陳瑩 陳錫 王茜 王小利

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 貴州省草業(yè)研究所，貴陽 550006）

高羊茅（Festuca arundinacea）是禾本科多年生地被植物，可作為觀賞性草坪草，也可作為牧草飼養(yǎng)牲畜，作為我國主要草品種之一，在草坪建植與水土保持方面發(fā)揮著巨大的作用。干旱、鹽、高溫或低溫、重金屬和氧化脅迫等非生物脅迫嚴(yán)重影響了它的生長與發(fā)育，期間涉及多種復(fù)雜機制，通過激活應(yīng)激反應(yīng)基因?qū)⑼獠啃盘栟D(zhuǎn)化為下游效應(yīng)因子，稱之為受體對信號的感知。效應(yīng)蛋白介導(dǎo)植物一些形態(tài)和生理的改變，幫助植物更好地適應(yīng)脅迫條件。在多種生物中被發(fā)現(xiàn)。在擬南芥中，已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)許多應(yīng)激反應(yīng)基因家族，逆境脅迫蛋白（Universal stress protein，USP）家族是其中之一。

逆境脅迫蛋白USP 又稱應(yīng)激蛋白，普遍存在于細(xì)菌和植物的細(xì)胞質(zhì)中，通常由111-167 個氨基酸殘基組成。逆境脅迫蛋白基因UspA 超家族最初是在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的［1］，在多重應(yīng)激條件和營養(yǎng)缺乏等逆境條件下，其表達(dá)急劇增加，在非生物應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮積極作用。USP 的結(jié)構(gòu)域?qū)儆谑杷鞍?，在USP 肽鏈上有8 個磷酸化位點，具有應(yīng)激性，并作用于蘇氨酸與絲氨酸的蛋白磷酸化。一些USP 蛋白具有使DNA 結(jié)合、修復(fù)和重新折疊的功能，可以支持生物體保護其核酸免受外部壓力，有的USP 蛋白可以與ATP 結(jié)合，可能會參與激素的合成、產(chǎn)物代謝、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)龋?］。植物USP 蛋白中發(fā)現(xiàn)的催化修飾物包括絲氨酸/蘇氨酸激酶、酪氨酸激酶、U-box、SWI2/snf2、Mudr（SWIM）-鋅指結(jié)構(gòu)、HDzip、陽離子交換器與IKI3。植物USP 的催化修飾物可能是在不同脅迫下選擇性的演化過程中產(chǎn)生，導(dǎo)致了不同催化修飾物與USP 域的融合，這個過程為植物提供了多種調(diào)控方式來保護它們免受外來脅迫的傷害。前人已在很多高等植物中發(fā)現(xiàn)USP基因，David 等［3］在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了44 個USP 相似的蛋白，系統(tǒng)發(fā)育樹分析將其分為2 種類型，一種包含ATP 結(jié)合位點；另一種不包含ATP 結(jié)合位點。MsUspA 可能參與調(diào)控激素和次生代謝物合成以提高蘋果的抗旱性［4］。在亞洲棉中，Maqbool 等［5］成功克隆出USP1與USP2發(fā)現(xiàn)，其在干旱脅迫下表達(dá)量更高，推測USP基因能在干旱脅迫下對亞洲棉起到保護作用。Jung 等［6］研究表明AtUsp啟動子能被非生物誘導(dǎo)性脅迫與植物激素高度誘導(dǎo)，并產(chǎn)生多種脅迫的抗逆性。過表達(dá)AtUsp植株表現(xiàn)出較強的耐熱和抗氧化性［7］。之后陸續(xù)在大豆［8］、黃檗［9］、擬南芥［10］、紫云英［11］中發(fā)現(xiàn)USP基因，該基因編碼的蛋白幾乎參與所有的逆境脅迫，因此吸引了大量國內(nèi)外學(xué)者對其功能進(jìn)行深度研究。高羊茅中有關(guān)USP基因的抗旱性研究仍鮮見報道。

本研究通過cDNA 末端快速擴增技術(shù)獲得高羊茅逆境脅迫蛋白基因FaUSP全長，利用生物信息學(xué)技術(shù)，分析FaUSP的結(jié)構(gòu)與其他物種USP 的同源性。利用RT-PCR 技術(shù)研究FaUSP在不同非生物脅迫條件下的表達(dá)情況。將FaUSP在菊苣中過量表達(dá)，研究在干旱脅迫下過量表達(dá)FaUSP對菊苣生理特性的響應(yīng)，探索USP基因家族的抗逆功能和機理，旨為制備具有抗旱性和高產(chǎn)性的優(yōu)良品種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用的高羊茅黔草1 號是2005 年由貴州省草業(yè)研究所育成的國家牧草新品種（登記號：299）。

1.2 方法

1.2.1 材料的處理 選取飽滿的高羊茅種子，播種于花盆中，置于溫度為（23±2）℃、光照12 h/黑暗12 h、濕度是70%的光照培養(yǎng)箱中，定期澆水。待生長一段后進(jìn)行高溫、干旱、高鹽、低氮脅迫處理。

高溫脅迫：將發(fā)芽的植株移栽到土壤基質(zhì)中生長30 d，然后將高羊茅植株轉(zhuǎn)入42℃持續(xù)處理24 h，對照組的生長條件為23℃。

干旱處理：將生長14 d 的高羊茅幼苗放于30%的PEG 溶液中處理24 h，對照組為正常Hoagland 營養(yǎng)液。

高鹽處理：將生長14 d 的高羊茅幼苗分別放置于含有400 mmol/L NaCl 的Hoagland 營養(yǎng)液和正常Hoagland 營養(yǎng)液中處理24 h。

低氮處理：將生長30 d 幼苗分別轉(zhuǎn)移到Hoagland 營養(yǎng)液與無氮水培液中（營養(yǎng)液中NO3-被Cl-取代）進(jìn)行生長處理15 d。

按照取樣時間分別取0、0.5、1、2、6、12 和24 h 共7 個點，采集處理組與對照組高羊茅的葉片用液氮速凍，-80℃保存待用。

1.2.2 RNA 提 取 采 用TaKaRa RNAiso Reagent 試劑盒進(jìn)行高羊茅葉片的RNA 提取，參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄mRNA，以總mRNA 為模板合成第一鏈cDNA［12］。

1.2.3FaUSP的克隆 參考高羊茅轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中USP 相關(guān)基因片段，采用Primer Premier 5.0 設(shè)計PCR 擴增特異引物（表1）。采用5'RACE 試劑盒（Invitrogen）與3'RACE 試劑盒（Clontech）擴增獲得FaUSP的5'端與3'端，PCR 產(chǎn)物回收純化后送至上海生工公司測序。

1.2.4 實時熒光定量PCR 檢測 以反轉(zhuǎn)錄成的高羊茅cDNA 為模板，采用qRT-PCR 技術(shù)檢測高溫、低氮、干旱與高鹽逆境脅迫下高羊茅葉片中FaUSP的表達(dá)量，引物見表1。反應(yīng)體系為6 μL ddH2O、2 μL cDNA、1 μL 上游引物、1 μL 下游引物和10 μL 2×SYBR Premix Ex Taq，置于熒光定量PCR 儀上進(jìn)行反應(yīng)，95℃ 3 min；94℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 30 s，45 個循環(huán)，內(nèi)參基因為UBI（表1）。每個取樣點3個生物學(xué)重復(fù)，3 個技術(shù)重復(fù)。

表1 高羊茅FaUSP 克隆及熒光定量PCR 的引物序列

1.2.5 生物信息學(xué)分析 使用NCBI 網(wǎng)站搜索進(jìn)行Blast 比對，并分析編碼蛋白功能域（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），使用SOPMA 網(wǎng)站預(yù)測FaUSP 蛋白的基本性質(zhì)、二級結(jié)（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsaautomat.pl?page=npsa_sopma.html）。 使用MEGA6.0 軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性分析，構(gòu)建FaUSP 蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹；在ExPASY 網(wǎng)站分析FaUSP 蛋白的相對分子量、等電點及疏水性（http：//www.expasy.ch/tools/proscale.html）。

1.2.6 遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建與菊苣的遺傳轉(zhuǎn)化 參考李小冬等［13］方法構(gòu)建過量表達(dá)載體及菊苣的遺傳轉(zhuǎn)化，USP基因為逆境脅迫基因，能被多種逆境脅迫誘導(dǎo)，為了進(jìn)一步研究USP基因的功能，將準(zhǔn)備好的菊苣外植體與含有目標(biāo)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌放入無菌培養(yǎng)皿中浸染，使農(nóng)桿菌與外植體充分接觸，將侵染好的外植體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，放入人工氣候室培養(yǎng)，溫度為24℃，用加100 mg/mL 頭孢霉素的無菌水清洗外植體3 次，直至長出愈傷組織，每星期繼代一次，待長出根系移植到培養(yǎng)基質(zhì)中（泥炭土∶蛭石=1∶1），最后提取DNA 進(jìn)行陽性檢測。

1.2.7 干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因菊苣生理特性的響應(yīng) 提取菊苣RNA，采用熒光定量PCR 檢測野生型和轉(zhuǎn)基因植株中FaUSP的表達(dá)，引物參照表1。將野生型與轉(zhuǎn)基因的菊苣進(jìn)行干旱脅迫處理，在脅迫后的0、5 和10 d 時取樣進(jìn)行生理指標(biāo)測定。

2 結(jié)果

2.1 高羊茅FaUSP的克隆與核酸序列分析

以高羊茅cDNA 為模板，使用特異引物FU-fwd1與FU-rev1，擴增獲得一條長度為470 bp 條帶（圖1），回收、測序后獲得高羊茅FaUSP的核心片段。利用合成的3' RACE 與5' RACE 引物（表1）進(jìn)行PCR擴增，獲得3'端364 bp與5'端的315 bp的cDNA片段。利用DNAMAN 軟件將以上3 段序列進(jìn)行拼接，得到總長度為844 bp 的基因全長cDNA 序列（圖2），含501 bp 的開放閱讀框，共編碼166 個氨基酸，該基因包含70 bp 的5'端非編碼區(qū)和273 bp 3'端非編碼區(qū)，命名為FaUSP。

圖1 FaUSP 基因的RACE 擴增

圖2 FaUSP 核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列

保守結(jié)構(gòu)域分析表明，該基因編碼的蛋白屬于USP 家族。經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，F(xiàn)aUSP 蛋白與禾本科植物小麥、大麥、二穗短柄草、山羊草的USP 蛋白親緣關(guān)系較近，同源性均在70%以上（圖3）。

2.2 高羊茅FaUSP編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

利用SOPMA 軟件預(yù)測FaUSP 蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，F(xiàn)aUSP 蛋白結(jié)構(gòu)域主要由α-螺旋（39.76%）、延伸鏈（19.88%）、β-轉(zhuǎn)角（4.82%）和無規(guī)則卷曲（35.54%）組成。理化性質(zhì)分析表明，F(xiàn)aUSP編碼的蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量為18.06 kD，理論等電點為5.93，不穩(wěn)定系數(shù)為32.49，疏水性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)aUSP 蛋白疏水性最大值為2.067，最小值為-3.2，為親水蛋白。

圖3 植物USP 同源基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.3 在非生物脅迫下高羊茅逆境脅迫FaUSP的表達(dá)模式分析

采用實時熒光定量PCR 檢測高羊茅葉片中逆境脅迫FaUSP在高鹽、低氮、干旱與高溫脅迫處理下的時空特異性的表達(dá)規(guī)律（圖4），在高溫脅迫下，F(xiàn)aUSP的表達(dá)在脅迫處理0.5 h 后被誘導(dǎo)上升，處理6 h 達(dá)到峰值，在脅迫處理12 h 后受到抑制，然而與對照相比，在脅迫12-24 h 時FaUSP表達(dá)顯著降低；在干旱脅迫下，脅迫處理早期（0-1 h）FaUSP的表達(dá)與正常條件相當(dāng)，呈現(xiàn)下降趨勢，在脅迫6 h時，F(xiàn)aUSP的表達(dá)受到極顯著的誘導(dǎo)。在低氮脅迫下，與正常條件下相比，F(xiàn)aUSP的表達(dá)在脅迫處理0.5-2 h 時顯著降低，在脅迫6-24 h 后FaUSP表達(dá)被誘導(dǎo)顯著上升。在高鹽脅迫0-1 h 時FaUSP表達(dá)與對照相當(dāng)，在脅迫12-24 h，F(xiàn)aUSP表達(dá)顯著被誘導(dǎo)上升，在脅迫24 h 時表達(dá)量達(dá)到峰值，為對照組的3 倍，說明高羊茅FaUSP受干旱、高溫、氮脅迫及鹽脅迫的誘導(dǎo)，該基因可能與抗性相關(guān)。

2.4 FaUSP轉(zhuǎn)基因菊苣的表型與表達(dá)分析

野生型菊苣（WT）與轉(zhuǎn)基因菊苣（FaUSP超量表達(dá)）在相同的培養(yǎng)條件下呈現(xiàn)不同的表型（圖5），培養(yǎng)62 d 后，野生型菊苣處于抽穗期，而超表達(dá)FaUSP的菊苣呈現(xiàn)晚花表型。以野生型為對照，檢測5 株轉(zhuǎn)基因菊苣FaUSP表達(dá)量（圖6），與野生型相比，F(xiàn)aUSP的表達(dá)量顯著上調(diào)，升高了7-11 倍。

2.5 干旱脅迫對FaUSP轉(zhuǎn)基因菊苣生理特性的影響

轉(zhuǎn)基因與野生型的菊苣隨著干旱脅迫時間的延長，葉綠素含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢（圖7），干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因組和對照組的葉綠素含量相比差異不顯著。而轉(zhuǎn)基因組菊苣的可溶性蛋白含量隨干旱脅迫時間的延長呈上升的趨勢，在脅迫的第10 天達(dá)到峰值，顯著高于對照組。說明干旱脅迫能有效誘導(dǎo)菊苣的可溶性蛋白的合成，使其含量上升。

谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）作為植物體內(nèi)重要的抗氧化劑與自由基清除劑，保護機體不受逆境脅迫的傷害（圖7），隨著干旱脅迫時間的延長，轉(zhuǎn)基因與野生型的菊苣的GR 含量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，轉(zhuǎn)基因組在干旱脅迫下的GR含量顯著高于對照組，說明干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因組菊苣體內(nèi)GR 的合成能力顯著強于對照組。

抗氧化酶系統(tǒng)是植物遭受逆境脅迫重要的防御體系，超氧化物岐化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）與過氧化氫酶（CAT）是抗氧化酶系的主要組成部分。隨著干旱脅迫時間的延長，轉(zhuǎn)基因組與對照組的CAT 與POD 活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢，均在脅迫第5 天活性最高，轉(zhuǎn)基因組CAT 與POD 活性顯著高于對照組。轉(zhuǎn)基因組SOD 的活性隨著干旱脅迫時間的延長呈現(xiàn)升高趨勢，在脅迫10 d 達(dá)到了峰值，說明干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因組能夠使菊苣葉片抗氧化酶活性顯著升高。

圖4 非生物脅迫下FaUSP 基因在高羊茅中的轉(zhuǎn)錄水平

3 討論

逆境脅迫蛋白USP 是一個保守的蛋白家族，參與大量逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)。最早于大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)［1］。在高等植物中，USP 的發(fā)現(xiàn)起始于水稻。USP 蛋白一般存在于細(xì)胞質(zhì)中，是普遍存在于植物中的抗性相關(guān)蛋白，在植物受到外界脅迫時會受誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，增強植物的抗逆性［14-15］。趙莘等［16］發(fā)現(xiàn)抗病的中國野生華東葡萄株系在接種白粉病后VpUS表達(dá)量呈明顯的增加趨勢，表明VpUSP在與白粉病菌互作過程中具有表達(dá)活性等。本研究利用cDNA 末端快速擴增技術(shù)獲得高羊茅逆境脅迫蛋白FaUSP，序列全長844 bp，含501 bp 的開放閱讀框，共編碼166 個氨基酸。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，該基因編碼的蛋白屬于USP 家族。對其氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，高羊茅FaUSP 蛋白與禾本科植物小麥、大麥、二穗短柄草的USP 蛋白親緣關(guān)系較近，在進(jìn)化樹分析中高羊茅FaUSP 與禾本科植物的USP聚在一起。這可能是同為禾本科的植物，與其他同科植物的家族成員具有共同的保守區(qū)，而逆境脅迫蛋白FaUSP 在其他科屬中存在著分化。

圖5 轉(zhuǎn)基因菊苣的表型

圖6 轉(zhuǎn)基因菊苣FaUSP 的表達(dá)分析

圖7 轉(zhuǎn)基因菊苣在干旱脅迫下的生理應(yīng)答差異

Usp基因在植物中普遍存在，其表達(dá)受多種逆境如干旱、高溫、澇害等條件調(diào)控，被認(rèn)為與植物脅迫反應(yīng)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)USP 基因表達(dá)受多種逆境條件誘導(dǎo)，如Sauter 等［17］發(fā)現(xiàn)水稻OsUSP1受乙烯與澇害的誘導(dǎo)表達(dá)；小麥脅迫相關(guān)基因W1受干旱、低溫的誘導(dǎo)［18］；黃姍等［8］發(fā)現(xiàn)大豆在鹽、ABA、干旱脅迫下大豆Usp1被誘導(dǎo)表達(dá)量上調(diào)。本研究進(jìn)行實時熒光定量PCR 表達(dá)分析顯示，高羊茅FaUSP受干旱、高溫、氮脅迫及鹽脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，表明該基因與抗性相關(guān)。關(guān)于高羊茅FaUSP的分子作用機制，進(jìn)一步構(gòu)建過表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入菊苣進(jìn)行功能驗證研究。

在對植物構(gòu)成威脅的環(huán)境因素中，干旱是最常見的非生物脅迫之一，它對植物生長發(fā)育的影響比其他環(huán)境因素更為嚴(yán)重［19-20］。為了減少干旱的危害，植物已經(jīng)進(jìn)化出了幾種方式應(yīng)對，包括提高植物自身耐受性、抵御干旱的傷害與適應(yīng)干旱的能力，這些適應(yīng)性可以通過調(diào)控一系列不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因加以實現(xiàn)［21-23］。逆境脅迫蛋白基因USP 在干旱脅迫下被誘導(dǎo)并發(fā)揮積極作用，提高了植物的抗逆能力。Loukehaich 等［24］發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)的SpUsp明顯提高了番茄抗旱性。生理生化指標(biāo)的測定結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因SpUsp煙草可以保護細(xì)胞免受氧化損傷［25］。這與本研究結(jié)果一致，干旱脅迫下過量表達(dá)FaUSP菊苣可溶性蛋白、GR、SOD、POD、CAT 的合成顯著高于對照組，說明FaUSP能夠提高植物的抗旱能力。

4 結(jié)論

從高羊茅中克隆得到逆境脅迫蛋白FaUSP，含501 bp 的開放閱讀框，共編碼166 個氨基酸，該基因編碼的蛋白屬于USP 家族。其受干旱、高溫、氮脅迫及鹽脅迫的誘導(dǎo)。干旱脅迫下菊苣中過表達(dá)FaUSP可以顯著提高抗旱能力。