岳 麗，王 卉，再吐尼古麗·庫(kù)爾班，茆 軍，涂振東，山其米克

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物質(zhì)能源研究所，新疆 烏魯木齊 830091)

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，各類農(nóng)作物秸稈資源十分豐富，秸稈中含有豐富的粗纖維、氮、磷、鉀、鈣、鎂等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可作為反芻動(dòng)物的粗飼料來(lái)源[1]；但秸稈的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜，直接作為飼料，適口性差、利用率低，在瘤胃中的降解率也較低[2-3]。目前已篩選出可降解纖維素和木質(zhì)素的菌群和酶[4]，單獨(dú)加入酶或菌時(shí)降解效果不理想。為了能高效的利用秸稈，必須消除木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)對(duì)酶解過(guò)程的阻礙,故將微生物發(fā)酵和酶解技術(shù)相結(jié)合[5-6]。劉輝[7]以玉米秸稈為原料，對(duì)酶菌協(xié)同發(fā)酵與單獨(dú)纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)生物蛋白質(zhì)飼料的工藝進(jìn)行了比較，結(jié)果表明酶菌協(xié)同發(fā)酵生產(chǎn)的粗蛋白質(zhì)含量?jī)?yōu)于單獨(dú)纖維素酶發(fā)酵。吳立坡[8]等利用菌酶復(fù)合制劑發(fā)酵玉米秸稈，發(fā)酵后干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)含量顯著高于未發(fā)酵秸稈。王田田[9]研究了菌酶協(xié)同發(fā)酵對(duì)辣木莖葉粉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及抗氧化活性的影響，結(jié)果表明菌酶協(xié)同發(fā)酵更有利于辣木營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的提升以及抗氧化活性成分的提高。

甜高粱作為飼用及糖料作物營(yíng)養(yǎng)豐富、生物產(chǎn)量高、用途廣泛、對(duì)生長(zhǎng)的環(huán)境條件要求不嚴(yán)格，是降低畜牧養(yǎng)殖成本的最佳飼料[10-11]。目前已有關(guān)于高粱秸稈經(jīng)酶菌制劑單獨(dú)處理的研究報(bào)道，但是對(duì)酶菌制劑復(fù)合處理高粱秸稈的報(bào)道甚少。為了提高秸稈飼料的利用效率，有效發(fā)揮反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)潛能，有必要對(duì)復(fù)合生物制劑(酶菌)處理后的高粱秸稈飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行評(píng)定[12]。本研究擬利用酶菌共同發(fā)酵甜高粱秸稈，研究不同發(fā)酵因素對(duì)發(fā)酵后飼料中粗蛋白質(zhì)含量的影響，優(yōu)化酶菌協(xié)同發(fā)酵的條件，以期為高效利用甜高粱秸稈提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料

甜高粱品種：新高粱3號(hào)，新高粱9號(hào)種植于新疆昌吉；甜高粱秸稈原料：甜高粱整株粉碎后加入酵母固態(tài)發(fā)酵，蒸餾乙醇后所得的殘?jiān)?，晾干后粉碎得到粉末?/p>

1.2 菌株

產(chǎn)朊假絲酵母(R)購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；黑曲霉(H)為所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要試劑

檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑均為分析純；木聚糖酶、纖維素酶為試劑級(jí)，酵母培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.4 主要儀器與設(shè)備

SL3001電子天平，上海民僑精密科學(xué)儀器有限公司；ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器；上海申安LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器。

1.5 試驗(yàn)與方法

1.5.1指標(biāo)測(cè)定方法

粗蛋白質(zhì)的測(cè)定參照GB/T 6432—2018;粗纖維的測(cè)定參照GB/T 6434—2006。

1.5.2固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

1.5.2.1培養(yǎng)基配制

酵母培養(yǎng)基：稱取酵母膏1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖2 g，瓊脂1.5 g，補(bǔ)充蒸餾水至錐形瓶100 ml處，121℃滅菌20 min。

馬鈴薯培養(yǎng)基：按照培養(yǎng)基說(shuō)明書稱取，加水，滅菌。

1.5.2.2菌種活化

將產(chǎn)朊假絲酵母劃線轉(zhuǎn)接到酵母培養(yǎng)基上，30℃活化培養(yǎng)24 h；黑曲霉劃線轉(zhuǎn)接到馬鈴薯培養(yǎng)基斜面上，28℃活化培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化三代。

1.5.2.3最佳發(fā)酵劑確定

稱取100 g秸稈粉末裝入三角瓶中,按照料液比1∶4加入pH 4.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液400 ml,121℃滅菌20 min，然后冷卻。將酶用雙蒸水溶解，然后使用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，按照表1加入酶，酶解24 h，然后按照100 g發(fā)酵培養(yǎng)基接入10 ml菌種(濃度1×108CFU/ml-1)，于31℃培養(yǎng)6 d，發(fā)酵結(jié)束后65℃烘干、粉碎后供分析測(cè)定用。

1.5.3酶菌協(xié)同發(fā)酵甜高粱秸稈的單因素試驗(yàn)

1.5.3.1發(fā)酵時(shí)間

在發(fā)酵溫度30℃、料液比1∶4、pH 4.0、酶菌比例1∶2條件下，研究不同發(fā)酵時(shí)間(2、3、4、5、6 d)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量的影響。

1.5.3.2酶菌比例

在發(fā)酵時(shí)間5 d、溫度30℃、pH 4.0、料液比為1∶4條件下，研究不同酶菌復(fù)配比例(3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量的影響。

1.5.3.3pH值

在發(fā)酵時(shí)間5 d、溫度30℃、酶菌比1∶2條件下，研究不同pH值(3.5、4.5、5.5、6.5、7.5)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量的影響。

1.5.3.4發(fā)酵溫度

在發(fā)酵時(shí)間5 d、料液比1∶4、pH 5.5、酶菌比例1∶2條件下，研究不同溫度(25、30、35、40、45℃)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量的影響。

1.5.4酶菌協(xié)同發(fā)酵的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以粗蛋白質(zhì)含量為指標(biāo)，考察發(fā)酵時(shí)間、酶菌比例、料液比和發(fā)酵溫度4個(gè)因素，每個(gè)因素選3個(gè)水平，采用L9(34)正交試驗(yàn)，因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與討論

2.1 秸稈發(fā)酵最佳發(fā)酵酶的確定

以甜高粱秸稈粉末為原料，設(shè)置對(duì)照組和3個(gè)處理組(纖維素酶、木聚糖酶、纖維素酶+木聚糖酶)于31℃培養(yǎng)箱中酶解24 h，然后加入黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母菌的復(fù)合菌，發(fā)酵6 d，最后測(cè)定發(fā)酵樣品中的粗蛋白質(zhì)含量見(jiàn)圖1。

圖1 酶種類對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響

由圖1可知，纖維素酶組、木聚糖酶組以及纖維素酶+木聚糖酶組蛋白質(zhì)含量均高于對(duì)照組，其中利用纖維素酶+木聚糖酶處理后蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到12.51%，比對(duì)照組提高了8.4%，因此選取纖維素酶+木聚糖酶的復(fù)合酶為協(xié)同發(fā)酵高粱秸稈酶組合。

2.2 高粱秸稈發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1發(fā)酵時(shí)間

發(fā)酵時(shí)間是影響發(fā)酵后秸稈中蛋白質(zhì)含量的重要因素之一。一般情況下，發(fā)酵時(shí)間過(guò)短會(huì)使微生物的活菌數(shù)和有益代謝產(chǎn)物積累不足；而當(dāng)發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，則會(huì)增加發(fā)酵成本，并且容易感染其他雜菌[13]。圖2為不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響

由圖2可知，發(fā)酵時(shí)間為2 d時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量最低，為12.29%，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，粗蛋白質(zhì)含量逐漸升高，5 d以后呈降低趨勢(shì)。發(fā)酵時(shí)間5 d時(shí)，粗蛋白質(zhì)含量最高，為13.26%。因此，確定最佳發(fā)酵時(shí)間為5 d。

2.2.2酶菌比例

由于菌體本身就是一種蛋白質(zhì)，所以發(fā)酵過(guò)程中菌種接種量的大小對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響較大。當(dāng)接種量過(guò)小時(shí)，菌體適應(yīng)期相對(duì)較長(zhǎng)，積累至一定量所需時(shí)間延長(zhǎng)，并且會(huì)增加感染其他菌的概率；而當(dāng)接種量過(guò)大時(shí)，溶氧供應(yīng)不足，使發(fā)酵產(chǎn)物溫度迅速升高，同時(shí)還消耗大量的營(yíng)養(yǎng)對(duì)微生物后期生長(zhǎng)造成不利。圖3為酶菌比例對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量的影響結(jié)果。

圖3 酶菌比例對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響

由圖3可知，當(dāng)酶菌的復(fù)配比例為3∶1時(shí)，粗蛋白質(zhì)含量最低，為12.3%。當(dāng)酶菌復(fù)配比例為1∶2時(shí)，發(fā)酵飼料中的粗蛋白質(zhì)含量最高，為14.21%。因此，最佳酶菌復(fù)配比例為1∶2。

2.2.3pH值

酶只有在最適宜的pH值條件下才能發(fā)揮最大活性，過(guò)高或過(guò)低的pH值都會(huì)使酶的活性降低，影響微生物細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)過(guò)程[14]。pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 pH值對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響

由圖4可知，當(dāng)pH值小于5.5時(shí)，隨著pH值的增加發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)的pH值為5.5時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高，為14.57%，繼續(xù)提高基質(zhì)的pH值，粗蛋白質(zhì)含量反而降低。這可能是由于pH值的大小改變底物分子和酶分子的帶電狀態(tài)，從而影響酶與底物的結(jié)合[14]。因此選擇pH 5.5作為復(fù)合酶的最適發(fā)酵pH值。

2.2.4發(fā)酵溫度

發(fā)酵溫度不僅影響微生物的生長(zhǎng)代謝，還會(huì)對(duì)微生物分泌的酶活性產(chǎn)生影響。發(fā)酵溫度過(guò)高會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)變性，也會(huì)影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性和酶的活性；若溫度太低則會(huì)使菌體生長(zhǎng)緩慢，酶的活性減弱[15-16]。圖5反映了不同發(fā)酵溫度下產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量的變化情況。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響

由圖5可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)溫度為35℃時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)品中粗蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高，為13.3%，這可能是由于此溫度有利于高粱秸稈中碳水化合物轉(zhuǎn)化為糖然后被黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母作為碳源利用，促進(jìn)菌體蛋白的增加。因此，最適宜的發(fā)酵溫度為35℃。

2.3 高粱秸稈發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，綜合研究發(fā)酵時(shí)間(A)、酶菌比例(B)、pH值(C)和發(fā)酵溫度(D)4個(gè)因素對(duì)甜高粱秸稈粗蛋白質(zhì)含量的影響，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表3。

由表3分析結(jié)果可知，各因素對(duì)高粱秸稈發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量的影響順序由大到小為C>D>A>B，即pH值>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間>酶菌比例，最佳組合方式為A2B3C1D3，即發(fā)酵時(shí)間5 d，酶菌混合比例為1∶3，pH 4.5，發(fā)酵溫度40℃。由表4方差分析的結(jié)果可知，pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵飼料中粗蛋白質(zhì)含量影響達(dá)顯著水平，而酶菌比例的影響不顯著。按優(yōu)化后工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)3次平行試驗(yàn)，得到甜高粱秸稈發(fā)酵后蛋白質(zhì)平均含量為15.51%。

3 討論

采用菌酶協(xié)同發(fā)酵法處理飼料，可以提高發(fā)酵過(guò)程中微生物對(duì)飼料中大分子物質(zhì)的利用效率，如纖維素酶分解秸稈中的纖維素和半纖維素生成單糖能為酵母菌合成菌體蛋白提供能量，同時(shí)也可以克服單獨(dú)利用微生物發(fā)酵產(chǎn)酶不足的問(wèn)題，進(jìn)而提高飼料品質(zhì)[17-18]。張倩茹[19]研究了固態(tài)發(fā)酵玉米芯制備木聚糖的最佳菌酶組合條件，枯草芽孢桿菌與酵母菌比例為1∶9，發(fā)酵時(shí)添加纖維素酶量為1 000 U/g飼料。在此條件下，木聚糖含量可達(dá)1.421 mg/g，與對(duì)照組相比提高了257%。李新社等[20]利用纖維素酶和康寧木霉菌共同處理玉米秸稈將其轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖，并從玉米秸稈降解物中獲得了4.852 g/L的還原糖。何香凝[21]研究發(fā)現(xiàn)菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米芯提取木聚糖的產(chǎn)量最高，達(dá)11.48%。發(fā)酵后玉米芯結(jié)構(gòu)疏松、孔洞較大。從形態(tài)結(jié)構(gòu)上說(shuō)明了菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米芯能夠更好地破壞纖維素、半纖維素和木質(zhì)素,使木聚糖得以更好地釋放。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)酶菌協(xié)同發(fā)酵后的甜高梁秸稈的粗蛋白質(zhì)含量高于單獨(dú)混菌發(fā)酵。酶菌協(xié)同發(fā)酵的最佳工藝條件為：發(fā)酵時(shí)間5 d，混酶和混菌混合比例1∶3，pH4.5，培養(yǎng)溫度40℃。在此條件下，發(fā)酵產(chǎn)品的粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.51%。