王世強(qiáng) 胥祉涵 王少堃 王一杰 王國軍

1 湖南工業(yè)大學(xué)體育學(xué)院（湖南株洲412000）

2 體質(zhì)健康和運(yùn)動(dòng)健身湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖南株洲412000）

國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）最新發(fā)布的全球糖尿病地圖（第9版）顯示，全球糖尿病患病人數(shù)不斷上升，每11個(gè)人中就有1 個(gè)糖尿病患者。預(yù)計(jì)到2030年，糖尿病患者會(huì)達(dá)到5.8 億[1]。糖尿病是一種代謝障礙性疾病，常引起腦、眼、足、腎和心等多個(gè)部位的并發(fā)癥。糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是指發(fā)生于糖尿病患者，不能用高血壓性心臟病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病及其他心臟病變來解釋的心肌疾病，可引發(fā)心肌廣泛灶性壞死，出現(xiàn)亞臨床的心功能異常，最終進(jìn)展為心力衰竭、心律失常及心源性休克，重癥患者甚至猝死[2]。研究表明，在DCM進(jìn)展過程中，自噬標(biāo)記蛋白Beclin1和LC3（light chain 3）表達(dá)下降，Atg7（recom?binant autophagy related protein 7）和Atg12-Atg15 蛋白表達(dá)減少，P62（ protein 62）表達(dá)增加，細(xì)胞自噬體的形成和降解均受到抑制，心肌自噬流減弱，受損的細(xì)胞器累積在心肌組織無法得到清除，最終導(dǎo)致心功能障礙[3]。經(jīng)過二甲雙胍和雷帕霉素等方式進(jìn)行處理后，心肌細(xì)胞自噬能力增強(qiáng)，心肌受損的程度降低，心臟功能得以改善[4，5]。這些結(jié)果提示，由高糖導(dǎo)致的心肌自噬抑制可能是DCM發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，通過一定的手段提高糖尿病患者心肌的自噬能力，對(duì)預(yù)防和改善DCM的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)能夠增強(qiáng)心肌抗氧化能力，減輕心肌纖維化，抑制糖尿病誘導(dǎo)的病理性心肌重塑，改善心臟舒縮功能[6，7]。然而，其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。研究證實(shí)，在正常狀態(tài)下，中等強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)能上調(diào)Beclin1 和LC3 的表達(dá)，增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值，有利于心肌能力代謝和收縮功能的提高[8，9]。在病理狀態(tài)下，有氧運(yùn)動(dòng)能夠通過增強(qiáng)自發(fā)性高血壓[10]、心力衰竭[11]和心肌梗死[4]等動(dòng)物模型心肌基礎(chǔ)自噬水平，重建心肌自噬通量，改善心肌功能，抑制病理性心臟重塑。然而，運(yùn)動(dòng)是否能夠通過改變心肌細(xì)胞自噬水平進(jìn)而發(fā)揮運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病心肌的保護(hù)效應(yīng)，進(jìn)而改善心功能，尚未見相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究通過高脂飲食和腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ）建立2 型糖尿病大鼠模型，觀察運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠心肌自噬標(biāo)記蛋白Beclin1、LC3和P62 mRNA和蛋白的影響，為運(yùn)動(dòng)保護(hù)心臟改善DCM 心功能提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD 大鼠（40 只），體重296 ± 8 g，8 周齡，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)為SCXK（京）2012-001，室溫22℃± 2℃，光照時(shí)間12個(gè)小時(shí)，空氣濕度40%～50%。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC 組，n=8 只）和糖尿病建模組（n=32只），其中正常對(duì)照組喂養(yǎng)普通飼料，糖尿病建模組喂養(yǎng)高脂飼料（基礎(chǔ)飼料添加28%蔗糖、20%煉豬油、l%膽固醇和0.25%膽酸鹽等混合形成，總熱能20 kJ/g）。

1.2 糖尿病大鼠模型的建立及驗(yàn)證

參照Reed 等[12]的方法建立2 型糖尿病大鼠模型。糖尿病建模組大鼠持續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)4 周后，大鼠建模前禁食12 小時(shí)，將鏈脲佐菌素（STZ）與0.1 mol/L pH4.2的檸檬酸緩沖液互溶，濃度為2%，按30 mg/kg體重一次性腹腔注射，正常對(duì)照組（NC組）腹腔一次性注射等體積的0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液。72 小時(shí)后隨機(jī)時(shí)間尾靜脈采血，根據(jù)檢測的隨機(jī)血糖判定建模是否成功，隨機(jī)血糖大于11.1 mmol/L 為建模成功判定標(biāo)準(zhǔn)，剔除血糖不達(dá)標(biāo)的大鼠，1周后復(fù)查暫時(shí)成模大鼠，共有28只大鼠建模成功。

從建模成功的28 只大鼠中隨機(jī)挑選其中的8 只，以及對(duì)照組的8只大鼠，經(jīng)過禁食12小時(shí)，檢測其空腹靜脈血，靜置30分鐘，待血液凝固后分離取血清，用全自動(dòng)生化儀（日立7020，日本）測定空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），采用葡糖糖氧化酶法，試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。ELISA 檢測空腹血漿胰島素（fasting plasma insulin，F(xiàn)INS），酶標(biāo)儀為美國LabsystemsDragan 公司W(wǎng)ellScan MK3，試劑盒購于南京建成生物公司。根據(jù)公式計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（in?sulin sensitivity index，ISI）和胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistance，HOMA-IR），公式為ISI=－log（FPG×FINS）、HOMA-IR=（FPG×FINS）/22.5[13]。如果ISI 顯著低于對(duì)照組，而HOMA-IR 高于對(duì)照組，說明大鼠出現(xiàn)了胰島素敏感性下降的現(xiàn)象，所建的動(dòng)物模型符合2 型糖尿病的特征，則能進(jìn)一步驗(yàn)證所建模型是否成功。將建模成功的大鼠隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組（T2DM）和糖尿病運(yùn)動(dòng)組（T2DME），各14只。

1.3 運(yùn)動(dòng)方案

適應(yīng)性訓(xùn)練1 周（10 m/min，15 min/day）后，糖尿病運(yùn)動(dòng)組給予8 周中等強(qiáng)度有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，采用Bed?ford訓(xùn)練方案，速度為15.2 m/min，坡度為3°（運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度相當(dāng)于58.4% ± 1.7%VO2max負(fù)荷）[14]。每次運(yùn)動(dòng)60 min，每周5天（周一和周四不進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)）。

1.4 超聲心動(dòng)圖（ultrasonic cardiogram graph，UCG）測定

末次運(yùn)動(dòng)后12小時(shí)，按照NC組、T2DM 組 和T2DME 組每組1 只的先后順序，進(jìn)行麻醉和超聲心動(dòng)測試。腹腔注射10%水合氯醛（40 mg/100 g 體重）麻醉后仰臥位固定，胸部去毛，小動(dòng)物超聲探頭置于大鼠左前胸，連接超聲檢查儀（加拿大ULTRASONIX 公司，SXTCH2.0）進(jìn)行超聲檢查測量左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular internal dimension diastole，LVIDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular internal diameter at endsystole，LVIDs）、左室后壁舒張末期厚度（left ventricu?lar posterior wall at end-diastole，LVPWd）、左室后壁收縮末期厚度（left ventricular posterior wall at endsystole，LVPWs）等心臟結(jié)構(gòu)指標(biāo)和短軸縮短率（frac?tional shortening，F(xiàn)S）、射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）心臟功能指標(biāo)。

1.5 取材

實(shí)驗(yàn)過程中，糖尿病對(duì)照組和糖尿病運(yùn)動(dòng)組共有11只大鼠相繼死亡，至8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)結(jié)束時(shí)，糖尿病組大鼠余8只，糖尿病運(yùn)動(dòng)組大鼠余9只。末次運(yùn)動(dòng)結(jié)束12小時(shí)后麻醉后測量大鼠體重，腹腔靜脈取血（用于血糖檢測），隨后摘取心臟，吸干血液后進(jìn)行稱重，并計(jì)算心臟重量指數(shù)（心臟重量*1000/體重）。然后分離左心室，立即置于液氮中速凍，存入－80℃冰箱保存，以備PCR和WB檢測。

1.6 RT-PCR

采用Trizol 法（購于美國Technologies）提取總RNA，每個(gè)樣本按照2 μg RNA 作為初始模板，配置20 μl 的總反應(yīng)體系，應(yīng)用cDNA 合成試劑盒（RR370A，購于TaKaRa 公司）在核酸擴(kuò)增儀（Gene Amp PCR System 9700，美國ABI 公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為：37℃，15 min；85℃5 s；4℃保持。以合成的cDNA 作為模板，以β-actin 作為內(nèi)參，配置20 μl 反應(yīng)體系，每個(gè)樣本檢測3 個(gè)復(fù)孔，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)（7300，美國ABI）進(jìn)行擴(kuò)增熒光定量，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃，30 s；PCR反應(yīng)95℃，5 s；60℃，31 s；40 個(gè)循環(huán)。熒光定量試劑盒為TaKaRa 公司的RR820A。根據(jù)收集的數(shù)據(jù)通過2－△△CT公式計(jì)算樣本中mRNA的相對(duì)含量，其中△△CT =（CT實(shí)驗(yàn)組目的基因－CT 實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因）－（CT 對(duì)照組目的基因－CT 對(duì)照組內(nèi)參基因）。 實(shí)驗(yàn)所需引物由上海生工生物合成。

表1 Real-time PCR基因引物序列

1.6 Western Blotting

提取總蛋白后用BCA 法測定并調(diào)整蛋白濃度一致，加入上樣緩沖液在干式恒溫儀內(nèi)使蛋白變性。120 V 恒壓SDS-PAGE 電泳1小時(shí)后，70 mv 恒壓轉(zhuǎn)膜70 分鐘。5%脫脂奶粉封閉1 小時(shí)，孵育兔源一抗（Be?clin1、P62、LC3稀釋比例均為1︰1000；GAPDH 稀釋比例為1︰10000）置于搖床4℃過夜。洗膜緩沖液洗滌3次后，加HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗（稀釋比例為1︰5000），室溫?fù)u床孵育1 h。洗膜緩沖液洗膜3次，滴加ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，室溫2 min，濾紙吸干后置于保鮮膜內(nèi)封存，在蛋白成像儀（CD touch，美國伯樂）中成像，條帶用Imag Lab軟件進(jìn)行圖像分析。內(nèi)參為GAP?DH，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的積分光密度（IOD）。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)用GraghPad Prism 6.0 軟件轉(zhuǎn)換作圖。數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行分析處理，采用單因素方差分析組間差異，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病大鼠模型的建立及驗(yàn)證

結(jié)果顯示，T2DM 組大鼠FBG 和FINS 均顯著高于NC 組，ISI 顯著低于NC 組，HOMA-IR 高于NC 組。結(jié)果表明，T2DM 組大鼠出現(xiàn)了胰島素敏感性下降的現(xiàn)象，所建的動(dòng)物模型符合2型糖尿病的特征。

表2 大鼠FBG、FINS、ISI和HOMA-IR的變化

2.2 大鼠體重、心臟重量和血糖的變化

如表3 所示，與NC 組相比，T2DM 組和T2DME 組大鼠體重均降低，具有顯著性差異（P<0.05），T2DME組與T2DM 組相比，體重增加，無明顯差異。與NC 組相比，T2DM 組和T2DME 組大鼠心臟重量指數(shù)顯著增加（P<0.05），與T2DM組相比，T2DME組心臟重量指數(shù)顯著降低（P<0.05）。與NC組相比，T2DM組和T2DME組血糖含量均顯著性增加（P<0.05）。與T2DM 組相比，T2DME組大鼠血糖顯著性降低（P<0.05）。

表3 大鼠體重、心臟重量及血糖的變化

2.3 大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化

如表4所示，與NC組相比，T2DM組大鼠LVIDd和LVIDs 均顯著性增加（P<0.01），LVPWd 和LVPWs 無明顯變化。與T2DM 組相比，T2DME 組LVIDs 顯著性降低（P<0.05）。與NC 組相比，T2DM 組大鼠FS 和EF 均顯著性下降（P<0.05 和P<0.01）。與T2DM 組相比，T2DME組FS和EF顯著性升高（P<0.05）。

表4 大鼠左心室結(jié)構(gòu)和功能變化

2.4 大鼠心肌自噬相關(guān)因子mRNA表達(dá)變化

結(jié)果顯示，與NC 組相比，T2DM 組Beclin1 mRNA的表達(dá)顯著降低（P<0.05），P62 mRNA 的表達(dá)顯著增加（P<0.05），LC3 mRNA 的表達(dá)無明顯變化；與T2DM組相比，T2DME 組Beclin1 mRNA 和LC3 mRNA 的表達(dá)顯著增加（P<0.01），P62 mRNA的表達(dá)顯著減少（P<0.01）。見圖1。

圖1 心肌自噬相關(guān)因子mRNA的表達(dá)

2.5 糖尿病大鼠心肌自噬相關(guān)蛋白表達(dá)變化

與NC 組相比，T2DM 組Beclin1 和P62 蛋白無明顯變化；與T2DM 組相比，T2DME 組Beclin1 蛋白顯著增加（P<0.05），P62 蛋白顯著降低（P<0.05）。與NC 組相比，T2DM組LC3-Ⅰ蛋白無明顯變化，LC3-Ⅱ蛋白顯著降低（P<0.05），T2DME 組LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白均顯著增加（P<0.05，P<0.01）；與T2DM 組相比，T2DME 組LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白均顯著增加（P<0.01）。與NC組相比，T2DM 組LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ顯著降低（P<0.05），T2DME 組LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ顯著升高（P<0.05）；與T2DM 組相比，T2DME 組LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ顯著升高（P<0.01）。見圖2。

3 討論

3.1 糖尿病導(dǎo)致大鼠心肌功能降低和自噬水平降低

糖尿病會(huì)帶來一系列并發(fā)癥，約一半以上的糖尿病患者死于糖尿病心血管病并發(fā)癥，其中，DCM的危險(xiǎn)因素占首位，嚴(yán)重者可發(fā)生心衰而死亡。目前，DCM的發(fā)生機(jī)制尚未被完全闡明。隨著對(duì)自噬研究的逐漸深入，自噬被認(rèn)為可能在DCM 發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。Xie 等研究發(fā)現(xiàn)，STZ 誘導(dǎo)的1 型糖尿病小鼠心肌自噬程度降低，LC3-Ⅱ的表達(dá)顯著降低，左心室功能下降[15]。Feidantsis等的研究顯示，糖尿病大鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞凋亡增加，心肌收縮功能降低。AMPK 的激活有助于增強(qiáng)糖尿病大鼠心肌自噬，進(jìn)而增強(qiáng)心臟功能[16]。與此一致，Xiao 等研究也顯示，糖尿病小鼠心肌Beclin1表達(dá)顯著減少，P62的表達(dá)顯著增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值顯著降低，心肌自噬被抑制，心臟功能降低，并伴隨心肌炎癥反應(yīng)，細(xì)胞凋亡增加和氧化應(yīng)激加劇，發(fā)生病理性心肌重塑[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食和STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌Be?clin1表達(dá)降低，LC3-Ⅱ和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值也顯著減少，而P62的表達(dá)則顯著增加，同時(shí)伴隨大鼠左心室短軸縮短率和射血分?jǐn)?shù)的顯著下降。研究提示，細(xì)胞自噬能力的降低可能是糖尿病大鼠左心室心肌功能減退的原因。這可能是由于高血糖抑制心肌細(xì)胞自噬，心肌細(xì)胞自噬能力的下降導(dǎo)致有細(xì)胞毒性的蛋白質(zhì)集聚體和功能失調(diào)的細(xì)胞器的積累，進(jìn)而造成細(xì)胞凋亡的增加和心肌細(xì)胞丟失，最終使心肌收縮功能受損[18]。

圖2 心肌自噬相關(guān)因子蛋白的表達(dá)

然而，也有研究認(rèn)為糖尿病心肌自噬增強(qiáng)。如Mu?nasinghe 等通過冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)收集了2 型糖尿病患者的左心耳，電鏡觀察顯示，心肌自噬體數(shù)量增加。蛋白分析結(jié)果顯示，Beclin-1表達(dá)增加，P62表達(dá)減少，提示糖尿病患者心肌自噬活性增加[19]。然而，自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，僅僅通過Beclin-1、LC3 等的表達(dá)或自噬體的數(shù)量并不代表整個(gè)自噬過程。Xu 等觀察了糖尿病小鼠的心肌自噬流，發(fā)現(xiàn)雖然心肌中自噬體數(shù)量增加，但自噬溶酶體缺乏，表明糖尿病小鼠心肌自噬降解受阻，自噬流受損。因此，關(guān)于2型糖尿病與心肌自噬的關(guān)系，尚未十分明確。未來需要加強(qiáng)基于自噬流的糖尿病心肌與自噬關(guān)系的相關(guān)研究[20]。

3.2 有氧運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)大鼠心肌自噬能力和心臟功能

運(yùn)動(dòng)作為一種健康干預(yù)手段，對(duì)糖尿病心肌病的治療具有重要作用。運(yùn)動(dòng)可通過減少細(xì)胞死亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，降低心肌炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善糖尿病心肌病。前期，我們研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)通過TGF-β1（transform?ing growth factor-β）/Smad 信號(hào)通路，降低了MMP-2

（matrix metalloproteinase 2）、CTGF（connective tissue growth factor）等纖維化標(biāo)志物的表達(dá)，改善了糖尿病心肌纖維化，同時(shí)抑制了糖尿病氧化應(yīng)激，這佐證了運(yùn)動(dòng)可以作為治療糖尿病心肌病的有效方式[6]。鑒于運(yùn)動(dòng)的顯著療效，在《中國慢性疾病防治基層醫(yī)生診療手冊(cè)》中，列出了詳細(xì)的運(yùn)動(dòng)治療方案[21]。然而，運(yùn)動(dòng)改善糖尿病心肌病的機(jī)制尚未完全闡釋，自噬為此提供了新的視角。

研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注動(dòng)物模型心肌自噬能力降低，運(yùn)動(dòng)可減輕缺血再灌注造成的心肌損傷，自噬可能是運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生心肌保護(hù)效應(yīng)的重要潛在機(jī)制[22]。Li 等研究也發(fā)現(xiàn)，在運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)的早期和晚期階段，心肌細(xì)胞自噬均可被激活，其可能部分參與調(diào)節(jié)了運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心肌保護(hù)效應(yīng)，是對(duì)抗力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心肌損傷的重要保護(hù)機(jī)制[4，23]。Yan通過敲除小鼠心肌自噬相關(guān)基因Atg7 限制心肌自噬能力后發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)不僅未能改善高脂膳食導(dǎo)致的心肌病變，反而加重了由此引發(fā)的心肌纖維化，線粒體生物發(fā)生受損。該研究表明細(xì)胞自噬是運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生心肌保護(hù)效應(yīng)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制[24]。與以上研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)顯著促進(jìn)了糖尿病大鼠心肌Beclin1 的表達(dá)，抑制了P62 蛋白表達(dá)，LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白顯著增加，LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ比值顯著升高，提示運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)了糖尿病大鼠心肌自噬能力，其可能是運(yùn)動(dòng)改善糖尿病大鼠心臟功能的重要分子機(jī)制。本研究從自噬的角度探討了運(yùn)動(dòng)改善2型糖尿病的分子機(jī)制，未來將進(jìn)一步深入研究運(yùn)動(dòng)激活糖尿病心肌自噬的關(guān)鍵信號(hào)通路。

4 結(jié)論

糖尿病大鼠心肌功能下降，可能與心肌自噬水平降低有關(guān)。有氧運(yùn)動(dòng)可能通過增強(qiáng)心肌自噬能力，進(jìn)而改善糖尿病大鼠心肌功能。