萬曉宇，劉 振*，毛相朝,2

1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266000；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，青島 266000

羽扇豆醇(lup-20(29)-ene-3β-ol)是一類來源于藥用植物的五環(huán)三萜類化合物，是羽扇豆烷型三萜的基本前體，羽扇豆醇及其衍生物如樺木酸等具有抗炎、抗癌、抗腫瘤、降血糖等生理活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[1-3]。已有報道表明，羽扇豆醇有顯著抑制腫瘤的生長并致使前列腺癌細胞死亡的能力，是一種潛在的治療前列腺癌的藥物成分[4]。另外，羽扇豆醇在害蟲防治領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，該化合物可以改變乙酰膽堿酯酶(AChE)、Na+-ATP酶、過氧化氫酶的平衡，破壞螨蟲的角質(zhì)層、肌絲、核膜、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，最終使螨蟲死亡。因此，羽扇豆醇具有一定的殺螨能力，可以作為一種植物性害蟲防治劑[5]。

目前羽扇豆醇的獲得主要通過植物萃取法、化學(xué)法和生物合成法三種途徑[6]。羽扇豆醇主要存在于水果蔬菜中，但含量極低，例如，在橄欖果中含量約為3 μg/g，芒果皮含量約為0.67 μg/g，日本梨含量約為175 μg/g，芒果含量約為180 μg/g，蘆薈干葉含量約為280 μg/g，榆樹皮含量約為880 μg/g[7]。較低的天然含量和復(fù)雜的萃取條件使得植物萃取法得到的羽扇豆醇產(chǎn)量較低，例如以海葡萄為原料可提取得到5.6067 mg/g的羽扇豆醇，難以滿足羽扇豆醇工業(yè)應(yīng)用的需求[8]。而化學(xué)合成法普遍使用樺木醇為前體，經(jīng)過復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)得到羽扇豆醇，目前已知的最高轉(zhuǎn)化率為50%[9]?；瘜W(xué)法也因大量的有機溶劑和底物消耗、不可避免的污染和副產(chǎn)物的生成而限制了羽扇豆醇產(chǎn)量的提高[6]。合成生物學(xué)作為一門新興學(xué)科，為萜類的合成提供了新的思路，目前已有許多三萜通過生物合成法達到1 g/L以上的產(chǎn)量[10]。同樣，也有研究表明利用釀酒酵母作宿主可合成200.1 mg/L的羽扇豆醇[11]。

羽扇豆醇的生物合成主要存在兩種合成途徑，甲羥戊酸(MVA)途徑和甲基赤蘚糖-4-磷酸(MEP)途徑[12]。其中，MVA途徑主要存在于真核生物、古細菌和高等植物的細胞液中，MEP途徑主要存在于植物、細菌和藻類等[13,14]。在真核生物中，乙酰輔酶A分子在HMG-CoA合成酶催化下偶聯(lián)生成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A (HMG-CoA)[15]。MVA經(jīng)由HMG-CoA還原酶(HMGR)催化生成,之后轉(zhuǎn)化為異戊烯基焦磷酸鹽(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸鹽(DMAPP)，這個過程被稱為MVA通路[16]。IPP和DMAPP這兩個重要的中間體通過頭尾縮合轉(zhuǎn)化為法尼酰基焦磷酸(FPP)[15]。FPP經(jīng)角鯊烯合成酶(SQS)生成角鯊烯，再經(jīng)角鯊烯環(huán)氧化酶(SQE)氧化生成2,3-氧化角鯊烯。最后，氧化角鯊烯環(huán)化生成2,3-氧化角鯊烯作為陽離子中間體，陽離子中間體經(jīng)羽扇豆醇合酶(LUS)環(huán)化形成羽扇豆醇[17]。圖1所示為酵母中羽扇豆醇的合成途徑。

圖1 酵母中羽扇豆醇的合成途徑

本研究通過分別利用木欖和蓖麻來源的LUS在解脂耶氏酵母中構(gòu)建羽扇豆醇的合成途徑，對比這兩種不同來源的LUS的表達效果。另外，進一步過表達了解脂耶氏酵母來源的tHMGR和IDI兩個關(guān)鍵限速酶調(diào)控MVA途徑，實現(xiàn)了羽扇豆醇在該宿主中的合成。最后，為了強化2,3-環(huán)氧角鯊烯的合成以促進羽扇豆醇的合成，過表達了解脂耶氏酵母中的SQS和SQE,使得羽扇豆醇達到本研究中的最高產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

1.1.1菌株及質(zhì)粒

本研究所用質(zhì)粒、菌株及引物信息見表1和表2。

表1 本研究所用質(zhì)粒及菌株

1.1.2生化試劑及藥品

P505-d1聚合酶PhantaTMMax Super-Fidelity DNA polymerase和Taq聚合酶混合體系2×Taq Master Mix購于諾唯贊生物公司(Vazyme)?？焖儋|(zhì)粒小提試劑盒TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit購于TIANGEN公司。PCR回收試劑盒Gel Extraction Kit(200)購于OMEGA公司。其他試劑及藥品未作特殊說明均為國產(chǎn)分析純。PCR引物合成及測序由青島擎科公司提供。

表2 本研究所用引物

1.1.3試劑及培養(yǎng)基配方

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10， NaCl 10，酵母提取物5，121 ℃滅菌20 min后備用。

YPD培養(yǎng)基(%)：蛋白胨2，酵母提取物2，葡萄糖2，115 ℃滅菌30 min后備用。

SM[Ura]篩選培養(yǎng)基： 0.8% 酵母選擇培養(yǎng)基(一缺，Ura)，2%葡萄糖，115 ℃滅菌30 min后備用。

SM[Leu]篩選培養(yǎng)基： 0.8% 酵母選擇培養(yǎng)基(一缺，Leu)，2%葡萄糖，115 ℃滅菌30 min后備用。

SM[Ura-Leu]篩選培養(yǎng)基：0.8%酵母選擇培養(yǎng)基(二缺，Ura-Leu)，2%葡萄糖，115 ℃滅菌30 min后備用。

上述液體培養(yǎng)基加2%的瓊脂可配成相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1解脂耶氏酵母中羽扇豆醇合成途徑的構(gòu)建

首先構(gòu)建含目的片段BgLUS、RcLUS的質(zhì)粒PMT1、PMT2，利用P505-d1高保真聚合酶擴增和PCR回收得到用于酵母轉(zhuǎn)化的線性片段。用YPD培養(yǎng)基活化基礎(chǔ)菌株po1g后分別將目的片段用醋酸鋰法轉(zhuǎn)入感受態(tài)中，并用SM-Ura固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子用引物進行PCR驗證和測序驗證后，得到GLU-1、GLU-2工程菌。

1.2.2MVA調(diào)控菌株的構(gòu)建

構(gòu)建MVA調(diào)控工程菌株所用的方法與1.2.1相同，首先從解脂耶氏酵母po1g全基因組中擴增IDI和tHMGR片段，將目的片段利用P505-d1高保真聚合酶擴增和PCR回收，之后轉(zhuǎn)入用SM-Ura培養(yǎng)基活化后的GLU-1、GLU-2菌株的感受態(tài)中，用含HYG抗性的SM-Ura固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子用引物進行PCR驗證和測序驗證后，得到GLU-1M、GLU-2M工程菌。

1.2.3強化2,3-環(huán)氧角鯊烯合成菌株的構(gòu)建

方法與1.2.1相同。將來源于解脂耶氏酵母po1g全基因組的SQS和SQE片段利用P505-d1高保真聚合酶擴增和PCR回收后，轉(zhuǎn)入用含HYG抗性的SM-Ura培養(yǎng)基活化后的GLU-1、GLU-2菌株的感受態(tài)中，用含HYG抗性的SM-Ura-Leu固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子用引物進行PCR驗證和測序驗證后，得到GLU-1MS、GLU-2MS、GLU-1MSS工程菌。

1.2.4搖瓶培養(yǎng)

挑取固體培養(yǎng)基上的單克隆于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)2 d作為種子液。將種子液以2%的接種量接種于含15 mL YPD培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中培養(yǎng)，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)5 d。

1.2.5產(chǎn)物提取及檢測

1.2.5.1 產(chǎn)物提取

取1 mL發(fā)酵液于EP管中，1.0×103r/min離心5 min，去除培養(yǎng)基，1 mL無菌水清洗后，加入1 mL HCl(3 mol/L)于95 ℃水浴15 min，之后轉(zhuǎn)移至冰浴10 min，1.0×103r/min離心5 min，去除上清，之后加入雙蒸水洗滌，1.0×103r/min離心5 min去除上清。加入0.5 mL丙酮于55 ℃水浴15 min。1.0×103r/min離心5 min，取上清并過0.22 μm有機尼龍濾膜后備用。

1.2.5.2 產(chǎn)物檢測

羽扇豆醇和角鯊烯的定性及定量分析使用液相色譜法檢測。色譜條件：色譜柱：毛細管柱C18；柱溫：35 ℃；流動相：甲醇；總流速：1 mL/min；檢測波長：201 nm；等度洗脫；進樣體積：20 μL。角鯊烯和羽扇豆醇標準品用于定性和定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 利用兩種不同來源LUS在解脂耶氏酵母中構(gòu)建羽扇豆醇合成途徑

解脂耶氏酵母是一種產(chǎn)油酵母，其自身可以合成大量乙酰輔酶A供萜類合成，另外該宿主體內(nèi)的油脂也有利于萜類的儲存，因此解脂耶氏酵母可視為一種利于萜類合成的優(yōu)秀宿主。解脂耶氏酵母具有內(nèi)源的2,3-環(huán)氧角鯊烯的合成通路，引入羽扇豆醇合酶即可催化2,3-環(huán)氧角鯊烯環(huán)化形成羽扇豆醇。本研究選取木欖和蓖麻來源的兩種LUS(BgLUS和RcLUS)分別整合到解脂耶氏酵母po1g菌株中。首先將華大基因合成和密碼子優(yōu)化后的BgLUS和RcLUS進行PCR克隆，分別與強啟動子TEF和終止子連接后，利用同源重組整合到po1g基因組上(URA為篩選標記)。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過缺陷培養(yǎng)基篩選后，利用引物驗證和測序驗證，獲得正確的工程菌。

a:GLU-1和GLU-2工程菌株示意圖；b:泳道 1-5為GLU-1陽性克隆驗證，6-10為GLU-2陽性克隆驗證。圖2 GLU-1和GLU-2工程菌株示意圖及瓊脂糖電泳圖

陽性克隆鑒定結(jié)果顯示(圖2b)，工程菌株插入大小與BgLUS(2 298 bp)和RcLUS(2 310 bp)基因大小一致的片段。測序結(jié)果顯示序列并未發(fā)生突變，菌株構(gòu)建成功。但這兩個工程菌株均檢測不到羽扇豆醇，可能的原因有解脂耶氏酵母自身的MVA途徑較弱，無法合成足夠的FPP和角鯊烯供羽扇豆醇的合成。因此，優(yōu)化MVA途徑成為促進解脂耶氏酵母中羽扇豆醇的合成的重要手段。

2.2 調(diào)控MVA途徑對羽扇豆醇和角鯊烯合成的影響

MVA途徑是萜類合成的第一道關(guān)鍵步驟，許多研究表明經(jīng)過MVA優(yōu)化后的萜類合成菌株產(chǎn)量可上調(diào)。其中HMGR是合成MVA的關(guān)鍵酶，此步驟不可逆轉(zhuǎn)，有研究表明，去掉N端氨基酸的HMGR(tHMGR)具有更高的合成MVA能力。而IDI作為MVA途徑中的一步可逆反應(yīng)的酶，催化IPP與DMAPP的相互轉(zhuǎn)化，也同樣對FPP的積累產(chǎn)生重要的影響[18]。這兩種酶同時調(diào)控著IPP和DMAPP在整個途徑中平衡配比,也是代謝工程改造的主要靶點[19]。通過將來源于解脂耶氏酵母的tHMGR和IDI整合到GLU-1和GLU-2中，轉(zhuǎn)化子經(jīng)過缺陷培養(yǎng)基篩選后，利用引物驗證和測序驗證，獲得MVA途徑優(yōu)化后的工程菌GLU-1M和GLU-2M。

陽性克隆鑒定結(jié)果顯示(圖3b,3c)，工程菌株插入大小與tHMGR(1 500 bp)和IDI(813 bp)基因大小一致的片段。測序結(jié)果顯示序列并未發(fā)生突變，菌株構(gòu)建成功。如圖3d所示，在調(diào)控了MVA途徑后羽扇豆醇合成途徑構(gòu)建成功，羽扇豆醇產(chǎn)量為11.74 mg/L，角鯊烯產(chǎn)量為8.33 mg/L。確定了過表達IDI和HMGR兩種關(guān)鍵酶對羽扇豆醇和角鯊烯的生成起到了強化作用，實現(xiàn)了羽扇豆醇在解脂耶氏酵母中從無到有的合成。然而，BgLUS和RcLUS對羽扇豆醇的合成無顯著差異。

2.3 過表達SQS和SQE對羽扇豆醇和角鯊烯合成的影響

在酵母中，固醇合成途徑是萜類合成的有力競爭途徑，為了使更多的2,3-環(huán)氧角鯊烯投入到萜類合成當(dāng)中，對其含量調(diào)控就尤為重要。在釀酒酵母中，SQE是三萜合成的一個關(guān)鍵限速酶。研究表明，角鯊烯作為重要中間體，其含量極大程度上影響了羽扇豆醇的合成。本研究通過過表達解脂耶氏酵母自身的SQE，構(gòu)建了GLU-1MS，GLU-2MS。另外，經(jīng)過MVA優(yōu)化的GLU-1M和GLU-2M對角鯊烯的積累水平仍然不足。因此在GLU-1MS基礎(chǔ)上，整合來源于解脂耶氏酵母的SQS成功構(gòu)建了GLU-1MSS工程菌。

a:GLU-1M和GLU-2M工程菌株圖解；b:工程菌株tHMGR片段陽性克隆驗證；c:工程菌株IDI片段陽性克隆驗證；d：過表達tHMGR和IDI對羽扇豆醇和角鯊烯產(chǎn)量的影響。圖3 GLU-1M和GLU-2M工程菌株示意圖、瓊脂糖電泳圖及角鯊烯和羽扇豆醇產(chǎn)量圖

陽性克隆鑒定結(jié)果顯示(圖4b，4c)，工程菌株插入片段大小與SQE(1 467 bp)和SQS(1 338 bp)基因大小一致的片段。測序結(jié)果顯示序列并未發(fā)生突變，菌株構(gòu)建成功。如圖4d所示，在強化2,3-環(huán)氧角鯊烯的合成后羽扇豆醇的產(chǎn)量有所上升，兩種不同來源的LUS在羽扇豆醇的合成效果上出現(xiàn)差異，整合了木欖來源的BgLUS的GLU-1MS可合成19.8 mg/L的羽扇豆醇，而蓖麻來源的RcLUS合成的羽扇豆醇不到15 mg/L。為了進一步增強中間產(chǎn)物角鯊烯的產(chǎn)量，在GLU-1MS的基礎(chǔ)上整合了SQS。最終，工程菌GLU-1MSS合成的羽扇豆醇可達24.62 mg/L，角鯊烯產(chǎn)量為14.17 mg/L。相較于上一步優(yōu)化提升了1倍。

a:GLU-1MS、GLU-2MS和GLU-1MSS工程菌株圖解；b:泳道3為GLU-1MS陽性克隆驗證，6為GLU-2MS陽性克隆驗證；c:GLU-1MSS菌株SQS片段陽性克隆驗證；d：過表達SQS和SQE對羽扇豆醇和角鯊烯產(chǎn)量的影響。圖4 GLU-1MS、GLU-2MS和GLU-1MSS工程菌株示意圖、瓊脂糖電泳圖及角鯊烯和羽扇豆醇產(chǎn)量圖

3 結(jié)論

本文以解脂耶氏酵母作為表達菌株，進行了羽扇豆醇合成途徑的構(gòu)建與調(diào)控。向解脂耶氏酵母po1g中分別引入了BgLUS和RcLUS基因及MVA途徑的關(guān)鍵酶HMGR和IDI，構(gòu)建了GLU-1M和GLU-2M工程菌，成功在解脂耶氏酵母中建立了羽扇豆醇合成途徑。為了提升解脂耶氏酵母中羽扇豆醇的產(chǎn)量，進一步過表達了三萜合成的關(guān)鍵限速酶SQE和SQS，構(gòu)建了GLU-1MSS工程菌，使產(chǎn)量羽扇豆醇提升為GLU-1M的2倍。然而目前工程菌中羽扇豆醇的產(chǎn)量仍然很低，這一現(xiàn)象可能是由較低水平的角鯊烯積累和2,3-環(huán)氧角鯊烯的利用不足所導(dǎo)致的。因此，未來對羽扇豆醇在解脂耶氏酵母中的優(yōu)化可以從以下幾個方面展開：(1)過表達整條MVA途徑；(2)抑制固醇合成途徑；(3)使用強啟動子表達關(guān)鍵限速酶；(4)優(yōu)化培養(yǎng)條件；(5)選擇目的基因最佳插入位點。本研究完成了羽扇豆醇解脂耶氏酵母工程菌株的構(gòu)建，為大規(guī)模合成羽扇豆醇提供思路，為進一步合成羽扇豆烷型三萜奠定了基礎(chǔ)。