莊夢晴，張先舟，盧鑫，郭威，馬曉燕，張偉,,3

（1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定 071001）（2.河北農(nóng)業(yè)大學理工學院，河北滄州 061100）（3.河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河北保定 071001）

沙門氏菌是一種人畜共患的致病菌。由沙門氏菌引起的食品中毒大多是由于其穿透胃腸粘膜致使細胞死亡造成的[1]，根據(jù)臨床表征可以分為胃腸炎型、類傷寒型、類霍亂型、類感冒型和敗血癥型[2]。在所有食源性致病菌引起的食物中毒事件中，沙門氏菌引起的食品安全事件居首位，具有高檢出率、高發(fā)病率和高死亡率的特點[3]。數(shù)據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全球各個國家均存在不同程度的沙門氏菌污染問題[4,5]，由此引發(fā)的沙門氏菌相關(guān)疾病，對公眾安全產(chǎn)生了嚴重的威脅，造成了巨大的經(jīng)濟損失[6]。

微生物的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測時間較長，對實驗操作人員、周圍背景及設(shè)備的無菌環(huán)境都有很高的要求，并且無法實現(xiàn)現(xiàn)場檢測[7]。當細菌處于活的不可培養(yǎng)（Viable but non culturable，VBNC）狀態(tài)時，會造成結(jié)果誤判[8]。免疫學方法特異性抗體的制備復(fù)雜[9]，當出現(xiàn)抗原或抗體的相似結(jié)構(gòu)時，會影響檢測的特異性和重復(fù)性[10]，甚至造成最終結(jié)果的誤判[11]。隨著核酸體外擴增技術(shù)的不斷發(fā)展，逐步建立了聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）[12]、多重PCR（Multiplex PCR）[13]、實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）[14]等變溫擴增技術(shù)，這些技術(shù)均需要復(fù)雜的熱循環(huán)系統(tǒng)，儀器昂貴，限制了其在基層現(xiàn)場檢測中的應(yīng)用。為克服上述技術(shù)的缺點，研究人員創(chuàng)新性的發(fā)展了滾環(huán)擴增（Rolling circle amplification，RCA）和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等核酸等溫擴增技術(shù)。但是，RCA技術(shù)需要鎖式探針、連接酶和探針環(huán)化過程，反應(yīng)時間較長（約4 h）[15]；LAMP技術(shù)存在引物設(shè)計復(fù)雜、需要多對引物[16]、產(chǎn)物間易相互作用造成非特異擴增[17]、無法通過測序驗證擴增結(jié)果的正確性等問題。

近年來，本研究團隊發(fā)現(xiàn)了跨越式滾環(huán)等溫擴增（Saltatory rolling circle amplification，SRCA）新方法，并逐漸在致病菌檢測領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)應(yīng)用[18-20]。該方法僅需一對引物，在恒溫條件下依靠BstDNA聚合酶即可實現(xiàn)線性DNA的擴增。原理如圖1所示。正向引物（Forward primer，F(xiàn)WP）與模板DNA結(jié)合后，按照引物 5"→3"方向延伸，當延伸至模板鏈的 5"端時，在BstDNA聚合酶作用下通過添加若干個核苷酸跨過線性DNA兩端的缺口，繼而將先前合成的互補鏈置換下來，繼續(xù)如“滾環(huán)”般循環(huán)往復(fù)的擴增。先前合成的互補鏈不斷延伸，暴露出越來越多的反向引物（Reverse primer，RVP）結(jié)合位點，RVP與之結(jié)合并進行延伸。周而復(fù)始，最終得到許多不同長度的串聯(lián)重復(fù)線性雙鏈DNA。

圖1 SRCA反應(yīng)原理圖Fig.1 The schematic diagram of SRCA assay

FTA膜（Flinders technology associates，F(xiàn)TA）是經(jīng)特殊的螯合劑和變性劑處理的棉纖維卡片，作為Whatman公司的一項專利技術(shù)創(chuàng)新性的應(yīng)用于室溫下核酸的采集、運輸、純化和儲存[21]。當細胞接觸FTA膜時，細胞膜裂解，核酸暴露同時被吸附固定在FTA膜上，經(jīng)特定純化試劑和緩沖溶液的洗滌干燥，即可直接作為模板。洗脫前后電鏡圖如圖2所示。該方法操作簡單，大大節(jié)省了檢測時間和檢測成本。FTA技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人類DNA處理、法醫(yī)學、野生動植物DNA樣品、食源性致病菌、寄生蟲和病原體的檢測中[22,23]。

本研究利用FTA膜吸附固定核酸的方法快速提取模板DNA，根據(jù)沙門氏菌的invA基因設(shè)計及篩選引物，向擴增產(chǎn)物中加入熒光染料進行結(jié)果的判定。擴增反應(yīng)在凹孔板中進行，從而有望實現(xiàn)食品中沙門氏菌的大批量集約化快速檢測。

圖2 FTA膜洗脫前后電鏡圖Fig.2 Electron micrographs of FTA card before and after elution

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

本研究選取46株菌株作為研究對象，其中17株為沙門氏菌，29株為非沙門氏菌，進行引物特異性的探究。研究所需菌種如表1所示。

表1 本研究所用菌種Table 1 Bacterias in this study

注：ATCC：美國模式菌種收集中心（America Type Culture Collection）；CMCC：中國醫(yī)學細胞保藏管理中心（China Medical Culture Collection）；CICC：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection）；LP：實驗室保藏。

表2 沙門氏菌invA基因的引物Table 2 Primers of invA gene in Salmonella

1.1.2 材料與試劑

引物，華大基因公司；6×DNA Loading Buffer、dNTPs Mixture，北京博邁德公司；SYBR Green I（10,000×）、TE緩沖液（pH 8.0），北京索萊寶公司；2×TaqPCR Master Mix，北京全式金生物技術(shù)公司；BstDNA聚合酶、DNA Marker DL2000，大連寶生物公司；FTA膜、FTA純化試劑，Whatman公司。

檢測的食品樣品包括肉類38份，蛋類8份，奶類14份，共計60份。

1.1.3 儀器與設(shè)備

2720 Thermal cycler核酸擴增儀，美國 Applied biosystems公司；DYY-8C電泳儀，北京六一儀器廠；JY04S-3E凝膠成像分析系統(tǒng)，北京乾明基因技術(shù)有限公司；DK-8D三孔電熱恒溫水槽，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)

挑取鼠傷寒沙門氏菌（CMCC 50115）菌株傳代培養(yǎng)3次。挑取典型單菌落接種到營養(yǎng)肉湯中，37 ℃過夜培養(yǎng)，使菌體富集，用以提取基因組DNA。

1.2.2 基因組DNA的提取

通過試劑盒法以及 FTA膜法進行沙門氏菌基因組 DNA的提取。試劑盒法按照操作說明進行提取DNA。FTA膜法：取40 μL過夜培養(yǎng)的菌液滴加至2.00 mm的FTA膜上，55 ℃～60 ℃干燥10 min，F(xiàn)TA純化試劑沖洗2次，TE緩沖液沖洗2次，55 ℃～60 ℃干燥10 min，將得到的吸附有沙門氏菌基因組DNA的FTA膜直接作為反應(yīng)的模板。

1.2.3 引物的設(shè)計與篩選

本研究選擇沙門氏菌高度特異性和保守性的invA基因進行引物設(shè)計[14,24]。通過使用 Primer 5.0和DNAMAN軟件設(shè)計沙門氏菌的特異性引物，引物序列如表2所示。

1.2.4 FTA-SRCA、SRCA和PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

FTA-SRCA的反應(yīng)體系為：2.00 μL正反向引物（0.50 μM），12.00 μL dNTPs（0.75 mM），3.00 μL l0×Thermopol Reaction Buffer（0.75×），6.00 μL Mg2+（3.00 mM），2.00 μLBstDNA聚合酶（大片段），無菌去離子水補足至40 μL。62 ℃反應(yīng)30 min，80 ℃滅酶5 min。向擴增產(chǎn)物中滴加2.00 μL SYBR GreenI（50×）染料進行顏色觀察，從而實現(xiàn)結(jié)果的判定。

SRCA的反應(yīng)條件與FTA-SRCA反應(yīng)相同，在FTA-SRCA反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，增加了 3.00 μL模板DNA（3.10 ng/μL）。結(jié)果通過凝膠電泳法進行觀察。

PCR反應(yīng)引物與SRCA方法相同。PCR的反應(yīng)體系為：11.00 μL 2×EasyTaq PCR SuperMix，1.00 μL 正反向引物（0.50 μM），1.00 μL 模板 DNA（3.10 ng/μL），無菌去離子水補足至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸1 min終止反應(yīng)。

1.2.5 FTA-SRCA擴增反應(yīng)的測序分析

反應(yīng)產(chǎn)物進行凝膠電泳后，按照膠回收試劑盒操作說明進行純化，并按照基因克隆試劑盒操作說明進行連接轉(zhuǎn)化，將菌液送至測序公司進行測序。

1.2.6 引物特異性分析

利用FTA膜法提取表1中46株菌的基因組DNA作為模板，分別進行SRCA反應(yīng)。通過向反應(yīng)產(chǎn)物中添加熒光染料的方法，進行引物特異性分析。

1.2.7 靈敏度分析

將沙門氏菌菌液十倍梯度稀釋后進行平板計數(shù)，測得菌液濃度為 6.81×107～6.81×10-1CFU/mL。利用試劑盒法提取不同濃度菌液的模板DNA后，分別利用SRCA和PCR方法進行擴增反應(yīng)；同時利用FTA膜法提取模板DNA后，進行FTA-SRCA反應(yīng)，并比較分析三種方法的靈敏度。

1.2.8 人工污染的牛奶樣品中沙門氏菌的檢出限分析

向已證實不含有沙門氏菌的牛奶樣品中加入不同濃度的沙門氏菌菌懸液，均質(zhì)液中菌液濃度為3.22×107～3.22×10-1CFU/mL。利用試劑盒法提取基因組DNA后，分別進行SRCA和PCR反應(yīng)；同時利用FTA膜法提取模板DNA后[25]，進行FTA-SRCA反應(yīng)，并比較分析三種方法的檢出限。

1.2.9 FTA-SRCA方法的實際應(yīng)用與評價

為了評估 FTA-SRCA方法在實際樣品檢測中的可行性以及準確性，本研究對60份樣品，分別用PCR方法、SRCA方法、FTA-SRCA方法及國家標準方法GB 4789.4-2016[26]進行檢測，計算得到各個方法的敏感性、特異性和符合率[27]。

敏感性=真陽性/(真陽性+假陰性)×100%

特異性=真陰性/(真陰性+假陽性)×100%

符合率=(真陽性+真陰性)/(真陽性+假陰性+真陰性+假陽性)×100%

1.2.10 數(shù)據(jù)處理

本研究中PCR和SRCA反應(yīng)結(jié)果均通過瓊脂糖凝膠電泳圖譜分析，F(xiàn)TA-SRCA反應(yīng)結(jié)果通過觀察擴增產(chǎn)物的熒光信號顏色變化進行分析。每個實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 FTA-SRCA擴增產(chǎn)物的測序分析

圖3 沙門氏菌FTA-SRCA擴增產(chǎn)物測序分析Fig.3 Sequencing analysis of FTA-SRCA amplification products of Salmonella

將FTA-SRCA反應(yīng)的擴增產(chǎn)物進行測序分析，驗證其是否按照SRCA反應(yīng)原理進行擴增，測序結(jié)果如圖3所示。由圖3a可知，擴增產(chǎn)物呈現(xiàn)明顯的梯形條帶。由圖3b可知，第一條擴增片段長度為60 bp，第二條擴增片段包括兩段60 bp長度的目的片段以及添加片段，添加片段為正向引物的上游片段，長度為20 bp，因此，第二條擴增片段的總長度為140 bp。第三條擴增片段包括三段60 bp長度的目的片段以及兩段添加片段，總長度為220 bp。以此類推，第四條擴增片段總長度為300 bp。其中，出現(xiàn)的錯配基因可能由于擴增反應(yīng)發(fā)生錯配造成的。理論結(jié)果與實際測得的結(jié)果相同，因此，F(xiàn)TA-SRCA方法的擴增結(jié)果正確。

2.2 引物特異性分析

本研究共采用46株菌株對引物進行特異性試驗，結(jié)果如圖4所示。17株沙門氏菌均成功擴增，熒光由橙色變?yōu)辄S綠色；29株非沙門氏菌均沒有發(fā)生擴增反應(yīng)，仍為橙色。因此，針對invA基因設(shè)計的引物特異性極強，適用于沙門氏菌的檢測。

圖4 沙門氏菌引物特異性分析Fig.4 The primer specificity analysis of Salmonella

2.3 靈敏度分析

對不同核酸提取方法以及擴增方法進行靈敏度比較分析，結(jié)果如圖5所示。由圖5a可知，利用試劑盒法提取模板進行PCR反應(yīng)，當菌液濃度降低至6.81×101CFU/mL時不再產(chǎn)生擴增條帶。因此，PCR方法的靈敏度為6.81×102CFU/mL。由圖5b可知，利用試劑盒法提取模板進行SRCA反應(yīng)，當菌液濃度降低至 6.81×100CFU/mL時為陰性擴增結(jié)果。因此，SRCA方法的靈敏度為6.81×101CFU/mL，比PCR方法高10倍。向FTA-SRCA擴增產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ熒光染料，由圖5c可知，當FTA膜處理的菌液濃度為 6.81×107～6.81×100CFU/mL時，熒光顏色均由橙色變?yōu)辄S綠色，為陽性結(jié)果；當濃度為6.81×10-1CFU/mL時，熒光顏色仍為橙色，為陰性結(jié)果。因此，F(xiàn)TA-SRCA方法的靈敏度為 6.81×100CFU/mL。FTA-SRCA方法的靈敏度比PCR方法高100倍，比SRCA方法高10倍?，F(xiàn)有研究中，F(xiàn)TA-PCR檢測單核細胞增生李斯特氏菌的靈敏度為1.10×102CFU/mL[28]，F(xiàn)TA-LAMP檢測阪崎腸桿菌的靈敏度為1.00×103CFU/mL[29]。綜上所述，F(xiàn)TA-SRCA方法具有更高的靈敏度。

圖5 靈敏度分析Fig.5 The sensitivity analysis

2.4 人工污染的牛奶樣品中沙門氏菌的檢出限分析

圖6 檢出限分析Fig.6 The detection limit analysis

分別采用PCR、SRCA和FTA-SRCA方法檢測人工污染的牛奶樣品中的沙門氏菌，對檢出限進行比較分析，結(jié)果如圖6所示。由圖6a可知，當樣品中沙門氏菌濃度降低至3.22×102CFU/mL，不再產(chǎn)生擴增條帶。因此，PCR方法的檢出限為3.22×103CFU/mL。由圖6b可知，當樣品中沙門氏菌濃度降低至 3.22×100CFU/mL，為陰性擴增結(jié)果。因此，SRCA方法的檢出限為3.22×101CFU/mL。向FTA-SRCA擴增產(chǎn)物中加入SYBR Green Ⅰ熒光染料，由圖6c可知，當樣品中沙門氏菌菌液濃度為 3.22×107～3.22×100CFU/mL時，熒光顏色均由橙色變?yōu)辄S綠色。當濃度為 3.22×10-1CFU/mL時，熒光顏色仍為橙色，為陰性結(jié)果。FTA-SRCA方法的檢出限為3.22×100CFU/mL，比PCR方法低 1000倍，比SRCA方法低 10倍。已報道的FTA-PCR檢測沙門氏菌方法的檢出限為 1.00×101CFU/mL[25]，F(xiàn)TA-SRCA方法的檢出限比其低 1個數(shù)量級。原因可能是試劑盒法提取的模板DNA中含有蛋白質(zhì)、脂肪等抑制因子，對擴增反應(yīng)產(chǎn)生了抑制作用，大大降低了PCR檢測牛奶中沙門氏菌的靈敏程度，故PCR方法的檢出限比靈敏度低一個數(shù)量級。而因SRCA反應(yīng)的靈敏度比PCR高，一定程度上抵消了部分抑制作用，故SRCA反應(yīng)的靈敏度和檢出限在同一數(shù)量級。FTA膜提取方法一定程度上降低了雜質(zhì)含量，從而減小了抑制作用[30]。

2.5 FTA-SRCA方法的實際應(yīng)用與評價

本研究分別用PCR方法、SRCA方法、FTA-SRCA方法及國家標準方法GB 4789.4-2016對60份樣品進行檢測，結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，與國標相比，PCR、SRCA和FTA-SRCA方法均出現(xiàn)更多的陽性結(jié)果，原因在于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法靈敏度較低，且不能檢測出VBNC狀態(tài)的菌株，而這些狀態(tài)的菌體仍具有致病的潛在危害。對分子擴增方法而言，食品中不同狀態(tài)的沙門氏菌均含有基因組DNA，但其含量有所差異。SRCA擴增方法的靈敏度比PCR高，可以檢測的沙門氏菌的檢出限更低；對核酸提取方法而言，F(xiàn)TA膜法核酸提取的效果優(yōu)于試劑盒法，故檢測出的陽性結(jié)果更多。

表2 實際樣品檢測結(jié)果Table 2 The results of actual sample detection

3 結(jié)論

3.1 本研究建立了一種FTA膜結(jié)合跨越式滾環(huán)等溫擴增技術(shù)（FTA-SRCA）檢測食品中沙門氏菌的方法。與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，操作簡單，節(jié)省了時間和成本；與變溫擴增方法相比，無需復(fù)雜昂貴的變溫儀器，無需對操作人員較高的技術(shù)要求；與等溫擴增方法LAMP相比，引物設(shè)計簡單，擴增結(jié)果可通過測序驗證，利用熒光可視法進行結(jié)果的判定，避免了繁瑣的電泳過程；與RCA方法相比，無需探針環(huán)化過程，節(jié)省時間和成本。與試劑盒提取DNA的SRCA方法相比，核酸提取步驟簡單，成本降低約1/2，時間減少約3/4，利用凹孔板可實現(xiàn)對大批量樣品的集約化快速檢測。

3.2 綜上所述，本研究建立的檢測食品中沙門氏菌的FTA-SRCA方法切實可行。該方法操作簡便快速、成本低廉、特異性好、靈敏度高、檢測限低。利用FTA膜提取的基因組DNA吸附固定在膜上，經(jīng)過FTA純化試劑和TE緩沖液的沖洗，在一定程度上可以消除蛋白質(zhì)、油脂等雜質(zhì)對擴增反應(yīng)的抑制作用的影響。反應(yīng)在凹孔板中恒溫進行，可實現(xiàn)大批量樣品的集約化檢測。上述優(yōu)勢為該技術(shù)在基層檢測機構(gòu)中的應(yīng)用和推廣奠定了基礎(chǔ)。

3.3 目前，本研究所建立的 FTA-SRCA方法僅適用于定性檢測，試驗所用的FTA標準膜將DNA固定在其纖維基質(zhì)上，導(dǎo)致無法實現(xiàn)定量分析?？刹捎肍TA洗脫膜洗脫DNA，實現(xiàn)FTA-SRCA方法的定量檢測。另外，該方法無法區(qū)分死活菌，后續(xù)研究可將 PMA方法與FTA-SRCA技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)死活菌的識別和定量。FTA-SRCA方法也可用于寄生蟲、動植物病毒、轉(zhuǎn)基因食品和過敏原等方面的檢測，以期擴大本方法的應(yīng)用范圍并實現(xiàn)其應(yīng)用價值。