩病低的患病風(fēng)險(xiǎn)、炎癥水平和疾病活動(dòng)度相關(guān)[10]，并且其與哮喘患兒低的炎癥水平和急性發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)亦相關(guān)[11]；再者，JKAP還被發(fā)現(xiàn)有作為類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎患病風(fēng)險(xiǎn)、炎癥和疾病活動(dòng)度標(biāo)志物潛能[12-13]。至于JKAP在感染性疾病中的應(yīng)用，僅有一篇研究報(bào)告JKAP在膿毒癥患者中異常表達(dá)[8]。以上研究均表明，JKAP有作為炎癥性/感染性疾病生物標(biāo)志物的潛能。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了JKAP在膿毒癥患者中低表達(dá)，并且可以較好地對(duì)膿毒癥患病風(fēng)險(xiǎn)起到預(yù)測(cè)作用，這與既往報(bào)道結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)JKAP水平與膿毒癥患者炎癥水平和疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。可能的解釋原因有：(1)JKAP通過(guò)調(diào)控Lck通路和MAPK通路從而阻斷T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)多個(gè)下游炎癥因子，從而抑制膿毒癥患者炎癥水平并制止疾病的惡化[14-15]；(2)JKAP抑制CD4+T細(xì)胞的激活，并阻礙Th1和Th17細(xì)胞分化及對(duì)應(yīng)炎癥因子的釋放，從而降低膿毒癥患者炎癥水平和疾病嚴(yán)重程度[6-7]；(3)JKAP與膿毒癥患者少/輕的器官損傷相關(guān)(與肝腎功能指標(biāo)等關(guān)聯(lián)體現(xiàn))，從而間接影響膿毒癥患者疾病的嚴(yán)重程度。

關(guān)于Th1和Th17細(xì)胞在膿毒癥中的調(diào)控作用，已經(jīng)有較多研究報(bào)道。例如，研究發(fā)現(xiàn)Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞在感染性疾病尤其是膿毒癥患者中呈現(xiàn)高水平[16-17]。本研究也發(fā)現(xiàn)Th1和Th17在膿毒癥患者中表現(xiàn)出高水平，這與既往研究一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者中JKAP水平不僅與Th1細(xì)胞水平相關(guān)，還與Th17細(xì)胞水平相關(guān)，暗示膿毒癥患者中JKAP也參與了Th1和Th17的調(diào)控。可能解釋原因?yàn)镴KAP可能通過(guò)調(diào)節(jié)Lck通路和MAPK通路，抑制T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，弱化CD4+T細(xì)胞激活及Th1、Th17細(xì)胞分化[6-7,14-15]。

關(guān)于JKAP、Th1和Th17水平在膿毒癥中的預(yù)后作用，目前少有研究報(bào)道。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，JKAP在膿毒癥死亡患者中低表達(dá)，而Th1和Th17細(xì)胞在膿毒癥死亡患者中呈現(xiàn)高水平，并且三者均可以在一定程度上預(yù)測(cè)膿毒癥患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)，這進(jìn)一步表明JKAP作為膿毒癥預(yù)后生物標(biāo)志物的潛能及可能機(jī)制?？赡茉蛴校?1)JKAP通過(guò)抑制Th1和Th17分化，降低膿毒癥患者系統(tǒng)性炎癥及疾病嚴(yán)重程度，從而降低膿毒癥患者死亡風(fēng)險(xiǎn)[6-7,14-15]；(2)JKAP還可以通過(guò)降低膿毒癥多器官損傷(與肝腎功能指標(biāo)等關(guān)聯(lián)體現(xiàn))，從而降低其死亡風(fēng)險(xiǎn)。

本研究存在一些不足：(1)本研究樣本量較低，可能導(dǎo)致低的統(tǒng)計(jì)效能，因此將來(lái)需進(jìn)一步執(zhí)行大樣本研究以驗(yàn)證本研究結(jié)果；(2)本研究患者主要來(lái)自單個(gè)地區(qū)，因此可能存在患者選擇偏倚，因此將來(lái)進(jìn)一步跨地域多中心研究是必要的；(3)本研究評(píng)估了患者的28 d死亡率，而JKAP、Th1和Th17在膿毒癥患者長(zhǎng)期預(yù)后中的作用，需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，JKAP與Th1、Th17細(xì)胞高度相關(guān)，并且有作為膿毒癥患病風(fēng)險(xiǎn)、疾病嚴(yán)重程度監(jiān)控及短期預(yù)后生物標(biāo)志物的潛能。