葛夢妍 顧宸瑞 陳坤 王偉 王楚 劉桂豐

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

汪廣宇 姜靜

(黑龍江嘉懋園林建設(shè)股份有限公司) (林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué)))

高等植物在受到滲透脅迫后，其體內(nèi)的甜菜堿醛脫氫酶活性升高，并在細(xì)胞質(zhì)中積累甜菜堿，進(jìn)而提高了植物對干旱及鹽脅迫的適應(yīng)性[1-4]。植物的甜菜堿是以膽堿為底物合成，經(jīng)膽堿加單氧酶(CMO)和甜菜堿醛脫氫酶(BADH)兩步催化完成[5-6]。而來自大腸桿菌的betA基因編碼的膽堿脫氫酶(CDH)具有膽堿加單氧酶(CMO)與甜菜堿醛脫氫酶(BADH)兩個酶的功能，能夠催化甜菜堿合成的兩個連續(xù)反應(yīng)，既能以膽堿為底物，也能以甜菜堿醛為底物進(jìn)行甜菜堿的合成[7]。因此，編碼膽堿脫氫酶基因(betA)被認(rèn)為是植物耐鹽基因工程中的有效基因，已經(jīng)廣泛用于植物的耐鹽轉(zhuǎn)基因研究[8-17]。筆者所在的團(tuán)隊(duì)以東北地區(qū)廣泛推廣的小黑楊(Populussimonii×P.nigra)為轉(zhuǎn)基因受體，開展膽堿脫氫酶基因(betA)的轉(zhuǎn)化研究。獲得的轉(zhuǎn)betA基因小黑楊，苗期NaCl脅迫試驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)基因株系的甜菜堿含量均顯著高于對照株系，根據(jù)NaCl脅迫后苗木的抗氧化酶活性、丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度、鹽害指數(shù)等指標(biāo),選出TB1、TB2、T4、T5、T6株系為耐鹽優(yōu)良株系[18-21]。在輕度鹽堿地營建4 a的轉(zhuǎn)betA小黑楊試驗(yàn)林分析顯示，T01株系其樹高、胸徑和材積生長表現(xiàn)最好，分別較對照株系高14.74%、18.81%和47.50%，根據(jù)隸屬函數(shù)值選出T1、T6和T8轉(zhuǎn)基因株系為耐鹽優(yōu)良株系[22]。由于林木具有生長周期長、受自然因素影響大、可控制性差的特點(diǎn)，部分性狀表現(xiàn)早、晚期相關(guān)性弱，對轉(zhuǎn)基因小黑楊耐鹽性的早期評價(jià)尚需進(jìn)一步驗(yàn)證，為此，試驗(yàn)針對13年生的轉(zhuǎn)基因小黑楊林分再次進(jìn)行調(diào)查，檢測目標(biāo)基因的穩(wěn)定性，評價(jià)轉(zhuǎn)基因株系的生長適應(yīng)性，研究結(jié)果為環(huán)境釋放及生產(chǎn)性試驗(yàn)提供指導(dǎo)。

1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)置在黑龍江省大慶市林原鎮(zhèn)新華六隊(duì)，屬于半干旱碳酸鹽堿地的代表。年平均氣溫4.2 ℃，極端最低氣溫-39.2 ℃，最熱月平均氣溫23.3 ℃，極端最高氣溫39.8 ℃，年均無霜期143 d。年均降水量427.5 mm，年均蒸發(fā)量1 635 mm。土壤pH=10.8，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.98%。

2 材料與方法

試驗(yàn)材料為小黑楊轉(zhuǎn)betA基因株系。2004年春，將小黑楊轉(zhuǎn)基因(betA)株系與對照株系1年生扦插苗去掉地上部分，僅用苗根在大慶進(jìn)行定植試驗(yàn)。試驗(yàn)林均按照完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，4次重復(fù)。參試株系14個，其中轉(zhuǎn)基因株系13個(分別命名為T01、T02、T04、T05、T06、T07、T08、T09、T10、T11、T12、T13、T14)，對照株系(CK)1個，采用8株小區(qū)4行排列，株行距2 m×3 m，試驗(yàn)地周圍設(shè)置3行保護(hù)行。造林后按照常規(guī)林分管理，包括定桿、除草、松土、病蟲害防治等。

2.1 目標(biāo)基因的分子檢測

PCR檢測引物序列：根據(jù)betA序列，用DNASTAR的Primer Select軟件，設(shè)計(jì)引物betA-F：5′-TACATCATTATTGGTGCCGGCTCA-3′；betA-R：5′-CATCCCATTTGCCACAAAATATCCC-3′。

PCR擴(kuò)增檢測：采用植物總DNA提取試劑盒提取參試株系葉片總DNA，以betA載體質(zhì)粒DNA為陽性對照，以水為陰性對照，用上述引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：在25 μL反應(yīng)體積中含DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，1.1×T3 Super PCR Mix 12.5 μL，加ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?6 ℃預(yù)變性3 min；進(jìn)行PCR循環(huán)；96 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，34個循環(huán)后繼續(xù)于72 ℃延伸5 min，16 ℃保溫。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測。

RT-PCR擴(kuò)增檢測：采用離心柱型總RNA快速提取試劑盒提取參試株系葉片總RNA，用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA稀釋10倍后用于RT-PCR模板。RT-PCR引物、反應(yīng)體系及程序同上，PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測。

2.2 試驗(yàn)林性狀調(diào)查及數(shù)據(jù)分析

2017年秋，調(diào)查了小黑楊轉(zhuǎn)基因株系試驗(yàn)林的所有單株，采用超聲波測高測距儀測量了樹高，精確至0.1 m；采用胸徑尺測量了胸徑，精確至0.1 cm；依據(jù)各試驗(yàn)點(diǎn)內(nèi)的保存株數(shù)計(jì)算各株系保存率；根據(jù)小黑楊的二元材積表[23]計(jì)算單株材積:

V=0.000 730 584 099-0.000 040 168 020 5D2+

0.000 034 384 964 4D2H+0.000 337 503 207H+

0.000 002 052 761 11DH2。

式中：V為小黑楊的材積(m3)；D為測得的小黑楊胸徑值(cm)；H為測得的小黑楊樹高值(m)。

經(jīng)過13 a的造林試驗(yàn)，試驗(yàn)點(diǎn)中保留株系共計(jì)11個，包括10個轉(zhuǎn)基因株系(T01、T02、T04、T05、T06、T08、T09、T12、T13、T14)和1個對照株系(CK)，但由于T02、T04、T09、T14保存率較低，未納入統(tǒng)計(jì)分析，樹高、胸徑、材積及保存率僅統(tǒng)計(jì)分析了7個株系，即T01、T05、T06、T08、T12、T13和CK株系。

數(shù)據(jù)分析方法：利用SPSS19.0軟件對樹高、胸徑、材積和保存率4個性狀進(jìn)行方差分析及多重比較，并通過隸屬函數(shù)法選擇出在試驗(yàn)點(diǎn)適應(yīng)性較好的株系。

式中：u(Xi)為第i個性狀的隸屬函數(shù)值，Xi為第i個性狀的數(shù)值，Xmin為第i個性狀的最小值，Xmax為第i個性狀的最大值。

計(jì)算材積和保存率2個性狀的隸屬函數(shù)值并給予權(quán)重，用加權(quán)單因子法計(jì)算出各株系的隸屬函數(shù)均值。

重復(fù)力計(jì)算公式：

式中:F為方差分析中株系間F值。

遺傳增益計(jì)算公式：

變異系數(shù)計(jì)算公式：

式中:σ為標(biāo)準(zhǔn)差;μ為平均值。

3 結(jié)果與分析

3.1 betA基因在小黑楊基因組中整合和表達(dá)

以待測株系葉片總DNA為模板，以betA質(zhì)粒為陽性對照，以水為陰性對照，對外源betA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1A，轉(zhuǎn)基因株系均在1 500 bp呈現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期的betA基因序列(1 470 bp)大小吻合，而對照株系及水對照未見擴(kuò)增譜帶，說明13年生時(shí)，外源betA基因仍穩(wěn)定整合于轉(zhuǎn)基因株系基因組中，尚未發(fā)生丟失。

以上述株系的cDNA為模板，以betA質(zhì)粒為陽性對照，進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果如圖1B，轉(zhuǎn)基因小黑楊在1 500 bp處均呈現(xiàn)特異性擴(kuò)增譜帶，與預(yù)期的betA基因序列(1 470 bp)大小吻合，而陰性對照均未見擴(kuò)增譜帶，說明轉(zhuǎn)基因小黑楊中導(dǎo)入的外源betA基因能夠在mRNA水平上正常表達(dá)。

1.Marker；2.陽性質(zhì)粒;3.陰性水對照;4.對照株系;5～14.轉(zhuǎn)betA株系T01、T02、T04、T05、T06、T08、T09、T12、T13、T14。

3.2 轉(zhuǎn)基因株系生長性狀差異顯著性

在鹽堿地開展造林試驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因株系，生長量及保存率是評定參試株系抗逆性的重要指標(biāo)。因此，對參試的7個株系生長性狀及保存率方差分析顯示(表1)，株系間各生長性狀及保存率的差異均達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)；株系間材積和保存率的變異系數(shù)均較大，分別為36.61%和28.20%，進(jìn)一步對各性狀方差分量分析發(fā)現(xiàn)，株系間樹高、胸徑、材積及保存率的方差分量比例分別為43.42%、76.00%、63.12%和35.69%，說明株系間的差異對各株系的生長表現(xiàn)有較大影響。基于上述轉(zhuǎn)基因株系間的生長性狀存在顯著性差異，開展優(yōu)良株系選擇很有必要。

3.3 優(yōu)良株系的選擇

材積可以代表樹木的生長量，因此試驗(yàn)利用材積、保存率2個性狀采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對7個株系進(jìn)行綜合評價(jià)(表2)，綜合評價(jià)中對材積、保存率分別給予0.5的權(quán)重值，求算出隸屬函數(shù)均值。隸屬函數(shù)均值越高，其綜合評價(jià)越好，若將隸屬函數(shù)均值在0.8以上的評為優(yōu)良株系，則入選株系為T01、T06和T08，其中T01名列前茅，為最優(yōu)株系，樹高、胸徑、材積均值分別為11.03 m、11.76 cm、0.055 m3，遺傳增益分別為12.1%、11.2%和34.5%；入選的T06、T08株系材積均值分別高于最差株系(T05)的228.64%、286.13%，材積遺傳增益分別為5.8%、22.8%。本次入選的株系與2008年對5年生的該試驗(yàn)林優(yōu)良株系選擇結(jié)果一致(表2)，在2008年的選擇分析中生長表現(xiàn)最差的T04、T07、T10、T11、T14等5個轉(zhuǎn)基因株系，本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)上述5個株系保存率已經(jīng)降至10%以下，故此未納入本次統(tǒng)計(jì)分析。由表2還可見，經(jīng)過13 a的造林對比試驗(yàn)，入選的T01、T06、T08優(yōu)良株系的保存率幾乎沒有發(fā)生變化，說明轉(zhuǎn)betA小黑楊5年生時(shí)的選擇結(jié)果準(zhǔn)確可靠，外源betA基因在小黑楊基因組適宜位點(diǎn)的插入確實(shí)可以顯著提高其耐鹽性。

表1 參試株系各性狀方差分析

表2 兩次調(diào)查參試株系各性狀平均值比較

株系2017年樹高/m胸徑/cm材積/m3保存率/%隸屬函數(shù)均值排序CK(9.48±1.5)B(10.25±1.2494)B(0.037±0.013)C(82.6±5.7)AB0.704T01(11.03±1.4)A(11.76±0.96)A(0.055±0.014)A(81.3±16.1)AB0.901T05(7.27±1.6)C(6.08±1.70)C(0.013±0.008)D(41.7±19.1)B0.007T06(9.50±1.5)B(11.06±1.36)AB(0.043±0.016)B(90.6±6.3)A0.852T08(10.32±1.0)AB(11.6±1.00)A(0.050±0.011)AB(81.3±7.2)AB0.843T12(9.73±1.9)B(11.1±1.06)AB(0.044±0.015)B(59.4±12.0)B0.545T13(9.68±2.0)B(10.6±1.13)B(0.040±0.015)BC(60.9±26.2)B0.526

4 結(jié)論與討論

4.1 外源betA基因在轉(zhuǎn)基因小黑楊中的穩(wěn)定表達(dá)

快速發(fā)展的生物技術(shù)下轉(zhuǎn)基因作物新品種的不斷培育為全球糧食安全保障帶來了新的機(jī)遇,同時(shí)，轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境釋放和商品化生產(chǎn)也引起了全世界對轉(zhuǎn)基因作物生物安全問題的極大關(guān)注[24]。1983年世界首例轉(zhuǎn)基因植物培育成功，為植物基因工程帶來了廣闊前景，但轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用也越來越受到爭議。目前對由轉(zhuǎn)基因逃逸可能導(dǎo)致的生態(tài)安全性等方面問題還沒有結(jié)論性的結(jié)果，但已引起政府、社會和科學(xué)界的廣泛關(guān)注[25]。筆者所在研究團(tuán)隊(duì)也對轉(zhuǎn)基因小黑楊進(jìn)行了生物安全性評價(jià)，采集了轉(zhuǎn)基因株系根際土壤及周邊雜草，分別對提取的DNA樣品進(jìn)行選擇劑及目標(biāo)基因的PCR檢測，結(jié)果表明，目標(biāo)基因既沒有逃逸也沒有釋放到環(huán)境中，而是穩(wěn)定存在于轉(zhuǎn)基因小黑楊的基因組中。

本研究通過對轉(zhuǎn)betA小黑楊的分子檢測表明，betA基因在轉(zhuǎn)基因株系的基因組中能夠長期穩(wěn)定整合并能夠正常表達(dá)。13年生的轉(zhuǎn)基因小黑楊株系均已到達(dá)可以用材的樹齡，本研究的跟蹤調(diào)查周期足夠長，選擇結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

4.2 轉(zhuǎn)betA基因能夠提高植物的耐鹽性

積累滲透保護(hù)物質(zhì)是植物在滲透脅迫條件下一種重要而普遍的適應(yīng)機(jī)制,對于禾本科和藜科植物,最有效的物質(zhì)當(dāng)屬季胺類化合物中的甘氨酸甜菜堿。它作為滲透保護(hù)物質(zhì)一方面能夠使細(xì)胞保持適當(dāng)?shù)臐B透勢而防止脫水；另一方面能夠?qū)ι锎蠓肿拥慕Y(jié)構(gòu)及功能起穩(wěn)定、保護(hù)作用。但煙草(NicotianatabacumL.)、番茄(LycopersiconesculentumMill.)、馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)、水稻(OryzasativaL.)等作物卻沒有合成甘氨酸甜菜堿的能力[8]。

早期研究表明，將betA基因轉(zhuǎn)入煙草中并將轉(zhuǎn)基因株系置于高濃度氯化鈉溶液中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)基因煙草生長速度更快且能夠積累甜菜堿，耐鹽性有顯著提升[26-27]；將betA基因轉(zhuǎn)入番茄中，在200 mmol/L的NaCl處理下，轉(zhuǎn)基因番茄與對照番茄相比葉片質(zhì)膜透性降低23%，耐鹽性增加[8];將betA基因轉(zhuǎn)入棉花(Gossypiumspp.)中，在鹽脅迫和低溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系葉片中甘氨酸甜菜堿的含量均顯著高于對照株系，且轉(zhuǎn)基因棉花的種子萌發(fā)率較對照株系高近一倍，轉(zhuǎn)基因棉花株系也表現(xiàn)出生物量增加，葉片失水慢的性狀[28];將betA基因轉(zhuǎn)入小麥(TriticumaestivumL.),經(jīng)鹽脅迫和干旱脅迫后，轉(zhuǎn)基因小麥葉片中甘氨酸甜菜堿含量較對照株系高約2倍，在鹽脅迫下的種子萌發(fā)率為對照株系的1.45倍，同時(shí)轉(zhuǎn)基因小麥也表現(xiàn)出了生物量的增加和光合作用的改善，說明betA基因的轉(zhuǎn)入顯著提高了小麥的抗逆性[29-30]。2001年，筆者所在的林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室首次將betA基因轉(zhuǎn)入小黑楊中[31]，隨后在小黑楊生長發(fā)育的不同階段都進(jìn)行了耐鹽性試驗(yàn)并證實(shí)了betA基因確實(shí)能夠提高小黑楊的耐鹽性。本研究中，經(jīng)過在鹽堿地上的造林試驗(yàn)，面對長達(dá)13年的鹽脅迫，轉(zhuǎn)betA小黑楊株系依然表現(xiàn)出了良好的生長特性。

4.3 不同轉(zhuǎn)基因株系間生長性狀的差異

外源基因?qū)胄『跅罨蚪M時(shí)，有時(shí)會對固有基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響了轉(zhuǎn)基因株系的生長發(fā)育，這是造成不同轉(zhuǎn)基因株系間性狀差異的主要因素，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入不僅破壞了插入位點(diǎn)的基因功能，而且因?yàn)門-DNA序列已知，使得被破壞的基因序列的分離相對簡單和快捷，因此該技術(shù)被廣泛地用于功能基因的研究[32]。在本研究中，最初在造林地點(diǎn)對12個小黑楊株系進(jìn)行了造林對比試驗(yàn)，經(jīng)過4 a造林試驗(yàn)后，雖然全部存活，但幾個耐鹽性差的轉(zhuǎn)基因株系(T04、T07、T10、T11、T14)的生長量和保存率明顯小于其他優(yōu)良耐鹽株系和對照株系；13 a后，上述耐鹽性差的5個轉(zhuǎn)基因株系陸續(xù)死亡，說明外源基因的插入非但沒有提高這些株系的抗鹽堿能力，反而影響了該株系的正常生長發(fā)育。T01、T06和T08這3個株系在鹽堿地具有生長快、保存率高的優(yōu)良表現(xiàn)，說明外源基因在這3個株系株系的基因組中插入到適宜的位點(diǎn)，既不影響轉(zhuǎn)基因小黑楊的正常生長，又使植株獲得了比較好的耐鹽堿能力。

通過對兩次優(yōu)良株系的選擇結(jié)果進(jìn)行對比可以發(fā)現(xiàn)，2017年和2008年所選擇出的優(yōu)良株系一致，且兩次調(diào)查中，各株系的生長表現(xiàn)排序完全相同。說明小黑楊作為速生樹種，在造林試驗(yàn)的初期就可以獲得準(zhǔn)確可靠的選擇結(jié)果。