焦亞冰，高志鵬，王容

（南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京210037）

葉片是植物進(jìn)行光合作用、蒸騰作用和維持自身系統(tǒng)平衡的重要器官。葉片性狀是植物功能性狀中一個(gè)重要的部分，關(guān)系著植物生物量的積累及對(duì)外界資源的獲取和利用。氣孔性狀是葉片結(jié)構(gòu)性狀之一，而葉片結(jié)構(gòu)性狀在很大程度上影響植物的光合生理，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)狀況。有研究顯示，氣孔保證了植物在不斷更新變換的的環(huán)境中持有一定的含水量。近年來，許多學(xué)者通過對(duì)氣孔性狀特征的研究發(fā)現(xiàn)，氣孔在古植物學(xué)、地質(zhì)學(xué)和法庭科學(xué)物證鑒定等方面都具有重大的研究?jī)r(jià)值。因此，植物葉片氣孔觀察方法的研究對(duì)于深入了解氣孔性狀是一項(xiàng)重要的工作。

植物葉片氣孔的觀察方法主要包括：撕取法、刮制法、印跡法、離析法和電鏡掃描法五種。采用撕取法、刮制法、印跡法和電鏡掃描法等方法觀察氣孔，會(huì)存在不同程度的效率低下、程序復(fù)雜繁瑣、觀察儀器設(shè)備要求高或操作難度大等問題。而離析法的主要原理是利用化學(xué)試劑把細(xì)胞與細(xì)胞間的中層物質(zhì)溶解，使細(xì)胞分離，從而研究細(xì)胞的立體形態(tài)結(jié)構(gòu)。選用離析法觀察，制片容易、成功率高、表皮上無殘留葉肉，觀察到的氣孔形態(tài)真實(shí)清晰。

本文以闊瓣含笑（

Michelia cavaleriei

var.

platypetala

）、含 笑（

Michelia figo

）、金 葉 含 笑（

Michelia foveolata

）和深山含笑（

Michelia maudiae

）為試驗(yàn)材料，詳細(xì)介紹了使用離析法觀察含笑屬植物葉片氣孔的試驗(yàn)操作步驟，以期為科研人員進(jìn)行氣孔觀察和研究提供具體的方法指導(dǎo)。

1 材料與用具

1.1 植物材料

植物材料為含笑屬闊瓣含笑、含笑、金葉含笑和深山含笑葉片。

1.2 試驗(yàn)用具

生物顯微鏡（Leica DM 2500，徠卡顯微系統(tǒng)上海有限公司，中國(guó)上海）、標(biāo)準(zhǔn)級(jí)顯微鏡載玻片（45°角，拋光邊，單頭單面蒙砂，25 mm×75 mm，1～1.2 mm）、免洗蓋玻片（24 mm×60 mm，0.13～0.16 mm，世泰)、燒杯（250 mL，直徑70 mm；10 mL，直徑26 mm）、廣口瓶（1 000 mL，直徑219 mm)、鑷子、短粗玻璃刻度吸管（10 mL）、塑料滴管（3 mL）、剪刀、培養(yǎng)皿（直徑75 mm，高度15 mm）、吸水紙、保鮮膜、一次性口罩、一次性乳膠手套、烘箱（XMTD-8222，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，中國(guó)上海）、高枝剪（ARS 180ZR-3.0-5，日本ARS產(chǎn)品專賣店，中國(guó)上海）、自封袋（PE塑料，28 cm×20 cm）。

1.3 試驗(yàn)藥品

甲醛（廣東光華科技股份有限公司，廣東金華）、冰醋酸（上海申博化工有限公司，中國(guó)上海）、硝酸（南京化學(xué)試劑有限公司，江蘇南京）、三氧化鉻（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)上海）、番紅溶液、無水乙醇。

2 試驗(yàn)溶液配制

70%F.A.A.固定液（配方：甲醛5 mL+冰醋酸5 mL+70%乙醇90 mL)

10%鉻酸液（配方：10 g三氧化鉻+100 mL蒸餾水）

硝酸—鉻酸離析液（配方：10%硝酸液和10%鉻酸液等比例混合配制）

1%番紅溶液（配方：番紅1 g+100 mL蒸餾水）

3 試驗(yàn)操作步驟

3.1 材料采集

2020年9月4日在南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)（118°80′E，32°08′N）闊瓣含笑、含笑、金葉含笑和深山含笑成熟林分中各選取1株，利用高枝剪在樹冠中層外圍東、南、西、北四個(gè)方向采摘葉片25片（一般選用植株上有代表性、健康無蟲害、新鮮完好的葉片），每株100片，采集的葉片用自封袋封裝。如果取材距離較遠(yuǎn)，可將葉子放在濕報(bào)紙里保存帶回。

將采摘的4種含笑屬植物葉片分別清洗干凈，用吸水紙拭去葉片上的水，使葉片保持干凈整潔平整，剪去葉柄，保留葉片中間1/3部分。剪裁葉片時(shí)用力均勻，避免組織破裂。

3.2 固定

將預(yù)處理過的干凈葉片放入有F.A.A.固定液的廣口瓶中靜置48 h，固定液要完全浸沒葉片。一般固定液的用量要達(dá)到葉片體積的20倍以上，否則葉片中的水分會(huì)稀釋固定液的濃度，從而影響葉片材料的固定效果，無法達(dá)到試驗(yàn)預(yù)期效果。

3.3 沖洗

48 h后，先用鑷子取出固定后的葉片，再用蒸餾水沖洗干凈。沖洗的主要作用是讓蒸餾水滲透到葉片中，徹底把固定液替換出來。

3.4 解離

選取要觀察的部位，將清洗干凈的葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的片狀，放入10 mL的燒杯中，倒入硝酸—鉻酸離析液（注意離析液需浸沒葉片），再用保鮮膜將燒杯口密封，放入烘箱在60℃條件下離析，葉片的離析程度以鑷子輕輕夾即完全散開為宜。闊瓣含笑、含笑、金葉含笑和深山含笑的離析時(shí)長(zhǎng)分別為1 h、0.5 h、2 h和1.5 h。

3.5 再次沖洗

取出離析好的葉片，再用蒸餾水多次反復(fù)沖洗，直至沒有任何顏色為止。

3.6 染色

將葉片放入有番紅溶液的培養(yǎng)皿中染色30 s，用鑷子取出放入蒸餾水中清洗。

需要注意的是，配制好的番紅溶液會(huì)有一些不溶解的雜質(zhì)和顆粒，使用前需經(jīng)過仔細(xì)過濾；放置時(shí)間過長(zhǎng)的番紅溶液會(huì)產(chǎn)生沉淀，使用前也需仔細(xì)過濾。

3.7 制片

將載玻片和蓋玻片擦凈，用滴管將水滴在載玻片的中央，再用鑷子將染色后的葉片放于載玻片的水滴上，葉片表皮要鋪平且完全展開。隨后用鑷子夾住蓋玻片，使蓋玻片邊緣與材料左邊水滴的邊緣接觸，向下放平蓋玻片，用吸水紙拭去邊緣的水珠。注意，加蓋玻片時(shí)盡量避免產(chǎn)生氣泡，如果出現(xiàn)氣泡，需重新制作切片或者從蓋玻片的一側(cè)滴清水將氣泡驅(qū)走。

3.8 鏡檢

首先，移動(dòng)旋轉(zhuǎn)器使低倍鏡對(duì)準(zhǔn)載物臺(tái)的通光孔；其次，將制成的臨時(shí)裝片放在載物臺(tái)上，用彈簧推片夾夾??；第三，觀察時(shí)先用低倍鏡觀察找到物象，再用高倍鏡進(jìn)行觀察。

低倍鏡使用說明：先轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，使載物臺(tái)緩慢上升或下降，在增大工作距離過程中來調(diào)節(jié)焦距、尋找物象；再使用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋將葉片表皮的物象調(diào)至清晰為止，即可進(jìn)行氣孔特征的觀察。

高倍鏡使用說明：先在低倍鏡下把需要進(jìn)一步觀察的部位調(diào)到中心，同時(shí)把物象調(diào)節(jié)到最清晰的程度以后，再轉(zhuǎn)換到高倍鏡下觀察。在轉(zhuǎn)換鏡頭至高倍鏡時(shí)，需要觀察鏡頭工作距離，如果過小，可能壓碎玻片或損壞鏡頭，可提前順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋使載物臺(tái)下降。

3.9 拍照

使用連接生物顯微鏡的電腦上的LAS X.lnx軟件（Win7操作系統(tǒng)）進(jìn)行拍攝保存（見圖1）。

圖14 種含笑屬植物葉片上下表皮氣孔結(jié)構(gòu)的示例（10×）（1 242μm×932μm）

4 結(jié)論與討論

（1）離析法主要是使用化學(xué)試劑將葉片上下表皮分離成透明狀態(tài)，采用F.A.A.固定液可以保存氣孔形態(tài)的完整性。離析法觀察到的含笑屬的氣孔形態(tài)清晰，便于統(tǒng)計(jì)氣孔數(shù)目、氣孔開度、氣孔長(zhǎng)寬和氣孔密度等指標(biāo)。而且離析法不僅適用于葉片氣孔觀察，還可適用于導(dǎo)管篩管、葉脈脈序和表皮結(jié)構(gòu)等形態(tài)特征觀察。

（2）如圖1所示，含笑屬植物的氣孔器是由兩個(gè)腎形的保衛(wèi)細(xì)胞和孔道組成的，形態(tài)呈橢圓形，分散在表皮細(xì)胞之間，無明顯規(guī)律分布。含笑屬植物葉片下表皮分布圖中，葉脈存在的地方是沒有氣孔的存在。試驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)含笑和金葉含笑單位面積上氣孔數(shù)目遠(yuǎn)不如闊瓣含笑和深山含笑數(shù)目多，這可能與它們的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。Peat等1994年的研究表明，氣孔的分布和密度可能受遮陰環(huán)境、葉面積大小、葉輪廓、葉片是否有毛、葉片角度和其他生態(tài)條件（如海拔）等因素的影響。

（3）在自然界中，不同植物的氣孔數(shù)目和分布是不同的，有些植物的氣孔全分布在上表皮或下表皮，也有些植物上下表皮都有氣孔的分布或都沒有氣孔的分布。大多植物的葉片氣孔分布是下表皮多于上表皮的，特別有些木本植物，只在下表皮才有氣孔的分布。在闊瓣含笑、深山含笑、含笑和金葉含笑4種含笑屬植物葉片上表皮沒有氣孔的存在，氣孔只分布于下表皮，這是為了葉片可以更好進(jìn)行光合作用和蒸騰作用。因此，在進(jìn)行含笑屬植物葉片氣孔性狀研究時(shí)，可直接選取下表皮氣孔作為分析研究的對(duì)象。

（4）使用離析法的關(guān)鍵是使葉片表皮變透明，這也是為什么不同的材料要考慮不同的離析時(shí)長(zhǎng)。根據(jù)包淑云等研究結(jié)果可知，闊瓣含笑、深山含笑、含笑和金葉含笑的葉片厚度、角質(zhì)層厚度、柵欄組織厚度和海綿組織的厚度有明顯的不同。其中，葉片厚度從大到小順序依次為：金葉含笑、深山含笑、含笑、闊瓣含笑；角質(zhì)層厚度從大到小順序依次為：金葉含笑、闊瓣含笑、深山含笑、含笑；柵欄組織厚度/海綿組織厚度比從大到小順序依次為：闊瓣含笑、深山含笑、金葉含笑、含笑。因此，4種試驗(yàn)材料的離析時(shí)間不同。

（致謝：本文在寫作過程中受到南京林業(yè)大學(xué)竹類研究所副教授時(shí)培建老師的學(xué)術(shù)指導(dǎo)，特此表示感謝?。?/p>