李夢(mèng)琴，朱 梅，馮煜然，范 旭

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲科，云南 昆明 650032)

甲狀腺結(jié)節(jié)發(fā)病率達(dá)70%。采用微波消融原位滅活可致腫瘤細(xì)胞壞死，但消融過(guò)程中過(guò)高熱能可能損傷周?chē)M織[1]。細(xì)胞凋亡是啟動(dòng)自主程序性死亡的過(guò)程[2]，誘導(dǎo)凋亡所需消融能量或化學(xué)治療(簡(jiǎn)稱(chēng)化療)劑量通常較低，可顯著提升治療的安全性。目前多通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法識(shí)別和評(píng)價(jià)凋亡，如光鏡/電鏡下觀察形態(tài)學(xué)、檢測(cè)DNA片段、凋亡相關(guān)基因及產(chǎn)物等[3]。膜聯(lián)蛋白Ⅴ(annexin Ⅴ)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)細(xì)胞凋亡已得到廣泛臨床應(yīng)用，核素顯像及CT、MRI分子影像領(lǐng)域相繼開(kāi)展了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，但以聲學(xué)顯影方法實(shí)時(shí)識(shí)別凋亡的研究報(bào)道較少。本研究嘗試制備可靶向識(shí)別凋亡細(xì)胞的超聲微泡(microbubbles, MB)，并評(píng)價(jià)其體外識(shí)別凋亡細(xì)胞的能力，旨在以簡(jiǎn)便直觀的影像學(xué)方法判定腫瘤凋亡及凋亡范圍。

1 材料與方法

1.1 主要材料 CAL-62人甲狀腺未分化癌細(xì)胞株(北納生物)，annexin Ⅴ抗體、山羊抗兔IgG-FITC(Abcom公司)，親和素(avidin，Sigma-Aldrich公司)，二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dipalmitoyl phosphatidyl choline， DPPC)、甲氧基聚乙二醇(methoxypolyethylene glycols， MPEG)200、二棕櫚?；字?dipalmitoyl phosphonic acid， DPPA)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(distearoylphosphatidylethanolamine-polyethylene glycol， DSPE-PEG)2000、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素(dipalmitoylphosphatidylethanolamine-polyethylene glycol-biotin， DSPE-PEG-Biotin)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dipalmitoylphosphatidylethanolamine-polyethylene glycol， DSPE-PEG)200(Avanti公司)，細(xì)胞培養(yǎng)液Hyclone(DMEM公司)，annexin Ⅴ/碘化丙啶(annexin Ⅴ/propidium iodide， annexin Ⅴ/PI)凋亡試劑盒(BD公司)，一步法Tunel細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(KeyGEN BioTECH公司),細(xì)胞膜紅色熒光探針(DiI，索萊寶公司)。

1.2 主要儀器 Olympus熒光顯微鏡，RHERMO臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，威爾德機(jī)械振蕩儀，Malvern表面電位儀，康友微波消融儀，諾禾致源流式細(xì)胞儀。

1.3 制備MB 取DPPC、MPEG200、DPPA、DSPE-PEG2000-Biotin，按摩爾比80∶5∶5∶10充分混懸后分裝于3 ml西林瓶中，采用特定凍干工藝程序，全氟丙烷置換空氣，加入溶酶液(三羥甲基氨基甲烷∶甘油∶丙二醇體積比為8∶1∶1)制成生物素化MB，充分振蕩、離心洗滌后依次加入avidin、annexin Ⅴ抗體、山羊抗兔IgG-FITC，孵育20 min后離心洗滌制得FITC標(biāo)記的annexin Ⅴ靶向MB。

取DPPC、MPEG200、DPPA及DSPE-PEG2000，按相同摩爾比充分混懸，經(jīng)凍干工藝程序后，全氟丙烷置換空氣，加入溶酶液，機(jī)械振蕩儀充分振蕩后得到普通MB。

1.4 評(píng)價(jià)annexin Ⅴ靶向MB理化性質(zhì)及穩(wěn)定性 將50 μl靶向MB 加入100 ml電解液中，采用粒徑分析儀測(cè)量粒徑分布范圍、以表面電位儀測(cè)量Zeta電位后置入4℃冰箱內(nèi)避光保存。于制成時(shí)、制成7天、14天及1個(gè)月后于鏡下觀察MB形態(tài)大小及分布情況；取1 ml靶向MB原液，以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)稀釋10倍，加入血球計(jì)數(shù)板，鏡下計(jì)數(shù)3次，取平均值計(jì)算平均濃度：MB濃度(MB數(shù)/ml)=80小格MB數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)。

1.5 獲取凋亡CAL-62細(xì)胞初步篩選最佳消融參數(shù) 將CAL-62細(xì)胞傳代種植于直徑35 mm培養(yǎng)皿中，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，分為消融組(以1～15 W、2～5 min進(jìn)行分組消融)及對(duì)照組(僅插入電極)；將微波電極斜插入培養(yǎng)皿，電極勻速均勻轉(zhuǎn)動(dòng)，均勻加熱使細(xì)胞受熱。消融結(jié)束后以胰酶消化離心，采用annexin Ⅴ/PI凋亡試劑盒及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡情況，記錄并分析數(shù)據(jù)，獲得最佳消融參數(shù)。

1.6 鑒定凋亡細(xì)胞

1.6.1 流式細(xì)胞術(shù)及Tunel試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用最佳消融參數(shù)再次對(duì)細(xì)胞進(jìn)行微波消融，先后加入annexin Ⅴ與PI，孵育后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。取一步法Tunel細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒，按說(shuō)明操作，之后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。(即A、B、C共3組)

1.6.2 觀察annexin Ⅴ靶向MB特異性結(jié)合凋亡細(xì)胞 取3份腫瘤細(xì)胞，每份計(jì)數(shù)約2×104個(gè)，對(duì)其中2份行微波消融，1份作為對(duì)照而不予處理，觀察其尋靶情況。A組(凋亡細(xì)胞+普通MB)：取凋亡腫瘤細(xì)胞，以PBS洗滌3次，加入普通MB孵育20 min后再以PBS輕柔緩慢沖洗3次，置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。B組(正常細(xì)胞+靶向MB)：取正常細(xì)胞。C組(凋亡細(xì)胞+靶向MB)：取凋亡腫瘤細(xì)胞。對(duì)B組及C組細(xì)胞以PBS洗滌3次，加入DiI細(xì)胞膜染料，避光孵育15 min后以PBS洗滌3次，加入annexin Ⅴ靶向MB，避光孵育20 min后再以PBS輕柔緩慢沖洗3次，置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 鏡下觀察MB 普通光鏡及熒光顯微鏡下，annexin Ⅴ靶向MB和普通MB分布均勻，為大小一致的泡狀結(jié)構(gòu)(圖1A、1B)；熒光顯微鏡下，靶向MB呈花環(huán)狀綠色熒光結(jié)構(gòu)(圖1C)，普通MB不發(fā)出熒光(圖1D)。

圖1 顯微鏡鏡下annexin Ⅴ靶向MB與普通MB圖像(×200) A、B.光鏡下觀察annexin Ⅴ靶向MB(A)與普通MB(B)； C、D.熒光顯微鏡下觀察annexin Ⅴ靶向MB(C)與普通MB(D)

2.2 靶向MB理化性質(zhì)及穩(wěn)定性 annexin Ⅴ靶向MB大小均一，分布均勻，理化性質(zhì)穩(wěn)定，平均粒徑(0.78±0.06)μm，Zeta電位為(-22.70±1.80)mV(圖2)。制成時(shí)、制成7天、14天及1個(gè)月后靶向MB平均濃度分別為4.23×108/ml、2.70×108/ml、2.21×107/ml及3.70×105/ml。隨時(shí)間延長(zhǎng)，鏡下所見(jiàn)MB粒徑逐漸增大、分布由均勻轉(zhuǎn)為聚集，熒光強(qiáng)度則逐漸減弱。

圖2 annexin Ⅴ MB粒徑分析結(jié)果

2.3 細(xì)胞消融最佳參數(shù) 隨功率增加，不同消融時(shí)間下細(xì)胞存活率總體呈下降趨勢(shì)，凋亡率及死亡率總體呈上升趨勢(shì)，死亡率升高時(shí)凋亡率相對(duì)有所下降；微波消融CAL-62細(xì)胞最佳參數(shù)為功率10 W、時(shí)間3 min(圖3)。

圖3 不同消融時(shí)間細(xì)胞存活率(A)、凋亡率(B)及死亡率(C) (箭示最佳消融參數(shù))

2.4 鑒定凋亡細(xì)胞 根據(jù)細(xì)胞凋亡早期膜內(nèi)磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine， PS)外翻至膜外、可與annexin Ⅴ高親和力結(jié)合而PI可進(jìn)入晚期凋亡及死細(xì)胞包膜內(nèi)，可區(qū)分活細(xì)胞、早期、晚期凋亡及死細(xì)胞(圖4)。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)鑒定凋亡細(xì)胞 Q1、Q2、Q3、Q4分別為死亡、晚期凋亡、活細(xì)胞及早期凋亡細(xì)胞占比

Tunel檢測(cè)法：以紅色熒光素標(biāo)記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶作用下可與凋亡細(xì)胞內(nèi)DNA斷鏈3’-OH末端鏈接；凋亡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的斷鏈DNA在熒光顯微鏡下呈紅色熒光，以DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)復(fù)染細(xì)胞核后，凋亡與非凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核在熒光顯微鏡下呈藍(lán)色，二者重合而呈紫紅色，即為凋亡細(xì)胞(圖5)。

圖5 消融后細(xì)胞Tunel實(shí)驗(yàn)merge圖(×100) 藍(lán)色胞核與紅色熒光核酸斷鏈重合呈紫紅色，即為凋亡細(xì)胞

2.5 annexin Ⅴ靶向MB體外識(shí)別凋亡細(xì)胞 A組：熒光顯微鏡下僅見(jiàn)消融后腫瘤細(xì)胞，未見(jiàn)與凋亡細(xì)胞穩(wěn)定結(jié)合的普通MB(圖6A)；B組：鏡下僅見(jiàn)正常細(xì)胞，未見(jiàn)正常細(xì)胞與靶向MB穩(wěn)定結(jié)合(圖6B)；C組：鏡下見(jiàn)凋亡細(xì)胞與annexin Ⅴ靶向MB穩(wěn)定結(jié)合(圖6C、6D)。

圖6 鏡下annexin Ⅴ MB體外尋靶圖(×100) A、B.分別為熒光顯微鏡下觀察A組及B組； C、D.鏡下觀察C組，細(xì)胞標(biāo)記為紅色熒光，靶向MB標(biāo)記為綠色熒光

3 討論

為有效消融甲狀腺腫瘤，臨床多選擇高功率、長(zhǎng)時(shí)間消融模式，其所帶來(lái)的過(guò)高熱能易損傷周?chē)M織，引起不可逆的并發(fā)癥[1]；而以低能級(jí)超聲誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[4]同樣可達(dá)到治療目的，若治療過(guò)程中能夠識(shí)別凋亡和凋亡范圍，則可在提高治療安全性的同時(shí)保證其有效性，具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值。

annexin Ⅴ對(duì)凋亡早期自細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)外翻至膜外的PS具有高親和力[5]，將annexin Ⅴ加載到超聲MB上，即可制備出能夠靶向識(shí)別凋亡細(xì)胞的新型功能性MB。本實(shí)驗(yàn)采用生物素化MB鏈接親和素，進(jìn)一步結(jié)合annexin Ⅴ及熒光二抗的方法成功制備了粒徑小、大小均一、性質(zhì)穩(wěn)定的annexin Ⅴ靶向MB。生物素-親和素系統(tǒng)是已知最強(qiáng)的非共價(jià)作用，每個(gè)親和素分子有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)[6]，呈多級(jí)放大模式，可避免浪費(fèi)抗體，保證抗體高攜載率；按特定順序制泡，逐步分離、提純未與MB鏈接的親和素、抗體及脂質(zhì)膜碎片[7]，可提高靶向MB純度。

目前關(guān)于微波治療的臨床應(yīng)用研究較多，但應(yīng)用凋亡理論避免毒副損傷的報(bào)道較少。為驗(yàn)證annexin Ⅴ靶向MB的特異性識(shí)別能力，首先需獲取凋亡細(xì)胞。有學(xué)者[8]采用順鉑或紫杉醇等化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，再進(jìn)行體外尋靶。本實(shí)驗(yàn)采用微波消融腫瘤細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)及Tunel檢測(cè)，驗(yàn)證了微波消融可誘導(dǎo)CAL-62細(xì)胞凋亡，為annexin Ⅴ MB體外尋靶奠定了基礎(chǔ)。為保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)效果，首先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選消融參數(shù)，獲取了凋亡率最佳的細(xì)胞樣本。體外尋靶實(shí)驗(yàn)中，A組、B 組細(xì)胞均不具備靶向?qū)?yīng)性，未見(jiàn)與細(xì)胞穩(wěn)定結(jié)合的MB；而C組annexin Ⅴ靶向MB可與凋亡細(xì)胞外翻的PS高親和度結(jié)合，提示相對(duì)于普通MB，annexin Ⅴ靶向MB識(shí)別凋亡細(xì)胞具有高度特異度與敏感度。

既往相關(guān)研究[9-10]多利用超聲MB攜載靶向配體、治療藥物或基因，并取得了一定成果。目前靶向MB多用于對(duì)局部組織的特異性尋靶，以針對(duì)性診斷特定疾病。本實(shí)驗(yàn)制備的靶向MB未添加特異性識(shí)別特定腫瘤的靶向分子，僅針對(duì)性識(shí)別凋亡細(xì)胞外翻的PS分子[5]，可用于檢測(cè)正常組織及腫瘤組織等細(xì)胞凋亡狀況，并有望由此建立無(wú)創(chuàng)識(shí)別凋亡細(xì)胞的特異性靶向顯影方法[8]，評(píng)估臨床抗癌療效，減少治療過(guò)程中正常組織的損傷，降低并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)。

本研究不足之處在于annexin Ⅴ靶向MB體外識(shí)別凋亡細(xì)胞僅是初步尋靶體外實(shí)驗(yàn)，其體內(nèi)顯影效果有待觀察；且需進(jìn)一步改進(jìn)設(shè)計(jì)，提高制備annexin Ⅴ靶向MB的成功率。